劉露 劉占奎 吳雪 鮑婷琦

(齊齊哈爾市第一醫(yī)院藥學(xué)部,黑龍江 齊齊哈爾 161005)

肝硬化是指由于長(zhǎng)期損害導(dǎo)致肝臟無(wú)法正常運(yùn)作,進(jìn)而引起肝組織瘢痕形成,是一種以晚期纖維化、再生結(jié)節(jié)形成和血管重塑為特征的彌散過(guò)程,其發(fā)生在肝損傷的其他階段之后,也被稱(chēng)為肝病終末期〔1,2〕。肝移植是治療終末期肝硬化最有效的方法,但供體短缺、并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)仍然是當(dāng)前存在的問(wèn)題〔3〕。因此,迫切需要新的治療方法來(lái)替代肝移植。晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)是通過(guò)糖分子和蛋白質(zhì)結(jié)合的非酶促反應(yīng)形成的,并且通常在健康個(gè)體中的存在程度較低〔4〕。AGEs可通過(guò)與其細(xì)胞表面受體-糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)相互作用,激活下游信號(hào)級(jí)聯(lián)〔5〕。有研究發(fā)現(xiàn),AGE-RAGE相互作用能夠?qū)е赂闻K脂肪堆積,從而引起炎癥、纖維化及脂肪肝疾病等其他并發(fā)癥〔6〕。狼毒大戟具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等多種活性〔7〕。目前已有研究發(fā)現(xiàn),狼毒大戟配伍大棗能夠有效減輕肝硬化大鼠的增生程度〔8〕。但其具體的分子作用機(jī)制還不了解。本研究旨在探討狼毒大戟是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)AGE-RAGE信號(hào)通路來(lái)減輕肝硬化大鼠的炎癥反應(yīng)和纖維化程度。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠60只,體質(zhì)量為180～210 g,購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004。

1.1.2主要試劑 狼毒大戟(HPLC≥98%,上海雅吉生物科技有限公司);復(fù)方鱉甲軟肝片(內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z19991011);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):SH-1271、SH-1273,北京凱詩(shī)源生物科技有限公司);透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、層黏蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):XY-SJH-3630、XY-SJH-3407、XY-SJH-3874、XY-SJH-3686,上海烜雅生物科技有限公司);腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-8試劑盒(貨號(hào):SBJ-R0040、SBJ-R0755、SBJ-R0033,南京森貝伽生物科技有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號(hào):YT8991,北京伊塔生物科技有限公司);AGE、RAGE一抗(貨號(hào):ab23722、ab216329,英國(guó)abcam公司);山羊抗兔IgG二抗(貨號(hào):FNab09778,武漢菲恩生物科技有限公司)。

1.2大鼠模型建立 將大鼠先進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w,然后隨機(jī)分為兩組,第一組作為對(duì)照組(n=15)用正常飼料飼養(yǎng),第二組(n=45)參照文獻(xiàn)〔9〕方法建立肝硬化大鼠模型,通過(guò)腹腔注射5 ml/kg的40%四氯化碳(CCl4,稀釋于橄欖油中)誘導(dǎo)肝硬化,每周注射2次,持續(xù)8 w。

1.3大鼠分組及給藥 將建立模型的第二組大鼠分為模型組、陽(yáng)性組、狼毒大戟組,每組15只。陽(yáng)性組大鼠以0.8 g/kg的劑量灌胃給藥復(fù)方鱉甲軟肝片〔10〕,狼毒大戟組灌胃給予30 mg/kg的狼毒大戟提取物〔8〕,對(duì)照組和模型組均灌胃給予等體積生理鹽水。每周2次,共持續(xù)4 w。

1.4檢測(cè)大鼠血清肝功能酶-ALT、AST和肝纖維化四項(xiàng)-HA、CⅣ、LN和PCⅢ的含量 將所有大鼠使用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉,然后腹主動(dòng)脈采血,3 000 r/min離心15 min,收集上清并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩７謩e利用試劑盒檢測(cè)肝功能酶和肝纖維4項(xiàng)中各項(xiàng)指標(biāo)的含量。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8的含量 取1.2中凍存的血清置于冰上溶解,先分別利用ELISA試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),然后根據(jù)操作步驟處理待測(cè)樣品,并用酶標(biāo)儀檢測(cè)待測(cè)樣品在450 nm處的吸光值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算TNF-α、IL-6、IL-8的含量。

1.6HE染色觀察大鼠肝組織病理學(xué)形態(tài) 將所有大鼠麻醉后處死,取肝組織凍存于-80 ℃。然后在每組中隨機(jī)取5只大鼠的肝組織于4%多聚甲醛中固定過(guò)夜,并進(jìn)行石蠟包埋和切片。然后將切片在梯度乙醇中脫水,用二甲苯清潔,并用蒸餾水洗滌。隨后,切片用蘇木素染色4 min,再用伊紅溶液染色2 min。然后,將切片分別用梯度乙醇和二甲苯脫水透明,最后用中性膠封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.7RT-qPCR檢測(cè)肝組織中α-SMA和ColⅠ mRNA的表達(dá) 從1.5中凍存的肝組織中每組隨機(jī)選取5個(gè),提取總RNA,然后根據(jù)一步法熒光定量試劑盒配制總反應(yīng)體系25 L,反應(yīng)程序:50 ℃逆轉(zhuǎn)錄3 min;95 ℃預(yù)變性30 s;2步法:95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán),熔解曲線(xiàn)95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下:α-SMA:上游 5′-CAATGGCTCCGGGCTCTGTA-3′,下游 5′-CTCTTGCTCTGCGCTTCGTC-3′;ColⅠ:上游 5′-CCTTTCTCCACCCCCTCTT-3′,下游 5′-TGTGTCTT TGGGGGAGACTT-3′;GAPDH:上游 5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′,下游 5′-AAGTGGTCGTTGAG-GGCAATG-3′。

1.8Western印跡檢測(cè)肝組織中AGE、RAGE蛋白的表達(dá) 取1.5中剩余的肝組織加入蛋白裂解液提取總蛋白,并利用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。然后用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。再將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中常溫孵育2 h,然后與一抗稀釋液(AGE、RAGE稀釋比例1∶1 000)在4 ℃孵育過(guò)夜,接著與山羊抗兔IgG二抗稀釋液(1∶1 000)在室溫下孵育1 h。最后加入顯影劑顯色。以GAPDH為內(nèi)參,分別用蛋白凝膠成像系統(tǒng)和ImageJ軟件觀察蛋白條帶并分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1狼毒大戟對(duì)肝硬化大鼠血清中肝功能指標(biāo)的影響 與對(duì)照組相比,模型組、陽(yáng)性組、狼毒大戟組血清中肝功能指標(biāo)ALT、AST含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性組和狼毒大戟組血清中肝功能指標(biāo)ALT、AST含量明顯降低(P<0.05),且狼毒大戟組與陽(yáng)性組無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組血清中肝功能指標(biāo)、肝纖維化4項(xiàng)水平比較

2.2狼毒大戟對(duì)肝硬化大鼠血清中肝纖維化4項(xiàng)指標(biāo)的影響 與對(duì)照組相比,模型組、陽(yáng)性組、狼毒大戟組血清中肝纖維化4項(xiàng)指標(biāo)HA、CⅣ、LN和PCⅢ含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性組和狼毒大戟組血清中肝纖維化4項(xiàng)指標(biāo)HA、CⅣ、LN和PCⅢ含量明顯降低(P<0.05),且狼毒大戟組與陽(yáng)性組無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)表1。

2.3狼毒大戟對(duì)肝硬化大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量的影響 與對(duì)照組相比,模型組中、陽(yáng)性組、狼毒大戟組血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性組和狼毒大戟組血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量明顯降低(P<0.05),且狼毒大戟組與陽(yáng)性組無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量及肝組織中α-SMA、ColⅠ mRNA、AGE、RAGE蛋白水平比較

2.4狼毒大戟對(duì)肝硬化大鼠肝組織中α-SMA和ColⅠ mRNA水平的影響 與對(duì)照組相比,模型組、陽(yáng)性組、狼毒大戟組肝組織中α-SMA和ColⅠ mRNA水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性組和狼毒大戟組肝組織中α-SMA和ColⅠ mRNA明顯降低(P<0.05),且狼毒大戟組與陽(yáng)性組無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)表2。

2.5狼毒大戟對(duì)肝硬化大鼠肝組織中AGE、RAGE蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比,模型組、陽(yáng)性組、狼毒大戟組肝組織中AGE、RAGE蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性組和狼毒大戟組肝組織中AGE、RAGE蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),且狼毒大戟組與陽(yáng)性組無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)表2、圖1。

1～4:對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性組、狼毒大戟組圖1 各組肝組織中AGE、RAGE蛋白表達(dá)

2.6狼毒大戟對(duì)肝硬化大鼠肝組織的影響 與對(duì)照組相比,模型組肝組織中細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞出現(xiàn)腫脹,纖維組織增生,肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞;與模型組相比,陽(yáng)性組和狼毒大戟組肝組織中細(xì)胞整體排列有序,纖維化程度減輕,細(xì)胞腫脹和纖維增生明顯減少,見(jiàn)圖2。

圖2 各組肝組織的病理形態(tài)(HE染色,×400)

3 討 論

肝硬化是與肝細(xì)胞損傷和炎癥相關(guān)的慢性肝病末期。在組織學(xué)上,肝硬化的特征是彌漫性結(jié)節(jié)狀再生,周?chē)h(huán)繞著纖維化隔膜〔11〕。在肝硬化發(fā)展中,雖然肝移植是一個(gè)可行的治療選擇,但其存在缺乏供體器官、免疫排斥和術(shù)后并發(fā)癥等多種限制,且尚無(wú)治療肝硬化的有效藥物用于臨床。因此,迫切需要一種不同類(lèi)型的治療方法〔12,13〕。狼毒大戟首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其以根入藥,味辛、性平、有毒,其主要包括二萜類(lèi)、三萜類(lèi)、香豆素類(lèi)、酚酸類(lèi)、淄醇類(lèi)等多種活性成分,具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤及抗癲癇等多種藥理作用〔14〕。本研究結(jié)果表明,狼毒大戟通過(guò)抑制肝功能酶的含量減輕肝功能損傷。已知肝硬化也是肝纖維化和肝臟炎癥導(dǎo)致的終末期肝病,其中肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化的關(guān)鍵步驟,因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致α-SMA和ColⅠ的積累〔15〕。炎癥作為慢性肝病的主要特征,可以發(fā)生在纖維化過(guò)程的任何階段,并引起TNF-α、IL-6、IL-8等促炎因子的分泌〔16〕。本研究結(jié)果揭示,狼毒大戟可以抑制肝硬化大鼠的炎癥反應(yīng)和纖維化程度,并且減輕肝組織病理性損傷;但其作用機(jī)制還尚未了解。

已知AGEs是由葡萄糖或其他糖類(lèi)對(duì)包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸在內(nèi)的大分子進(jìn)行翻譯后非酶修飾而產(chǎn)生的異質(zhì)分子。AGE是有害分子,在生理衰老和年齡相關(guān)疾病、糖尿病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性硬化癥等疾病中增加〔17〕。RAGE是AGE的細(xì)胞結(jié)合受體,兩者相互作用可以激活NADPH氧化酶和核因子(NF)-κB,從而導(dǎo)致各種炎癥基因的轉(zhuǎn)錄激活〔18,19〕。有研究AGEs通過(guò)自噬誘導(dǎo)和肝星狀細(xì)胞激活在慢性丙型肝炎患者的纖維化或肝硬化中發(fā)揮作用,阻斷AGE-RAGE信號(hào)可能是緩解纖維化的一種有前途的方法〔20〕。本研究推測(cè)狼毒大戟對(duì)肝硬化大鼠炎癥和纖維化的減輕作用可能是通過(guò)抑制AGE-RAGE信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的,且與陽(yáng)性藥物的效果無(wú)顯著差異。

綜上,狼毒大戟可以通過(guò)抑制AGE-RAGE信號(hào)通路來(lái)減輕肝硬化大鼠的炎癥反應(yīng)和纖維化程度。本研究為治療肝硬化提供了新的藥物及研究思路。但肝硬化是大多數(shù)肝病末期,其治療較為困難,因此,狼毒大戟對(duì)肝硬化的臨床應(yīng)用還有待進(jìn)一步深入研究。