趙慧，馬芹，劉振華，蒲高斌，張芳，李佳，張永清

(山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250300)

種質資源是重要的戰(zhàn)略資源，是衡量綜合國力的指標之一。 我國植物種質資源極為豐富，這不僅是選育優(yōu)良品種的物質基礎，也是生物多樣性不可或缺的組成部分，對生態(tài)文明建設和經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展具有重要支撐作用。 保存利用好植物種質資源意義重大，但因其數(shù)量巨大，對每份植物種質資源都開展保存、評價和利用工作比較困難[1]。 基于植物種質資源調查及遺傳多樣性研究[2，3]，通過建立核心種質資源庫來保存和管理種質資源，已經(jīng)成為該領域研究的熱點[4，5]。 由于核心種質以最少數(shù)量種質最大限度地代表了整個種質資源的遺傳多樣性[6]，因此它很好地解決了上述難題。 目前開展核心種質研究的植物多是糧食作物和經(jīng)濟作物，如水稻[7]、玉米[8]、茄子[9]、番茄[10]、陸地棉[11]等。 而關于藥用植物核心種質的研究則相對滯后[12，13]，但隨著通過生產(chǎn)種植才能滿足需要的藥材種類越來越多，加強其核心種質研究、做好種質保存工作、推進優(yōu)良品種選育，成為藥材生產(chǎn)中保證質量、提高產(chǎn)量需要解決的關鍵技術問題[14]。 因此，本文對已有藥用植物核心種質及其構建研究進行系統(tǒng)歸納總結，旨在為深化藥用植物核心種質研究、推進中藥資源高質量可持續(xù)利用提供參考。

1 核心種質概述

1984 年Frankle[6]首次提出核心種質概念，后來Brown[15]對其進一步完善，認為核心種質是以最少數(shù)量的種質最大程度地保存整個種質資源豐富的遺傳變異。 該概念是相對的，種質數(shù)量和遺傳變異都是相對于所收集到的種質而言；同時它也是動態(tài)變化的，可以通過后續(xù)補充收集新的種質，可對已有的核心種質進行調整。 1999 年，李自超等[16]提出了核心種質動態(tài)四級結構，即保留種質、初級核心種質、核心種質和核心應用種質。其中，保留種質是指篩選出核心種質后剩余的所有種質資源，為核心種質的補充；初級核心種質包含原始種質95%以上的遺傳多樣性，是核心種質的基礎；核心種質包含70%～80%的遺傳多樣性，占原始種質數(shù)量的5%～10%；核心應用種質包含種質數(shù)量更少，是應用所需的優(yōu)異種質，對生產(chǎn)和研究利用更具價值和指導意義。 2008 年，王建成等[17]又提出了合成核心種質、分級核心種質、微型核心種質新概念。 其中，合成核心種質是指由不同國家或地區(qū)通過合作共同構建而成的核心種質；分級核心種質是根據(jù)不同數(shù)據(jù)分層來依次構建的核心種質；微型核心種質是為適應很大數(shù)量規(guī)模的種群而構建的核心種質庫，約占原始種質數(shù)量的1%。 藥用植物核心種質組成相對其它植物具有一定特殊性，不僅要包含主要變異類型、避免遺傳重復，還要包括藥效成分及其調控基因[18]。 藥用植物核心種質代表著該物種的性狀特征、地理分布和遺傳多樣性，具有代表性、異質性、動態(tài)性和有效性[1]。

2 藥用植物核心種質構建

我國藥用植物種質資源數(shù)量龐大[19]，保護、管理工作投入大。 核心種質去除了一定的遺傳冗余，更加關注與質量、產(chǎn)量及農(nóng)藝性狀相關的遺傳變異，依此進行優(yōu)良品種篩選將有助于提高選育效率[20]。 因此，核心種質構建是有效保護利用藥用植物種質資源的關鍵。 構建核心種質的基本步驟有數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)分析、種質篩選、核心種質有效性檢驗等[21]。

2.1 數(shù)據(jù)收集

收集整理種質資源相關數(shù)據(jù)是構建核心種質的首要工作，包括基本數(shù)據(jù)、特征數(shù)據(jù)、評價鑒定數(shù)據(jù)。 基本數(shù)據(jù)包括種質采集地的生態(tài)地理特征、繁殖與培育、分類體系等數(shù)據(jù)；特征數(shù)據(jù)包括表型、分子標記、生理生化等數(shù)據(jù)；評價鑒定數(shù)據(jù)是指質量、產(chǎn)量及抗性等數(shù)據(jù)[16]。 其中，以表型、分子標記數(shù)據(jù)最為常用。 表型數(shù)據(jù)是構建核心種質的傳統(tǒng)數(shù)據(jù)，分為數(shù)量性狀和質量性狀，能直觀地反映物種的遺傳多樣性[22]，可為核心種質構建提供直接依據(jù)[23]。 例如，李秀詩[24]、彭銳[25]等根據(jù)數(shù)量性狀和質量性狀構建的薏苡(Coix lacryma-jobiL.)與青蒿(Artemisia annuaLinn.)的核心種質。

由于植物形態(tài)特征易受環(huán)境影響，不能直接反映種質遺傳多樣性，而分子標記數(shù)據(jù)不受季節(jié)和環(huán)境等因素影響[26]，能在DNA 序列水平上直接反映物種遺傳變異信息和種群間的遺傳關系，因此備受重視[27，28]。 目前常用的分子標記有限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、簡單重復序列(SSR、ISSR)、相關序列擴增多態(tài)性(SRAP)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等[29]。 在構建藥用植物核心種質過程中應用較多的分子標記為SSR 和ISSR，其次是SRAP。 例如Liu[30]、耿雅萍[31]、Sa[32]、林丹[33]等利用SSR 分子標記構建了降香(Dalbergia odoriferaT.Chen)、黃芪[蒙古黃芪(Astragalus mongholicusBunge)和膜莢黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.) Bunge)]、紫蘇(Perilla frutescensL.)等核心種質，林丹[33]、白成科[34，35]、楊孟莉[36]、Li[37]、劉向宇[38]等利用ISSR分子標記構建了白木香[Aquilaria sinensis(Lour.)Spreng.]、黃芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)、山茱萸(Cornus officinalisSieb.et Zucc.)、山藥(Dioscorea oppositaThunb.)等核心種質。

整合利用表型與分子標記數(shù)據(jù)，將宏觀性狀與微觀分子結合構建的核心種質將更具有代表性。 例如，程江波[39]根據(jù)表型性狀和SRAP 分子標記數(shù)據(jù)構建了海巴戟(Morinda citrifoliaLinn.)的核心種質。 另外，藥用植物與一般植物不同，在構建核心種質時，除應考慮種質表型性狀和分子標記數(shù)據(jù)外，還應考慮活性成分含量。 例如，廖丹[40]根據(jù)生物學性狀(包括多糖、維生素、總黃酮和香豆素含量)及ISSR 分子標記構建了海巴戟核心種質；劉曼[41]依據(jù)蛇床子素、二氫歐山芹醇、當歸酸酯含量及SSR 分子標記構建了獨活(Angelica pubescensMaxim.f.biserrataShan et Yuan)核心種質。 又如，李嘉惠[42]在構建何首烏[Fallopia multiflora(Thunb.) Harald.]核心種質、劉秀容[43]在構建黃芩核心種質時均將活性成分含量納入分析數(shù)據(jù)中。

2.2 數(shù)據(jù)分析

收集種質并獲得一定信息數(shù)據(jù)后，需通過數(shù)據(jù)分析才能明確種質遺傳多樣性及其親緣關系，據(jù)此將所有種質分組，并選取代表性樣品構建核心種質[16，44]。 數(shù)據(jù)分析常用方法為主成分分析和聚類分析。 主成分分析多用于大量表型性狀數(shù)據(jù)，目的是篩選出與變異相關的主要性狀。 孫亞強[45]采用主成分分析法對酸棗52 個數(shù)量性狀進行分析后，得到5 個主成分因子，包含果實色光值、單核重、果核橫徑、葉片長、葉片寬等25 個性狀。 聚類分析是目前使用最廣泛的分析方法[46]，可用于分析各種類型數(shù)據(jù)，包括最長距離法(COMPIETE)、最短距離法(SINGLE)、中間距離法(MEDIAN)、類平均法(AVERAGE)、重心法(CENTROID)、非加權配對平均法(UPGMA)和離差平方和法(WARD)等[47]。 構建核心種質時以UPGMA 法應用最多，絕大多數(shù)藥用植物核心種質都是依據(jù)UPGMA 法進行聚類分組，包括白木香[33]、山茱萸[37]、黃芩[34]、山藥[38]、獨活[48]、青蒿[25]、降香[30]、紫蘇[32]、大棗(Ziziphus jujubaMill.var.jujuba)[49]、三葉木通[Akebia trifoliata(Thunb.) Koidz.][50]等。 也有學者采用類平均法進行聚類分析，如海巴戟[39]、酸棗[Ziziphus jujubaMill.var.spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chow][45]等核心種質。 系統(tǒng)發(fā)育樹鄰接法(NJ)和群體結構法(STRUCTURE)也被用于種質分組[31，51]，但使用較少。

聚類分析常用的遺傳距離為歐式距離和馬氏距離。 歐式距離易受性狀間不同量綱影響，馬氏距離與性狀間測量單位無關、不受量綱影響[47]?；诒硇蛿?shù)據(jù)構建核心種質時，可通過數(shù)量性狀標準化來解決不同量綱影響問題[52]。 除上述兩種遺傳距離外，還有SM 系數(shù)、Jaccard 系數(shù)、Nei’s遺傳距離等，它們都能代表原始種質的遺傳多樣性，但以Jaccard 系數(shù)得出的各項參數(shù)值最大，為最佳遺傳距離[35，40]。

2.3 取樣方法和取樣比例

取樣方法、比例對種質篩選效果都有影響。良好的取樣方法不僅能去除原種質遺傳冗余，而且能最大限度地保留其遺傳多樣性[53]，因此選擇最優(yōu)的取樣方法是構建核心種質的重中之重。 取樣方法包括隨機取樣法和系統(tǒng)取樣法。 其中，系統(tǒng)取樣法又包括比例取樣法(P 策略)、平方根比例法(S 策略)、對數(shù)取樣法(L 策略)、遺傳多樣性比例法(G 策略)、等位基因最大化法(M 策略)等；隨機取樣法雖然可得到無偏樣本，但得到的核心種質遺傳結構和多樣性與原始種質往往相差較大[54]，因此很少單獨應用，多結合聚類分析采用逐步聚類隨機取樣法(SCR)。

系統(tǒng)取樣法要根據(jù)方法和材料的特點來選擇[55]。 組內(nèi)取樣方法有優(yōu)先取樣、偏離度取樣、最小距離逐步取樣(LDSS)等。 構建藥用植物核心種質應用最多的首先是最小距離逐步取樣[56]，該法通過逐步聚類刪除遺傳距離接近的冗余樣品，得到的核心種質能很好地保留原始種質的遺傳變異[57]，且不受聚類方法的影響[58]；其次是等位基因最大化法(M 策略)，該法依據(jù)物種多樣性自動生成抽樣比例，廣泛應用的是進階等位基因最大化法，包括拉斯維加斯式隨機算法、啟發(fā)式算法和模擬退火算法，各算法在構建藥用植物核心種質時均有應用[31，50]；優(yōu)先取樣也較常用，是通過逐步聚類優(yōu)先選擇性狀極值[59]或稀有等位基因(位點優(yōu)先取樣)而組成核心種質，也能很好保留原始群體的遺傳多樣性。 李嘉惠[42]提出的STRUCTURE 分類-比例取樣法，是根據(jù)組間遺傳多樣性的比值確定取樣數(shù)量，從而避免了取樣不均，得到的核心種質同樣具有良好代表性，與最小距離逐步聚類法相比操作簡便。 當然，取樣方法間沒有絕對的優(yōu)劣之分，在構建核心種質時應考慮藥用植物遺傳特征等實際情況，對各種取樣方法進行評估以找到最適方法，保證構建出最佳核心種質。

關于取樣比例，Brown[15]提出5%～10%的取樣比例可代表總樣品70%以上的遺傳變異，Yonezawa 等[60]則認為最佳取樣比例為20%～30%，也有學者提出取樣比例應隨原始種質數(shù)量的增加而減小[61]。 藥用植物核心種質的取樣比例絕大部分在10%～30%之間。 構建核心種質時，往往根據(jù)總體種質資源規(guī)模大小和遺傳多樣性、遺傳結構來調整取樣比例[62]。 劉曼[41]在構建獨活核心種質時，因種質數(shù)量多且遺傳多樣性水平高而選擇10%～40%的取樣比例，目的是為保存更完整的遺傳變異。 此外，優(yōu)異特殊種質、性狀極值種質數(shù)量少且利于生產(chǎn)和選出性狀突出的品種，應直接選入核心種質。

2.4 核心種質檢驗及評價

核心種質構建完成后要進行有效性檢驗，明確它們對原始種質遺傳變異的代表性及在生產(chǎn)實踐中的實用性。 對基于表型數(shù)據(jù)構建的核心種質，要以核心種質和原始種質各性狀均值和方差作為評價參數(shù)進行t檢驗或F檢驗，看是否具有顯著性差異，再通過比較均值、變異系數(shù)、方差差異百分率、極差符合率對核心種質進行評價。 Diwan 等[63]指出，核心種質均值和方差與原始種質存在顯著差異的性狀不大于30%，且變異幅度不低于原始群體的70%，就可認為該核心種質對原始種質遺傳變異具有良好代表性。 對基于分子標記數(shù)據(jù)構建的核心種質，要以等位基因數(shù)量(Na)、有效等位基因數(shù)量(Ne)、觀察雜合度(Ho)、Shannon and Weaver’s 信息指數(shù)(I)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)、多態(tài)性信息含量(PIC)作為評價參數(shù)，利用t檢驗確定其差異顯著性，同時計算各參數(shù)保留率來評價核心種質有效性。 耿雅萍[31]在檢驗評價黃芪核心種質時，得到其觀測雜合度的保留率為97.425%，其余各評價參數(shù)保留率均大于100%，表明該核心種質有效保留了原始種質的遺傳多樣性，且由于種質數(shù)量減少而使核心種質整體遺傳變異升高。 良好的核心種質還應去除一定的遺傳冗余:李榮榮[64]利用主成分分析比較核心種質與原始種質各株系相互重疊的分布程度，發(fā)現(xiàn)核心種質遺傳冗余明顯降低，從而驗證了初級核心種質的有效性；此外，還利用主坐標分析對比核心種質與原始種質的遺傳結構幾何分布，驗證了核心種質的代表性和全面性。 目前，實用性檢驗只出現(xiàn)在農(nóng)作物核心種質構建中，藥用植物尚未見報道，該評價指標有待于發(fā)展和補充。

3 藥用植物核心種質構建進展

李秀詩等[24]根據(jù)株高、莖粗、葉長、葉寬、總分蘗數(shù)、主莖分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)、粒長、粒寬、百粒重共10 個數(shù)量性狀和果殼顏色、總苞形狀、總苞光澤、總苞條紋這4 個質量性狀，從248 份薏苡種質中構建了67 份初級核心種質。 彭銳等[25]收集到63 份青蒿種質，并根據(jù)株高、冠幅、分枝數(shù)、地上部鮮重、葉鮮重、葉鮮重占地上部鮮重比率、節(jié)間距和青蒿素含量共8 個數(shù)量性狀，構建了20 份核心種質。

Liu 等[30]利用SSR 分子標記，從42 份野生降香、210 份栽培降香種質中，構建了31 份核心種質。 耿雅萍[31]采用SSR 分子標記，從380 份蒙古黃芪和膜莢黃芪種質中，構建了136 份核心種質。Sa 等[32]利用22 個SSR 分子標記，從韓國400 份紫蘇種質中檢測到173 個等位基因，每個位點的等位基因數(shù)為4 ～15(平均值＝7.9)，共篩選出44份核心種質，占整個紫蘇種質的11.0%。 林丹等[33]利用ISSR 分子標記，對232 份白木香種質進行核心種質初建，最終獲得82 份核心種質，保留原始種質97%以上的遺傳多樣性。 白成科等[34]以4 個主產(chǎn)區(qū)的40 份黃芩種質為研究對象，采用改良的CTAB 法提取基因組，利用篩選出的15 條ISSR 引物進行分子標記，共獲得248 條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶241 條，多態(tài)性百分率97.17%，表明收集的黃芩種質資源在分子水平上有較高的遺傳多樣性，構建的12 份核心種質既能代表原有群體的遺傳變異，又有廣泛的地域代表性。 楊孟莉[36]以11 個省(市)129 份山茱萸種質為研究對象，利用ISSR 分子標記研究其遺傳多樣性，篩選出多態(tài)性好、條帶清晰的引物11 條，共擴增到87 條條帶，多態(tài)性條帶總數(shù)為87 條，多態(tài)性比例達100%，構建的34 份核心種質能夠代表原種質的遺傳多樣性。 白成科等[35]利用ISSR 分子標記，從48 份山茱萸種質中構建了15 份核心種質，后來Li[37]進行更新并構建了18 份核心種質。劉向宇等[38]利用ISSR 分子標記，對35 份山藥種質進行遺傳多樣性分析，篩選出12 條有效引物，共擴增出142 個位點，多態(tài)性比率為97.18%，構建了11 份核心種質，多態(tài)位點率達到97.8%。 目前已構建的藥用植物核心種質情況如表1 所示。

表1 藥用植物核心種質構建情況

4 小結

我國藥用植物資源豐富，據(jù)統(tǒng)計有383 科2 309屬11 146 個種及種下類群[70]，但已構建核心種質的藥用植物僅是其中極少一部分。 隨著市場需求變化，通過生產(chǎn)種植才能滿足需要的藥用植物種類越來越多，栽培面積越來越大。 一些道地藥材由于長期種植，其種質發(fā)生明顯分化，形成數(shù)量眾多的種質，成為其道地性的重要體現(xiàn)，對這些種質進行收集、整理、保存對于保證藥材質量意義重大。 由于核心種質最大限度地保留了遺傳多樣性，從中選育優(yōu)良品種可以大幅度提高選育效率，是提高藥材產(chǎn)量與質量的有效途徑，但目前藥用植物核心種質構建研究尚處于起步階段，已構建核心種質的藥用植物還很少，需要加大研究力度，盡快構建一批道地藥材核心種質，將優(yōu)質藥材基因保存下來。

構建藥用植物核心種質的最終目的還是為了更好地挖掘利用，為發(fā)展中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)服務。 質量是藥材的生命，藥用植物核心種質要體現(xiàn)出藥材優(yōu)質性，這與一般植物不同。 因此，構建藥用植物核心種質應注意吸收先進科學技術，將與藥材質量有關的基因挖掘出來加以利用。 基因測序技術在挖掘藥用植物抗逆性、藥材產(chǎn)量質量相關優(yōu)異基因等方面發(fā)揮著重要作用，例如構建陸地棉核心種質時，重測序技術就被用于影響纖維質量和產(chǎn)量基因的挖掘[71]。 總之，核心種質構建可為優(yōu)良品種選育提供優(yōu)質材料，是中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)高質量發(fā)展的物質基礎，必須予以足夠重視。