二甲雙胍基于Nrf2/HO-1/NF-κB信號通路對腰椎間盤退變的影響▲

董軍立 賈誠謙 姚憲寶 苗二芽 蔡 毅

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院疼痛科,湖北省武漢市 430014)

腰椎間盤退變是引起腰椎間盤突出、腰背疼痛、椎管狹窄等病癥的主要原因之一[1]。腰椎間盤退變發(fā)病機制復雜,衰老、遺傳易感性增強、營養(yǎng)供應障礙、機械負荷等均是導致腰椎間盤病變及退化的關鍵因素[2]。近年來有學者提出,炎癥浸潤及氧化應激反應是導致腰椎間盤退變患者出現(xiàn)髓核細胞數目減少、纖維環(huán)層狀結構消失、椎間盤組織彈性下降、抗壓能力減退等椎間盤病理改變的主要原因[3-4]。核轉錄因子紅系2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是機體內重要的保護因子,凋亡、炎癥、氧化應激等因素均可促進Nrf2入核活化,從而誘導下游轉錄因子如血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)表達,發(fā)揮抗氧化作用[5]。而HO-1高表達也可抑制核轉錄因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)入核活化,從而減輕組織炎癥損傷及細胞凋亡[6]。上述研究結果提示,抑制Nrf2/HO-1/NF-κB通路的活化可能是抑制或緩解腰椎間盤退變患者髓核組織炎癥、氧化應激損傷及凋亡相關性病變的潛在機制。目前臨床上缺乏治療椎間盤退變的特異性藥物。二甲雙胍是治療糖尿病的一線藥物,有學者發(fā)現(xiàn)其可通過抑制自噬、炎癥反應、氧化應激反應來緩解阿爾茨海默病、帕金森等神經退行性疾病的進展[7],并通過上調髓核細胞胞外基質合成而影響退變的髓核細胞代謝[8],提示二甲雙胍很可能對抑制椎間盤變性及退化有重要作用。本研究基于Nrf2/HO-1/NF-κB通路探討二甲雙胍對腰椎間盤退變大白兔模型椎間盤組織的影響,現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 120只雄性無特定病原體級新西蘭大白兔,體質量(2.50±0.50)kg,購自武漢有度生物科技有限公司[生產許可證號:SCXK(鄂)2015-0025]。將大白兔單籠飼養(yǎng)在溫度為(22±2)℃、濕度為(50±5)%的動物房內,并保持12 h明暗循環(huán)。本試驗符合3R原則并經本院醫(yī)學倫理委員會批準[審批號:IACUC-01(20210010014)]。

1.2 主要試劑和儀器 二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司,批號:202103012003),全反式維甲酸(上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司,批號:SIGMA R2625),HE染色液(北京伊塔生物科技有限公司,批號:YT8310);白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號:ml027836、ml027836、ml092661、ml094971),Nrf2山羊抗兔一抗、HO-1山羊抗兔一抗、NF-κB山羊抗兔一抗、磷酸化NF-κB(phosphorylated NF-κB,p-NF-κB)山羊抗兔一抗、Ⅱ型膠原蛋白山羊抗兔一抗、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)山羊抗兔一抗、過氧化氫酶(catalase,CAT)山羊抗兔一抗、Caspase-3山羊抗兔一抗、Ⅰ型膠原蛋白山羊抗兔一抗、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的驢抗山羊IgG二抗(Abcam公司,批號:20210708、20210512、20210921、20210704、20210613、20210325、20210416、20210524、20210908、20210926、20210817),DAB、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)、ECL液、RIPA裂解液(上海碧云天生物科技有限公司,批號:P0202、P0010S、P0018FS、P0013B),光學顯微鏡(HITACHI公司,型號:S-3400N)。

1.3 實驗方法

1.3.1 椎間盤退變模型的建立、分組及干預方法:采用隨機數字表法選取100只大白兔,采用3%戊巴比妥鈉麻醉后行左側腹背部備皮,暴露L2～6椎間盤,參照文獻[9]的方法采用髓核穿刺抽吸法破壞椎間盤建立椎間盤退變模型。術后12周行X線及MRI檢查,當檢查結果提示椎間隙縮窄且Prirrmann分級[10]為Ⅱ級時判定為造模成功,本研究100只大白兔均造模成功。將椎間盤退變大白兔模型按隨機數字表法分為模型組、二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組、Nrf2抑制劑組、二甲雙胍+Nrf2抑制劑組,每組20只。取剩余的20只大白兔作為假手術組,只暴露其L2～6椎間盤,不進行破壞。

將二甲雙胍的使用劑量按人與動物體表面積等效劑量換算單位折算為等效劑量40 mg/kg,并設置低劑量(40 mg/kg)與高劑量(160 mg/kg),然后給予二甲雙胍低劑量組與二甲雙胍高劑量組大白兔灌胃相應劑量的二甲雙胍,1次/d。參照文獻[11],給予Nrf2抑制劑組大白兔腹腔注射Nrf2抑制劑(全反式維甲酸)7 mg/kg,1次/48 h。給予二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔灌胃160 mg/kg二甲雙胍及腹腔注射7 mg/kg全反式維甲酸,1次/48 h。給予假手術組及模型組大白兔灌胃10 mL/kg生理鹽水,1次/d。各組干預4周。

1.3.2 X線及MRI檢查觀察腰椎骨質改變及退變程度:末次干預后2 h,采用3%戊巴比妥鈉麻醉各組大白兔,參照文獻[12]的方法進行腰椎X線檢查及MRI檢查。通過X線圖像計算L4～5椎間盤相對高度(干預前椎間隙高度/干預后椎間隙高度×100%)通過MRI圖像觀察椎間盤髓核與纖維環(huán)的形態(tài)及信號變化,并用Prirrmann分級法對椎間盤退變程度進行評分,Ⅰ級(正常)為0分,Ⅱ級(輕度退化)為1分,Ⅲ級(中度退化)為2分,Ⅳ級(重度退化)為3分,Ⅴ級(晚期退化)為4分,評分越高說明椎間盤退變程度越嚴重。

1.3.3 HE染色觀察椎間盤組織病變:X線及MRI檢查2 h后,按隨機數字表法選取各組6只大白兔,將其麻醉處死后取椎間盤組織并用4%多聚甲醛固定,然后用0.5 mol/L乙二胺四乙酸脫鈣20 d,石蠟包埋后制成厚度為4 μm的連續(xù)橫斷面切片。依次行二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水,再用蘇木精浸泡染色5 min,自來水沖洗20 min,1%酸性酒精分色1～3 s,0.5%伊紅溶液染色1～3 min,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,于光學顯微鏡下觀察纖維環(huán)及髓核形態(tài)變化。

1.3.4 免疫組化法檢測Ⅱ型膠原蛋白、Nrf2陽性表達:取1.2.3制備的椎間盤組織石蠟切片,經脫蠟、透化及抗原修復處理后,加入稀釋比為1 ∶300的Ⅱ型膠原蛋白山羊抗兔一抗、Nrf2山羊抗兔一抗孵育過夜,滴加辣根過氧化物酶標記的驢抗山羊IgG二抗(稀釋比為1 ∶500)孵育45 min,DAB顯色后置于光學顯微鏡下觀察拍照,采用ImagePro Plus 6.0軟件分析單位面積內(mm2)陽性染色的平均光密度值。Ⅱ型膠原蛋白主要存在于細胞外基質中,Nrf2在細胞質和細胞核內均有分布,棕黃色染色即為陽性染色。

1.3.5 ELISA檢測椎間盤組織IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平:X線及MRI檢查2 h后,按隨機數字表法選取各組6只大白兔,麻醉處死后取椎間盤組織,置于液氮凍存。取出凍存的組織,加入液氮后粉碎研磨,獲取勻漿液,按ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平。

1.3.6 Western blot檢測椎間盤組織Nrf2/HO-1/NF-κB信號通路相關蛋白及下游抗氧化、凋亡相關蛋白的表達:將各組剩余8只大白兔麻醉處死后取椎間盤組織,置于液氮中凍存。取出凍存的組織,加入液氮后粉碎研磨,獲取勻漿液,加入RIPA裂解液以提取總蛋白,利用BCA法檢測細胞蛋白濃度。取95℃高溫變性后的50 μg蛋白,通過SDS-PAGE分離等量蛋白,將蛋白轉至PVDF膜。用5%脫脂牛奶4 ℃封閉PVDF膜1 h,再用TBST洗膜3次,5 min/次,然后將膜與Nrf2、HO-1、NF-κB、p-NF-κB、SOD2、CAT、Caspase-3、Ⅰ型膠原的山羊抗兔一抗(稀釋比均為1 ∶600)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次,5 min/次,將膜與辣根過氧化物酶標記的驢抗山羊IgG二抗(稀釋比為1 ∶800),37 ℃孵育75 min,TBST洗膜5次,5 min/次。以β-actin抗體(稀釋比為1 ∶700)為內參蛋白,采用ECL液顯影曝光后,利用Image J軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大白兔的腰椎骨質改變及退變程度 X線檢查顯示,假手術組大白兔L4～5椎間隙正常,關節(jié)面光滑平整且骨質無明顯改變;相比于假手術組,模型組大白兔L4～5椎間隙變窄,關節(jié)面毛糙,上下椎體前緣增生且呈唇狀改變,相鄰椎體終板骨質硬化及骨贅形成明顯,L4～5椎間盤相對高度減少(P<0.05);相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔L4～5椎間隙增寬,相鄰椎體終板骨質硬化及骨贅形成消失或部分可見,L4～5椎間盤相對高度均增加,且二甲雙胍高劑量組的L4～5椎間盤相對高度大于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔L4～5椎間隙變窄,相鄰椎體終板骨質硬化及骨贅形成更為明顯,L4～5椎間盤相對高度減少(P<0.05);相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔L4～5椎間隙變窄,相鄰椎體終板骨質硬化及骨贅形成明顯,L4～5椎間盤相對高度減少(P<0.05);相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔L4～5椎間隙增寬,L4～5椎間盤相對高度增加(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 各組大白兔L4～5椎間盤相對高度的比較(x±s,%)

假手術組 模型組 二甲雙胍低劑量組 二甲雙胍高劑量組 Nrf2抑制劑組 二甲雙胍+Nrf2抑制劑組

2.2 各組大白兔椎間盤Prirrmann分級評分的比較 MRI檢查顯示,假手術組大白兔腰椎間盤呈高信號;相比于假手術組,模型組大白兔腰椎間盤呈低信號,椎間盤Prirrmann分級評分升高(P<0.05);相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔腰椎間盤呈高信號,椎間盤Prirrmann分級評分均降低,且二甲雙胍高劑量組的椎間盤Prirrmann分級評分低于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔腰椎間盤呈低信號,椎間盤Prirrmann分級評分升高(P<0.05);相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔腰椎間盤呈低信號,椎間盤Prirrmann分級評分高于二甲雙胍高劑量組(均P<0.05);相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔腰椎間盤呈高信號,椎間盤Prirrmann分級評分降低(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 各組大白兔椎間盤Prirrmann分級評分的比較(x±s,分)

假手術組 模型組 二甲雙胍低劑量組 二甲雙胍高劑量組 Nrf2抑制劑組 二甲雙胍+Nrf2抑制劑組

2.3 各組大白兔腰椎間盤組織病理變化的情況 HE染色結果顯示,假手術組大白兔腰椎間盤組織纖維環(huán)層狀結構及髓核細胞、纖維樣軟骨細胞的形態(tài)均正常;相比于假手術組,模型組大白兔腰椎間盤組織纖維環(huán)層狀結構紊亂、部分斷裂,髓核細胞被膠原組織分裂為橢圓形的細胞島,纖維樣軟骨細胞增多;相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔腰椎間盤組織纖維環(huán)層狀結構逐漸清晰,髓核細胞逐漸增多,纖維樣軟骨細胞減少;相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔腰椎間盤組織纖維環(huán)層狀結構斷裂更明顯,髓核細胞被纖維樣軟骨細胞代替;相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔腰椎間盤組織纖維環(huán)層狀結構斷裂及髓核細胞凋亡的情況更嚴重;相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔腰椎間盤組織纖維環(huán)層狀結構清晰,髓核細胞增多,纖維樣軟骨細胞減少。見圖3。

假手術組 模型組 二甲雙胍低劑量組 二甲雙胍高劑量組 Nrf2抑制劑組 二甲雙胍+Nrf2抑制劑組

2.4 各組大白兔髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白陽性表達的比較 免疫組化染色結果顯示,假手術組大白兔的髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白陽性染色較深;與假手術組相比,模型組大白兔的髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白陽性染色變淺,Ⅱ型膠原蛋白平均光密度值降低(P<0.05);與模型組相比,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔的髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白陽性染色加深,Ⅱ型膠原蛋白平均光密度值均升高,且二甲雙胍高劑量組Ⅱ型膠原蛋白平均光密度值高于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);與模型組相比,Nrf2抑制劑組大白兔的髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白陽性染色變淺,Ⅱ型膠原蛋白平均光密度值降低(P<0.05);與二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組相比,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔的髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白陽性染色變淺,Ⅱ型膠原蛋白平均光密度值降低(P<0.05);與Nrf2抑制劑組相比,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔的髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白陽性染色加深,Ⅱ型膠原蛋白平均光密度值升高(P<0.05)。見圖4、表3。

表3 各組大白兔椎間盤組織Ⅱ型膠原蛋白陽性表達平均光密度值的比較(x±s)

假手術組 模型組 二甲雙胍低劑量組 二甲雙胍高劑量組 Nrf2抑制劑組 二甲雙胍+Nrf2抑制劑組

2.5 各組大白兔椎間盤組織Nrf2陽性表達的比較 免疫組化染色結果顯示,相比于假手術組,模型組大白兔椎間盤組織Nrf2陽性染色變淺,Nrf2平均光密度值降低(P<0.05);相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔椎間盤組織Nrf2陽性染色加深,Nrf2平均光密度值均升高,且二甲雙胍高劑量組大白兔椎間盤組織Nrf2平均光密度值高于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤組織Nrf2陽性染色變淺,Nrf2平均光密度值降低(P<0.05);相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤組織Nrf2陽性染色變淺,Nrf2平均光密度值降低(P<0.05);相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤組織Nrf2陽性染色加深,Nrf2平均光密度值升高(P<0.05)。見圖5、表4。

表4 各組大白兔椎間盤組織Nrf2平均光密度值的比較(x±s)

假手術組 模型組 二甲雙胍低劑量組 二甲雙胍高劑量組 Nrf2抑制劑組 二甲雙胍+Nrf2抑制劑組

2.6 各組大白兔椎間盤組織IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平的比較 相比于假手術組,模型組大白兔椎間盤組織的IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平均升高(均P<0.05);相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔椎間盤組織的IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平均降低,且二甲雙胍高劑量組上述指標均低于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤組織的IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平均升高(均P<0.05);相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤組織的IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平均升高(均P<0.05);相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤組織的IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平均降低(均P<0.05)。見表5。

表5 各組大白兔椎間盤組織IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平的比較(x±s)

2.7 各組大白兔椎間盤組織Nrf2、HO-1蛋白表達量及p-NF-κB/NF-κB值的比較 相比于假手術組,模型組大白兔椎間盤組織Nrf2、HO-1蛋白表達量均降低,p-NF-κB/NF-κB值升高(均P<0.05);相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔椎間盤組織Nrf2、HO-1蛋白表達量均升高,p-NF-κB/NF-κB值均降低,且二甲雙胍高劑量組的上述指標均優(yōu)于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤組織Nrf2、HO-1蛋白表達量均降低,p-NF-κB/NF-κB值升高(均P<0.05);相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤組織Nrf2、HO-1蛋白表達量均降低,p-NF-κB/NF-κB值升高(均P<0.05);相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤組織Nrf2、HO-1蛋白表達量升高,p-NF-κB/NF-κB值降低(P<0.05)。見圖6、表6。

表6 各組大白兔椎間盤組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達量及p-NF-κB/NF-κB值的比較(x±s)

圖6 各組大白兔蛋白表達Western blot圖

2.8 各組大白兔椎間盤組織SOD2、CAT、Caspase-3蛋白表達量及Ⅰ型膠原蛋白表達量的比較 相比于假手術組,模型組大白兔椎間盤組織SOD2、CAT蛋白表達量及Ⅰ型膠原蛋白表達量均降低,Caspase-3蛋白表達量升高(均P<0.05);相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔椎間盤組織SOD2、CAT蛋白表達量及Ⅰ型膠原蛋白表達量均升高,Caspase-3蛋白表達量均降低,且二甲雙胍高劑量組上述指標均優(yōu)于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤組織SOD2、CAT蛋白表達量及Ⅰ型膠原蛋白表達量均降低,Caspase-3蛋白表達量升高(均P<0.05);相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤組織SOD2、CAT蛋白表達量及Ⅰ型膠原蛋白表達量均降低,Caspase-3蛋白表達量升高(均P<0.05);相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤組織SOD2、CAT蛋白表達量及Ⅰ型膠原蛋白表達量升高,Caspase-3蛋白表達量降低(P<0.05)。見圖7、表7。

表7 各組大白兔椎間盤組織SOD2、CAT、Caspase-3蛋白相對表達量及Ⅰ型膠原蛋白相對表達量的比較(x±s)

圖7 各組大白兔蛋白表達Western blot圖

3 討 論

椎間盤由髓核、纖維環(huán)及軟骨終板構成。髓核內豐富的Ⅱ型膠原纖維隨機排列在蛋白多糖基質中,使髓核具有膨脹性,發(fā)揮抗壓縮作用[13]。纖維環(huán)內含有豐富的Ⅰ型膠原纖維,由25層平行膠原纖維以60°交叉排列在椎體與脊柱軸線之間,從而有效抵抗脊柱彎曲及扭轉拉力[14]。由軟骨細胞及細胞外基質構成的軟骨終板,是為椎間盤細胞提供營養(yǎng)的重要通道[15]。纖維環(huán)層狀結構排列混亂并逐漸消失,髓核細胞體積及含水成分減少,軟骨終板內軟骨細胞退化、骨贅形成,而骨贅大量形成可導致椎間盤營養(yǎng)通道閉塞、纖維環(huán)及髓核大量減少,并最終引起椎間盤抗壓縮、抗脊柱彎曲及扭轉的作用減退[16]。關于椎間盤纖維環(huán)、髓核細胞及軟骨細胞減少的機制,國內外學者尚未達成一致,目前公認氧化應激、炎癥可能是引起椎間盤組織結構破壞的主要原因。研究表明,在氧化應激狀態(tài)下,活性氧簇及丙二醛的大量聚集,可通過一系列途徑破壞并降解髓核細胞內的聚糖蛋白、Ⅱ型膠原蛋白等,從而引起髓核組織皺縮、細胞凋亡及功能丟失[17]。氧化應激過程往往伴隨著炎癥的發(fā)生。既往研究表明,炎癥調節(jié)因子如NF-κB對活性氧簇極為敏感,機體活性氧簇的大量蓄積可激活酪氨酸激酶并誘導NF-κB二聚體與NF-κB抑制蛋白解離而入核活化,活化的NF-κB可與相應DNA的κB結合位點結合,誘導椎間盤組織中基質金屬蛋白酶及水通道蛋白酶降解而誘發(fā)凋亡;活化的NF-κB也可誘導IL-6、IL-1β轉錄并釋放,而IL-6、IL-1β可通過脂肪酸合成酶/脂肪酸合成酶配體途徑誘導髓核細胞及軟骨細胞凋亡,并參與椎間盤退變[18]。本研究采用髓核穿刺抽吸法建立腰椎間盤退變模型,發(fā)現(xiàn)大白兔的椎間盤組織纖維環(huán)破壞、髓核細胞減少,部分髓核被類骨質取代,椎間隙變窄、關節(jié)面毛糙,椎體前緣骨質增生并呈唇狀改變,椎間盤退變程度加重(椎間盤Prirrmann分級評分升高),髓核細胞凋亡加重(Ⅱ型膠原蛋白陽性染色減弱),纖維環(huán)減少明顯(Ⅰ型膠原蛋白表達降低),提示大白兔椎間盤退變明顯。另外,椎間盤組織中氧化應激產物(活性氧簇及丙二醛)及炎癥因子水平(IL-6、IL-1β)均升高,提示氧化應激及炎癥反應參與椎間盤退變過程。

有學者發(fā)現(xiàn),用活性氧簇及IL-1β阻斷劑抑制氧化應激及炎癥反應,可明顯延緩髓核細胞及纖維環(huán)組織破壞,達到延緩椎間盤退變的目的[3,17],提示抗炎及抗氧化應激可能是治療椎間盤退變的潛在策略。二甲雙胍除了具有降糖作用,還具有抗炎及抗氧化作用。田徑等[19]發(fā)現(xiàn),二甲雙胍的抗炎及抗氧化作用可減輕脂多糖誘導的腦損傷;趙季偉等[20]發(fā)現(xiàn),二甲雙胍的抗凋亡作用可抑制脊髓組織壞死;Chen等[21]發(fā)現(xiàn),二甲雙胍可通過刺激自噬來抑制體內及體外髓核細胞的衰老及凋亡,提示二甲雙胍也可能為緩解椎間盤退變的潛在藥物。但二甲雙胍的抗炎、抗氧化、抗凋亡作用是否能緩解椎間盤組織應激性退變,相關研究仍較少。本研究結果顯示,給予低劑量、高劑量二甲雙胍干預后,腰椎間盤退變模型大白兔的椎間盤退變程度減輕,椎間隙變窄及骨質改變、椎間盤組織纖維環(huán)破壞、髓核細胞減少及骨贅增加等病理表現(xiàn)得以緩解,髓核細胞(Ⅱ型膠原蛋白陽性染色)、纖維環(huán)(Ⅰ型膠原蛋白表達)均有所增加,椎間盤組織中的氧化應激及炎癥反應也明顯減弱,表明二甲雙胍可減輕椎間盤組織纖維環(huán)減少及髓核細胞凋亡等退變表現(xiàn),且其抑制作用可能與抑制炎癥及氧化應激反應有關。此外,高劑量二甲雙胍對椎間盤組織損傷的改善程度優(yōu)于低劑量二甲雙胍,推測二甲雙胍對椎間盤組織損傷的改善作用可能具有劑量依賴性,在后續(xù)的研究中將對二甲雙胍的最佳給藥劑量及是否存在劑量依賴性進行深入探究。

Nrf2/HO-1/NF-κB通路是調控炎癥、氧化應激及凋亡反應的關鍵通路之一。研究表明,活性氧簇及丙二醛可與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1的Cys273及Cys288位點相互作用并誘導其構象改變,導致Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1解離活化入核,活化的Nrf2可與抗氧化反應元件的DNA啟動子結合序列結合并形成復合物,啟動下游抗氧化酶、抗炎蛋白及Ⅱ相解毒酶的轉錄表達來發(fā)揮抗炎、抗氧化[22]。有學者發(fā)現(xiàn),Nrf2的表達隨著椎間盤退變程度的加重而降低,并認為提高Nrf2的抗氧化及抗炎作用,對延緩椎間盤退變有顯著效果[22]。另外,HO-1為Nrf2的下游轉錄因子之一,Nrf2活化后可促進HO-1的轉錄,HO-1的高表達可促進SOD2及CAT等抗氧化酶的表達,從而清除活性氧簇及丙二醛,發(fā)揮抗氧化作用,HO-1的高表達還可抑制活化NF-κB介導的炎癥應答及凋亡途徑的活化[23]。張雪梅等[24]發(fā)現(xiàn),上調HO-1表達可抑制髓核細胞中磷酸化NF-κB的活化,從而減少IL-1β促發(fā)的凋亡。本研究結果顯示,Nrf2在腰椎間盤退變模型大白兔中表達降低,且其下游HO-1及抗氧化酶表達均降低,NF-κB介導的炎癥及凋亡反應增強,而進一步抑制Nrf2/HO-1表達后,腰椎間盤退變模型大白兔的椎間盤退變程度加重,炎癥反應、氧化應激反應增強,髓核細胞凋亡現(xiàn)象明顯,提示Nrf2/HO-1介導的抗氧化、抗炎、抗凋亡活性降低可能參與椎間盤退變的過程。二甲雙胍各劑量組大白兔椎間盤退變組織中的Nrf2、HO-1表達升高,NF-κB活化及炎癥、氧化應激、凋亡反應均受到抑制,提示二甲雙胍具有抗椎間盤退變的作用,這可能與其促進Nrf2/HO-1介導的抗氧化、抗炎及抗凋亡作用有關。為了進一步驗證二甲雙胍在椎間盤退變中的作用機制,本研究采用Nrf2抑制劑進行干預實驗,并在二甲雙胍處理的基礎上應用Nrf2抑制劑進行驗證,結果顯示,與單獨應用Nrf2抑制劑相比,二甲雙胍與Nrf2抑制劑聯(lián)合應用后,大白兔椎間盤退變組織中的Nrf2、HO-1表達升高,NF-κB活化及炎癥、氧化應激、凋亡反應均受到抑制,表明二甲雙胍可以緩解Nrf2抑制劑對兔椎間盤退變程度、炎癥反應、氧化應激反應及髓核細胞凋亡的影響。此外,與單獨應用二甲雙胍相比,二甲雙胍與Nrf2抑制劑聯(lián)合應用后,大白兔椎間盤退變組織中Nrf2、HO-1表達降低,NF-κB活化及炎癥、氧化應激、凋亡反應均增強,表明Nrf2抑制劑可在一定程度上削弱二甲雙胍的抗炎、抗氧化應激及抗凋亡作用,從而加重椎間盤退變程度。

綜上所述,二甲雙胍可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路,抑制NF-κB活化,來發(fā)揮抗炎、抗氧化應激及抗凋亡的作用,從而延緩椎間盤退變,且高劑量二甲雙胍的干預效果更好。這或許可為椎間盤退變的治療提供新的策略,但Nrf2抑制劑并不能完全逆轉二甲雙胍的抗椎間盤退變作用,提示二甲雙胍還可能通過其他途徑發(fā)揮抗椎間盤退變作用,這需要深入研究以進一步探討。