王 煜,高月異,高金源,劉偉潔,徐慧琳,薛青紅*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100089;2.青島易邦生物工程有限公司,青島 266041)

小反芻獸疫(peste des petits ruminants, PPR)是由小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)引起山羊、綿羊等小反芻獸的一種急性、熱性、接觸性傳染病[1],是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)法定報(bào)告的動(dòng)物傳染病,我國規(guī)定為Ⅰ類動(dòng)物疫病[2]。PPRV是單股負(fù)鏈不分節(jié)段的有囊膜RNA病毒,絕大多數(shù)PPRV的核苷酸總數(shù)為15 948 nt[3],病毒基因組從3′至5′依次分布著N-P-M-F-H-L 6個(gè)基因,共編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白,即核衣殼蛋白(nucleoprotein, N)、磷蛋白(phosphoprotein, P)、基質(zhì)蛋白(matrixprotein, M)、融合蛋白(fusion protein, F)、血凝素蛋白(hemagglutinin protein, H)、大蛋白(large protein, L),此外PPRV P基因有兩個(gè)重疊的開放性閱讀框,可編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白P和非結(jié)構(gòu)蛋白C、V[4-6],病毒最小感染單位是核衣殼包裹纏繞的病毒基因(RNP)復(fù)合物。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)推測(cè),全球約有62.5%的小反芻動(dòng)物受到小反芻獸疫的威脅,特別是非洲、亞洲和中東地區(qū)[7-8]。2007年7月我國西藏地區(qū)首次發(fā)生疫情,2013年11月我國新疆地區(qū)再次發(fā)生,隨后疫情遍布全國大多數(shù)省份[9-12]。據(jù)FAO推測(cè),全球每年因PPR導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)約30億美元,目前主要采用疫苗免疫接種對(duì)PPR進(jìn)行預(yù)防,2015年OIE、FAO聯(lián)合啟動(dòng)了《全球小反芻獸疫控制與根除策略》,提出了到2030年在全球消滅PPR的目標(biāo)[13-15]。

作為影響?zhàn)B羊業(yè)的重要病原,研究其致病機(jī)制為臨床疫情的控制提供依據(jù)顯得尤為重要,而反向遺傳操作技術(shù)是研究PPRV基因組結(jié)構(gòu)與功能、分子致病機(jī)制以及PPRV與宿主相互作用的一個(gè)重要工具。因此,本研究旨在構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)室保存的PPRV Clone9株感染性克隆,以期為深入研究該毒株的基因組結(jié)構(gòu)與功能、分子致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、毒株來源

Vero細(xì)胞由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。BHK-T7細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉維全教授惠贈(zèng)。

PPRV Clone9 株:由 Nigeria 75/1 株(GenBank 登錄號(hào):X74443)經(jīng) Vero 細(xì)胞傳代噬斑純化挑取單克隆獲得,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。

1.2 主要試劑

DNA/RNA提取試劑盒、載體pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、Trans 2K DNA Plus Marker、Trans15K DNA Marker均購于全式金生物技術(shù)有限公司;Premix TaqTM、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR? HS DNA Polymerase、PrimeSTAR? HS DNA Polymerase with GC Buffer均購自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒Wizard@Plus Midipreps DNA Purification System、瓊脂糖凝膠快速回收試劑盒Wizard? SV Gel and PCR Clean-UP System、轉(zhuǎn)染試劑 FuGENE? 6 Transfection Reagent均購于Promega公司;所有限制性內(nèi)切酶、高保真DNA組裝預(yù)混液 NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix 購自NEB公司;其他試劑或化學(xué)藥品均購自Invitrogen或Sigma公司;異硫氰酸熒光素(FITC)-羊抗小鼠IgG購自中杉金橋生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPRV Clone9株基因組分段擴(kuò)增 基于PPRV Clone9株的全基因組序列,將其基因組分為6個(gè)片段,分別設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物(表1)。取200 μL PPRV Clone9株F2代病毒液,用DNA/RNA提取試劑盒提取病毒RNA,將提取的病毒基因組RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,生成PPRV-cDNA,然后用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]。

表1 PPRV Clone9株分段克隆引物Table 1 PPRV Clone9 strain segmented cloning primer

1.3.2 全長cDNA克隆構(gòu)建策略 在低拷貝質(zhì)粒pBluScript II SK(+)中插入T7啟動(dòng)子、終止子和丁肝核酶序列,將PPRV Clone9株全長分為6個(gè)片段,利用PCR技術(shù),在擴(kuò)增片段FL1的上游引物中引入T7啟動(dòng)子序列及與載體酶切位點(diǎn)BssHII左側(cè)同源的15 bp堿基序列,在擴(kuò)增片段FL2的下游引入與載體酶切位點(diǎn)SnaBI,在FL5片段的3′末端引入丁肝核酶序列及T7終止子。利用PCR方法將PPRV Clone9株基因組8 424位核苷酸G突變?yōu)門引入一個(gè)點(diǎn)突變,作為拯救病毒的遺傳標(biāo)記。RT-PCR擴(kuò)增各片段后分別連接至pEASY-Blunt Zero Cloning Kit,構(gòu)建中間質(zhì)粒,測(cè)序無誤后通過同源重組分兩步連入全長質(zhì)粒載體PB-BSM,構(gòu)建全長cDNA質(zhì)粒。

利用同源重組技術(shù),將病毒基因組全長cDNA各中長片段(FL1-FL5)分兩步連入載體pBluScript II SK(+),具體如圖1所示。

圖1 pB-PPRV構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic representation of pB-PPRV

1.3.2.1 載體pB-PPRV-1 (1-7061)的構(gòu)建:用內(nèi)切酶BssHII,SnaBI對(duì)載體pBluScript II SK(+)進(jìn)行雙切,使載體線性化。利用同源重組酶將片段FL1、FL2、連入雙酶切載體pBluScript II SK(+),連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliHST08感受態(tài),37 ℃過夜培養(yǎng)后挑選菌落進(jìn)行PCR鑒定,將菌落PCR鑒定為陽性的克隆,送公司測(cè)序。

1.3.2.2 載體pB-PPRV的構(gòu)建:用內(nèi)切酶SnaBI,MIuI對(duì)載體pB-PPRV-1進(jìn)行雙酶切,使載體線性化,PCR 擴(kuò)增片段FL3、FL4、FL5-1、 FL5-2利用同源重組酶將各片段連入雙酶切載體pB-PPRV-1,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliHST08 感受態(tài),37 ℃過夜培養(yǎng)后挑選菌落進(jìn)行PCR鑒定,將菌落PCR鑒定為陽性的克隆,送北京六合華大科技股份有限公司測(cè)序。形成載體pB-PPRV。最后對(duì)構(gòu)建好的陽性克隆進(jìn)行全基因組測(cè)序以確保序列的準(zhǔn)確性。

1.3.3 PPRV Clone9株各輔助質(zhì)粒的構(gòu)建 副黏病毒科各病毒反向遺傳學(xué)操作平臺(tái)的建立,除了病毒基因組全長cDNA,還需要提供N、P、L 3個(gè)功能蛋白(圖2)。蛋白N、P、L基因的克隆由構(gòu)建成功的含病毒基因組全長cDNA的質(zhì)粒pB-PPRV為模板設(shè)計(jì)相應(yīng)引物擴(kuò)增而來,擴(kuò)增引物見表2。

圖2 蛋白N、P、L表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.2 Schematic representation of plasmids for expressing proteins N,P,L

表2 N、P、L基因擴(kuò)增引物Table 2 Primers used in cloning of genes of N, P, L

利用同源重組技術(shù),蛋白N、P、L基因由SacII和MIuI雙酶切連入載體PEMC,分別命名為PEMC-PPRV-N、PEMC-PPRV-P、PEMC-PPRV-L。

1.3.4 病毒拯救及鑒定 將病毒基因組全長cDNA克隆載體pB-PPRV和功能蛋白載體PEMC-PPRV-N、PEMC-PPRV-P、PEMC-PPRV-L共轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的BHK-T7細(xì)胞(表3)。轉(zhuǎn)染2 d后,將每個(gè)六孔板的細(xì)胞轉(zhuǎn)入2個(gè)25 cm細(xì)胞瓶繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)到第4天將細(xì)胞瓶凍融,凍融物作為拯救病毒F1代,按10%體積比接入Vero細(xì)胞,進(jìn)行拯救病毒的傳代。用間接免疫熒光、Western blot、RT-PCR和序列測(cè)定對(duì)拯救病毒F3代進(jìn)行鑒定[15]。

表3 轉(zhuǎn)染液的配制Table 3 Components and amounts of transfection medium

1.3.5 體外增殖動(dòng)態(tài) 親本毒和拯救的病毒以MOI=0.01劑量接種生長于96孔板中的單層Vero細(xì)胞,感染后不同時(shí)間點(diǎn)(12、24、36、48、60、72、84、96 h)收取病毒液,并計(jì)算相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)病毒滴度,繪制病毒生長曲線。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性鑒定 為評(píng)價(jià)拯救病毒的遺傳穩(wěn)定性,取拯救病毒F0代于Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代10次,收獲F3、F5、F10代病毒細(xì)胞培養(yǎng)物,分別進(jìn)行遺傳標(biāo)記鑒定、Western blot的鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 PPRV Clone9株基因組中長片段的擴(kuò)增及全長和輔助質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

通過PCR對(duì)PPRV-cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),擴(kuò)增出的片段大小與預(yù)期相符(圖3A)。全長質(zhì)粒pB-PPRV經(jīng)酶切后,應(yīng)出現(xiàn)兩條帶,大小分別為5 321和13 689 bp。酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析,出現(xiàn)結(jié)果與預(yù)期一致,表明全長質(zhì)粒pB-PPRV構(gòu)建成功(圖3B)。構(gòu)建成功的輔助質(zhì)粒pEMC-PPRV-N、pEMC-PPRV-P、pEMC-PPRV-L,經(jīng)酶切后,酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析,出現(xiàn)結(jié)果與預(yù)期一致,表明各重組質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖3C)。

2.2 拯救病毒的鑒定

將感染拯救病毒F3代的細(xì)胞用抗PPRV-N的特異性單抗進(jìn)行間接免疫熒光染色。結(jié)果表明,拯救病毒感染細(xì)胞呈現(xiàn)特異性熒光染色(圖4A);將親本毒PPRV Clone9株及拯救病毒F3裂解物進(jìn)行Western blot試驗(yàn),用抗PPRV-N的特異性單抗可檢測(cè)到目的蛋白條帶 (圖4B);將F3代拯救病毒培養(yǎng)上清進(jìn)行RT-PCR及測(cè)序鑒定,確定了遺傳標(biāo)記的存在(圖4C);拯救病毒體外增殖特性鑒定結(jié)果表明,拯救病毒表現(xiàn)出與親本毒相似的生長特性,且最高生長滴度均可接近106TCID50·mL-1(圖4D)。

A．間接免疫熒光鑒定拯救病毒rPPRV Clone9:a.Vero 細(xì)胞; b.感染PPRV Clone9的Vero細(xì)胞; c.感染rPPRV Clone9的Vero細(xì)胞;B．Western blot鑒定拯救病毒;C．拯救病毒遺傳標(biāo)記的序列測(cè)定,箭頭所指為突變位點(diǎn);D．拯救病毒感染Vero 細(xì)胞的生長動(dòng)力學(xué)曲線A．Indirect immunofluorescence analysis of rPPRV Clone9: a. Vero cells; b. Vero cells infected by PPRV Clone9; c. Vero cells infected by rPPRV Clone9; B．Western blot analysis of rescued virus; C．Sequence determination of rescue virus genetic markers. Arrows indicate the change site;D．Rescue the growth kinetics curve of virus-infected Vero cells圖4 拯救病毒的鑒定Fig.4 Rescue virus identification

2.3 拯救病毒傳代穩(wěn)定性鑒定

經(jīng)基因測(cè)序和Western blot結(jié)果表明,遺傳標(biāo)記能穩(wěn)定地存在于拯救病毒基因組中(圖5A);各代次病毒穩(wěn)定表達(dá)N蛋白(圖5B)。

A．不同代次拯救病毒遺傳標(biāo)記鑒定;B．Western blot鑒定不同代次拯救病毒A．Identification of genetic markers for rescue viruses of different generations;B．Western blot identifies rescue viruses of different generations圖5 拯救病毒傳代穩(wěn)定性鑒定Fig.5 Rescue virus passage stability identification

3 討 論

就目前麻疹病毒屬各病毒而言,反向遺傳學(xué)的研究相對(duì)不平衡。麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、犬瘟熱病毒(CDV)的研究較多[16-19],其操作系統(tǒng)也相對(duì)比較完善。PPRV雖有反向遺傳系統(tǒng)的報(bào)道,但應(yīng)用到實(shí)際并不多。對(duì)于PPRV而言,基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱,建立科學(xué)、有效的反向遺傳系統(tǒng)勢(shì)在必行[20]。

目前,已有報(bào)道成功拯救PPRV感染性克隆的方法共有3種,分別如下:胡倩倩[21]利用細(xì)胞中的RNA聚合酶II在CMV啟動(dòng)子下,轉(zhuǎn)染Vero Dog SLAMtag(VDS)細(xì)胞后拯救PPRV,通過CPE病變,間接免疫熒光以及PCR等方法鑒定成功獲得了感染性病毒,該體系雖然采用高效的CMV轉(zhuǎn)錄系統(tǒng),但拯救效率依然很低,每106個(gè)細(xì)胞只能產(chǎn)生約1～10個(gè)病毒粒子,這主要是因?yàn)镻PRV在感染細(xì)胞后,病毒粒子在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行組裝和復(fù)制,而RNA聚合酶II存在于細(xì)胞核內(nèi),利用細(xì)胞中的RNA聚合酶II拯救病毒時(shí),當(dāng)RNA聚合酶II在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼病毒基因組時(shí),核膜阻礙轉(zhuǎn)錄物輸出至細(xì)胞質(zhì),從而可能影響病毒拯救效率[22]。

Muniraju等[23]采用T7 RNA聚合酶的體系,將病毒基因組全長質(zhì)粒和3個(gè)輔助質(zhì)粒(N、P、L)附加可以表達(dá)T7 RNA聚合酶的質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染VDS細(xì)胞后,進(jìn)行病毒拯救。該體系采用五質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)行病毒拯救,有研究表明,副黏病毒拯救過程中,共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒越多,病毒拯救效率越低[24-25]。

體外拯救負(fù)鏈RNA病毒時(shí),在MV[10]、新城疫病毒(NDV)[26]、水泡性口炎病毒(VSV)[27]等病毒的拯救中,采用T7 RNA聚合酶體系,需要使用表達(dá)T7 RNA聚合酶的痘病毒作為輔助病毒,MV等病毒復(fù)制速度快,可在輔助病毒對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害之前已完成包裝、復(fù)制和釋放;而PPRV需要更長的復(fù)制和釋放時(shí)間,所以痘病毒-T7系統(tǒng)不適于PPRV拯救。穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的工程化細(xì)胞避免了痘病毒對(duì)宿主細(xì)胞的破壞,影響復(fù)制較慢的病毒拯救。Liu等[28]同樣采取T7 RNA聚合酶體系的四質(zhì)粒系統(tǒng),轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞進(jìn)行PPRV的拯救。

與此同時(shí),國內(nèi)研究學(xué)者翟軍軍[29]、劉振東[30]和李菊[31]也紛紛構(gòu)建了PPRV全長基因組的克隆以及拯救病毒必要的輔助質(zhì)粒,但一直未能拯救成功。

參考報(bào)道成功拯救出PPRV的體系,以及借鑒麻疹病毒屬其他已成功拯救出的病毒體系,本研究將病毒基因組全長質(zhì)粒和3個(gè)輔助質(zhì)粒(N、P、L)共轉(zhuǎn)染穩(wěn)定高效表達(dá)T7 RNA聚合酶的BHK細(xì)胞,這樣既避免了引入痘病毒對(duì)宿主細(xì)胞的破壞,同時(shí)四質(zhì)粒轉(zhuǎn)染提高了病毒拯救效率。

4 結(jié) 論

本研究使用穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的BHK細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救,建立了PPRV Clone9株的反向遺傳系統(tǒng)。利用反向遺傳系統(tǒng)獲得的PPRV Clone9株可用于基礎(chǔ)理論的研究和新型疫苗的研發(fā)。此外對(duì)同種屬其他副黏病毒進(jìn)行類似基因操作提供技術(shù)參考。