馮立玲，胥文玲，羅軍昆，王清華，白曉玲

蒙牛乳業(yè)（灤南）有限責任公司，河北唐山 063500

0 引言

超高溫滅菌乳的保質期時間較長，在儲存過程會存在多種質量缺陷，如脂肪上浮、結塊、酸包、脹包等問題。其中脂肪上浮現(xiàn)象一直是影響長貨架期超高溫滅菌乳等乳制品質量的首要問題。不同程度的脂肪上浮現(xiàn)象均影響產(chǎn)品的外觀及品質，嚴重時在包裝頂部可形成幾毫米厚的脂肪層，給消費者食用時帶來不愉悅的感受和體驗。降低或減少脂肪上浮現(xiàn)象，成為乳品企業(yè)改善產(chǎn)品品質的重要環(huán)節(jié)。

牛奶中的脂肪以小液滴形式存在，稱為乳脂肪球[1]。牛奶中的脂肪球由于粒度大小不等、密度小、質量輕而浮在牛奶表面形成一層奶油層，使牛奶產(chǎn)生分層現(xiàn)象[2]，因此需要進行均質化處理。均質化處理給牛奶帶來許多優(yōu)點，如脂肪球變小，不形成奶油層；顏色更白、口感更佳；降低脂肪氧化敏感性，具有更強穩(wěn)定性和更長保質期[3～5]，成為了現(xiàn)代乳制品生產(chǎn)中不可或缺的工藝[6]。

為監(jiān)控均質化效果，對均質化過程中牛奶脂肪球粒度的測定十分必要。激光粒度法作為一種快速、準確的粒度測試方法已被應用，但激光粒度分析儀較貴，檢測成本較高，一般乳品企業(yè)無法承擔[7]。為促進生產(chǎn)過程均質效果改善，同時提升產(chǎn)品穩(wěn)定性，需研發(fā)一種低成本、高效率、快速檢測脂肪球粒徑大小的方法。本文通過試驗論述脂肪球粒徑檢測方法的研發(fā)過程，對比不同染色劑染色脂肪球的現(xiàn)象差異，從而確定出最優(yōu)方案。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

蘇丹Ⅲ，福晨（天津）化學試劑有限公司；甲基紅、次甲基藍、鉻黑T、溴甲酚綠、甲基橙、95%濃度乙醇、草酸銨，福晨（天津）化學試劑有限公司；結晶紫、番紅，北京陸橋技術股份有限公司。

ME2002E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RX50顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；玻璃燒杯；載玻片；蓋玻片；滴管；鑷子。

1.2 染色劑選擇

蘇丹Ⅲ是一種常用的脂肪類染液，遇脂肪會變?yōu)殚冱S色。甲基橙是分析化學中常用酸堿指示劑，在中性介質中以磺酸鈉鹽形式存在而呈現(xiàn)黃色，超高溫滅菌乳通常為中性樣品，可制備甲基橙指示劑用于該試驗。另外，甲基紅指示劑、次甲基藍指示劑、鉻黑T指示劑、溴甲酚綠指示劑、結晶紫指示劑、番紅指示劑均為實驗室日常檢測常用指示劑，本文引入這些指示劑用來進行試驗，對比染色效果。

1.3 試劑配制

蘇丹Ⅲ指示劑：稱取0.25 g蘇丹Ⅲ粉末于錐形瓶中，加入95%濃度酒精50 mL，充分攪拌混合均勻，過濾后備用。

甲基紅指示劑：稱取0.1 g甲基紅，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

次甲基藍指示劑：稱取0.1 g亞甲基藍，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

鉻黑T指示劑：稱取0.5 g鉻黑T，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

溴甲酚綠指示劑：稱取0.1 g溴甲酚綠，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

甲基橙指示劑：稱取0.1 g甲基橙，溶于70 ℃水中，冷卻，稀釋至100 mL。

結晶紫指示劑：稱取0.1 g甲基紅，用20 mL 95%乙醇溶解；稱取草酸銨0.8 g，用80 mL實驗用水溶解；使用前將上述兩種溶液混合過濾后備用。

番紅指示劑：稱取2.5 g甲基紅，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。使用前取10 mL已配制的溶液，加入90 mL實驗用水混勻后備用。

1.4 染色方法

待測樣品與染色劑混勻后直接檢測，無需其他處理。另外，為降低試驗操作過程中使用酒精燈存在的安全風險，減少常規(guī)制片過程使用酒精燈烘干的操作步驟，借鑒生物檢驗花生中的脂肪實驗操作步驟[8]中染色制片方法。除蘇丹Ⅲ染色法外，本文通過使用蓋玻片，驗證液體樣品不烘干也能實現(xiàn)固定的目的。

1.4.1 蘇丹Ⅲ染色法

參考《牛奶脂肪球觀測方法》[9]，具體操作步驟如下。

（1）制片：取若干滴牛奶置于載玻片上，用鑷子固定玻片一端置于酒精燈火焰上方，直至牛奶滴烘干。

（2）染色：在烘干后的牛奶滴上滴加蘇丹Ⅲ指示劑，靜置染色1～2 min，然后用鑷子夾住載玻片一端置于酒精燈火焰上方，直至蘇丹Ⅲ指示劑烘干。

（3）觀察：將載玻片置于顯微鏡下，選取放大倍數(shù)為10 倍的物鏡，在100 倍（10×10）條件下，觀察染色后牛奶滴中的脂肪球。

1.4.2 甲基橙染色法

（1）制片染色：取1 滴已混合均勻的牛奶樣品置于載玻片上，在滴加牛奶樣品的位置滴加1 滴甲基橙指示劑，再將一片蓋玻片用鑷子輕輕覆蓋在上面。

（2）分析觀察：將步驟（1）制備好的樣品置于顯微鏡下，在100 倍（10×10）條件下觀察?？芍苯佑媚跨R，也可用顯微鏡軟件進行觀察。

（3）結果判定 ：將載玻片置于顯微鏡下，選取放大倍數(shù)為10 倍的物鏡，在100 倍（10×10）條件下，觀察染色后牛奶滴中的脂肪球，也可以利用顯微鏡操作軟件，通過軟件參數(shù)設置，更直接、更清晰觀察脂肪球形態(tài)，還可測量脂肪球粒徑大小。

1.4.3 其他染色劑法

將結晶紫、番紅、甲基紅、溴甲酚綠、次甲基藍、鉻黑T指示劑，依據(jù)1.4.2步驟操作。

1.5 結果判定

鏡檢觀察：未經(jīng)均質處理或均質效果差的樣品，脂肪球大小不均勻，外形不規(guī)則，形態(tài)較大。經(jīng)均質處理后的樣品，脂肪球為大小均勻的球形顆粒，形態(tài)較小。

本文試驗要求鏡檢觀察的結果為脂肪球外形清晰可見，粒徑大小可通過測量確定具體數(shù)值。

2 結果與分析

2.1 試驗結果

2.1.1 不同染色劑對比

針對試驗使用的8 種染色劑，在操作便捷性、觀察難易性、染色均勻程度及背景清晰程度等方面進行比較（表1）。甲基橙染色法較其他方法優(yōu)勢更明顯。

表1 不同染色方法操作對比

2.1.2 染色劑與樣品的適宜性

抽取超高溫滅菌乳和調制乳各10 批，分別用8種染色劑進行樣品適宜性驗證（表2）。

表2 不同染色方法樣品適宜性對比

適宜性評價標準：染色劑與樣品充分融合，染色均勻，鏡檢觀察時無背景雜質干擾。

除甲基橙外，其他染色劑與樣品混合的過程中均存在不能充分融合的現(xiàn)象，鏡檢時視野下背景干擾影響觀察效果，故甲基橙染色法較其他方法優(yōu)勢更明顯。

2.1.3 不同染色劑染色圖片

用顯微鏡觀察8 種不同染色劑對同一超高溫滅菌乳進行脂肪球染色，各種染色劑染色效果存在差異，其中甲基橙染色效果最好，背景最清晰，染色后的脂肪球更易觀察；相比而言，其他染色劑染色效果較差，染色后的脂肪球不易觀察（圖1）。

圖1 不同染色劑染色圖片

2.2 分析方法評價

2.2.1 蘇丹Ⅲ染色法

蘇丹Ⅲ染色法為已有參考文獻可查詢的一種脂肪球檢測方法，在試驗中發(fā)現(xiàn)存在4 處缺陷，具體如下。

（1）試劑配制：蘇丹Ⅲ染液配制過程存在溶解不充分現(xiàn)象，需過濾操作，步驟繁瑣。

（2）制片：由于需觀測樣品為液體，具有流動性，依據(jù)染色操作要求，為便于觀察，該方法對液體樣品通過烘干操作進行固定。執(zhí)行該步驟需使用酒精燈，由于牛奶營養(yǎng)物質豐富，經(jīng)烘干操作后，部分有機物由于烘烤溫度過高或時間過長容易糊化，染色后背景雜質較多，導致脂肪球不易觀察，干擾實驗人員操作，因此烘干環(huán)節(jié)需優(yōu)化或取消。另外，酒精燈存在火災風險。

（3）烘干：酒精純度越高，燃燒越充分，燃點越旺盛。該方法使用濃度為95%乙醇配制染色液，染色后烘干操作，載玻片經(jīng)過酒精燈火焰時，極易引起燃燒，危險性較大。

（4）染色：該步驟需靜置后再次使用酒精燈烘干，耗時較長。

2.2.2 甲基橙染色法

該方法操作簡便、快捷高效，具體優(yōu)勢如下。

（1）取1 滴混勻后的樣品即可滿足實驗要求，不需烘干操作，立即滴加染色液，可實現(xiàn)染色均勻目的。

（2）染色后無需靜置，增加蓋玻片使用。蓋玻片的作用：可使被觀察物形成薄膜，易透光，便于觀察；可使標本相對固定；便于利用毛細現(xiàn)象，使染色液形成梯度，脂肪球染色更充分；避免標本受污染。

2.2.3 其他染色劑法

結晶紫、番紅、甲基紅、溴甲酚綠、次甲基藍、鉻黑T指示劑滴加至牛奶樣品后，指示劑和牛奶樣品都不能有效融合，產(chǎn)生肉眼可見顆粒物質，鏡檢時會發(fā)現(xiàn)染色效果差，背景干擾雜質多，影響觀察效果。

3 結論與討論

為降低超高溫滅菌乳貨架期內(nèi)脂肪上浮現(xiàn)象，在牛奶均質化及產(chǎn)品穩(wěn)定性研究過程中，對脂肪球粒徑進行監(jiān)控十分必要。在注重產(chǎn)品質量同時，考慮檢測效率成本等因素，乳品企業(yè)尤其需高效率、低成本、快速檢測脂肪球粒徑的方法。

本文對實驗室日常使用指示劑進行設計，在超高溫滅菌乳中開展脂肪球檢測試驗對比，最終確定甲基橙染色法為最優(yōu)方法。傳統(tǒng)顯微鏡直接觀察方式，只能獲得脂肪球大小的直觀表象，不能了解具體粒徑大小。甲基橙染色法引入顯微鏡操作軟件，通過軟件參數(shù)設置，不但可以更直接更清晰觀察到脂肪球的形態(tài)，還可對脂肪球粒徑大小進行測量。同時，所觀察過的圖片可通過軟件存儲，便于后期查閱。該方法快速高效，檢測成本低，簡便易行，操作更安全，可為均質化過程提供有效監(jiān)控數(shù)據(jù)，能滿足乳品企業(yè)對脂肪球粒徑進行快速檢測目的。