壯通飲對腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)細胞損傷的影響及其作用機制

楊鑫勇，王凱華，劉丹寧，王亞南，周嫦艷

〔摘要〕 目的 探討壯通飲對腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)細胞損傷的影響及其作用機制。方法 采用線栓大腦中動脈栓塞法誘導建立小鼠腦缺血再灌注模型，造模成功后的6～7周齡雄性C57BL6J小鼠隨機分為模型組、壯通飲組、阿司匹林組、壯通飲聯(lián)合阿司匹林組，各組再隨機分為1、3、7 d時點組，另設不造模的空白組和假手術組，每組10只，按照分組灌胃給藥至相應時點。記錄各組每日體質(zhì)量及Zea Longa評分，采用TTC染色法測定腦缺血小鼠的腦梗死體積百分比；HE染色觀測缺血病理改變情況，TUNEL染色比較神經(jīng)細胞凋亡情況，透射電鏡觀測神經(jīng)細胞線粒體結構改變及自噬情況，Western blot以及RT-PCR技術分析P62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bc1-2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3（Bc1-2/adenovirusE1B 19kDa interacting protein3， BNIP3）、β-actin蛋白或基因表達情況。結果 與空白組、假手術組相比，模型組體質(zhì)量明顯下降（P＜0.05），TTC染色可見腦組織缺血梗死，出現(xiàn)神經(jīng)細胞凋亡及線粒體損傷。與模型組相比，各給藥組體質(zhì)量升高（P＜0.05），行為學評分降低（P＜0.05），梗死體積降低，且持續(xù)減?。≒＜0.05）；神經(jīng)細胞凋亡率降低（P＜0.05）。模型組線粒體結構損傷明顯較重，在1 d時各給藥組即可觀測到較多線粒體自噬小體，而模型組在3 d時才可觀測到，在7 d時各給藥組大多數(shù)線粒體結構完整，可見被溶酶體消化完成的脂滴，而模型組可見自噬小體與自噬溶酶體同時存在。與模型組比較，各給藥組P62蛋白表達在1 d時降低，3、7 d時升高（P＜0.05）；LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白比值以及P62、BNIP3的基因表達水平在1 d時升高，7 d時降低（P＜0.05）。在各給藥組中，壯通飲聯(lián)合阿司匹林組各項指標均優(yōu)于其他給藥組及模型組（P＜0.05）。結論 壯通飲能夠減輕腦缺血再灌注小鼠的神經(jīng)細胞損傷，這可能與促進神經(jīng)細胞發(fā)生線粒體自噬，維持細胞內(nèi)線粒體穩(wěn)態(tài)有關。

〔關鍵詞〕 壯通飲；腦梗死；缺血再灌注；神經(jīng)功能；線粒體自噬

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.07.002

Effects of Zhuangtong Drink on cerebral ischemia-reperfusion-induced nerve cell injury in mice and its mechanism

YANG Xinyong1，2， WANG Kaihua2*， LIU Danning1，2， WANG Yanan1，2， ZHOU Changyan1，2

1. Graduate School， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530200， China; 2. International Zhuang

Medicine Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530200， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Zhuangtong Drink on nerve cell injury induced by cerebral ischemia-reperfusion in mice and its mechanism. Methods The model of cerebral ischemia-reperfusion in mice was established by thread embolism induced middle cerebral artery occlusion （MCAO）. Six to seven-week-old male C57BL6J mice were randomly divided into model group and treatment groups including Zhuangtong Drink group， aspirin group and Zhuangtong Drink combined with aspirin group after modeling. Each group was randomly subdivided into 1 d， 3 d， and 7 d groups. In addition， blank group and sham-operated group without modeling were also set up， 10 mice per group. The corresponding drugs were administered by gavage in the groups to the corresponding time points. The daily body weight and Zea Longa scores of each group were recorded; The percentage of cerebral infarction volume in mice with cerebral ischemia was measured by TTC staining; the ischemic pathological changes， neuronal apoptosis， and structural changes and autophagy of nerve cell mitochondria were observed by HE staining， TUNEL staining， and transmission electron microscope， respectively; the protein or gene expressions of P62， LC3 II/LC3 Ⅰ， Bc1-2/adenovirusE1B 19kDa interacting protein3（BNIP3） and β-actin were analyzed by Western blot and RT-PCR techniques. Results Compared with blank group and sham-operated group， the body weight of mice in model group decreased significantly （P<0.05）， and the behavioral scores increased （P<0.05）; TTC staining showed cerebral ischemic infarction， neuronal apoptosis and mitochondrial injury. Compared with model group， the body weight of mice in treatment groups increased （P<0.05）; the behavioral scores， mortality rates， as well as the rate of neuronal apoptosis decreased （P<0.05）; the infarction volume was reduced and continued to be lowered （P<0.05）. The structural damages of mitochondria in mice of model group were obviously more severe. More mitophagosomes could be observed in treatment groups on the 1st day， while in model group on the 3rd day. Most of the mitochondria in treatment groups were intact on the 7th day， and the lipid droplets digested by lysosomes could be seen， while in model group， autophagosomes and autolysosomes coexisted. Compared with model group， the expression of P62 protein in each treatment group decreased on the 1st day and increased on the 3rd and 7th day （P<0.05）， while LC3 II/LC3 Ⅰ ratio and the gene expression levels of P62 and BNIP3 increased on the 1st day and decreased on the 3rd and 7th day （P<0.05）. Among treatment groups， the indexes of Zhuangtong Drink combined with aspirin group were better than other treatment groups and model group （P<0.05）. Conclusion Zhuangtong Drink can relieve the injury of nerve cells in cerebral ischemia-reperfusion mice， which may be related to the promotion of nerve cell mitophagy and the maintenance of intracellular mitochondrial homeostasis.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Zhuangtong Drink; cerebral infarction; ischemia-reperfusion; neurological function; mitophagy

缺血性腦血管病是最常見的腦血管病，約占全部腦血管疾病的75％，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率、高復發(fā)率等特點[1]。目前，有效治療方法包括溶栓治療、血管內(nèi)治療等急性治療措施，但受到時間窗和出血轉化風險的限制，且有缺血再灌注損傷的風險。因此，尋找有效的腦神經(jīng)保護藥物對保護缺血腦組織的功能具有十分重要的意義。

壯醫(yī)認為，頭腦為“巧塢”，腦梗死是瘀血堵塞三道、兩路，而致“巧塢”失養(yǎng)所致[2]。治療上，壯醫(yī)注重疏三道通兩路，調(diào)治“巧塢”。壯通飲由扶芳藤、黃花倒水蓮、參三七3味特色壯藥組成。扶芳藤味辛，性平，能通龍路、火路，能舒筋通絡，止血消瘀。黃花倒水蓮味甘，性微溫，能祛濕解毒，補虛，活血止血。參三七味甘、溫、微苦，能通龍路，能止血消腫，化瘀止痛。壯通飲有通龍路、火路之功，能舒筋通絡、活血止血消瘀，在腦梗死的臨床治療上具有顯著療效[3]。

線粒體是缺血后神經(jīng)細胞死亡的關鍵靶區(qū)，是神經(jīng)細胞存活的關鍵因素。線粒體自噬是一種特殊的自噬類型，可以選擇性地清除受損線粒體，其在應激狀態(tài)中（如缺氧、鈣超載等）起著至關重要的作用[4]。在缺血再灌注病理過程中，細胞可以通過激活自噬途徑，清除受損的線粒體和過量產(chǎn)生的活性氧化物（reactive oxygen species， ROS），維持細胞內(nèi)線粒體功能的穩(wěn)定，從而抑制線粒體依賴的調(diào)亡[5]。提示線粒體自噬是缺血再灌注病理過程中重要的內(nèi)源性保護機制，是腦梗死治療的潛在靶點。本研究通過動物實驗，探索壯通飲與線粒體自噬的聯(lián)系，以期為腦缺血治療提供新思路及新藥物。

1 材料

1.1? 動物

使用196只SPF（specific pathogen free）級同遺傳背景雄性C57BL6J小鼠，6～7周齡，體質(zhì)量19.4～21.4 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物質(zhì)量合格證號：430727211101254174。所有實驗動物均飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學科學實驗中心SPF級動物房中。飼養(yǎng)條件：5只1籠，溫度22 ℃，濕度50%，自由飲水、進食，有實驗人員操作時開啟日光燈，其余時間關閉日光燈，于8：00至17：00開啟動物照明燈光。本實驗經(jīng)本校倫理委員會批準，符合3R原則，倫理編號：DW20210410-074。本實驗共使用小鼠196只，死亡36只，死亡原因多為蛛網(wǎng)膜下腔出血及病情過重，實際納入實驗160只，總體死亡率為18.37%。

1.2? 藥物制備

壯通飲方劑臨床每日使用劑量：扶芳藤30 g，黃花倒水蓮20 g，三七10 g。根據(jù)《中藥藥理研究方法學》[6]提供的實驗動物劑量換算方法，按照成人體質(zhì)量60 kg計算，小鼠給藥量：扶芳藤4.55 g/（kg·d）、黃花倒水蓮3.03 g/（kg·d）、參三七1.52 g/（kg·d）。第一次煎煮取10倍體積的純水，浸泡30 min后，煮至沸騰后續(xù)煮1 h，取溶液待用。第二次煎煮取8倍體積純水復煎，煮至沸騰后續(xù)煮30 min，取藥液與第一次藥液混合后使用300目濾網(wǎng)過濾，將過濾后的藥液至于60 ℃水浴鍋中，濃縮藥液至200 mL，每毫升含生藥0.91 g。按照0.1 mL/10 g灌胃體積灌胃給藥。

阿司匹林按照成人劑量100 mg/d（成人體質(zhì)量按60 kg計算）換算成小鼠給藥劑量為：13 mg/kg，使用萬分之一天平稱取7.5 mg每管分裝于10 mL離心管中，每次給藥前加入純水5 mL，每毫升含藥1.5 mg，制備成0.1 mL/10 g給藥濃度的阿司匹林溶液。

1.3? 主要儀器及試劑

造模用線栓（型號：L1800）購自州佳靈生物技術有限公司。獸用青霉素鈉（批號：190301）購自華北制藥集團有限責任公司。扶芳藤（批號：20210901）、黃花倒水蓮（批號：20211101）、三七（批號：20210701）購自仙茱中藥科技有限公司。阿司匹林（批號：A104180）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。戊巴比妥鈉（批號：11715）購自美國Sigma-Aldrich LLC.公司。TTC染液（批號：DK0005）購自北京雷根生物技術有限公司。Gluta電鏡固定液（批號：P1126）、RIPA強效裂解液（批號：R0010）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：PC0020）、脫脂奶粉（批號：D8340）均購自北京索萊寶科技有限公司?？焖僦颇z試劑盒（批號：PG213）、三色預染蛋白maker（批號：WJ103）、超靈敏化學發(fā)光液（批號：SQ101）均購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。LC3抗體（批號：14600-1-AP）購自PTG。CytC（批號：4280S）、β-actin（批號：3700S）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。P62抗體（批號：A7758）購自武漢博士德生物工程有限公司。羊抗兔二抗（批號：31234）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。解剖顯微鏡（型號：MSD203）、搖臂顯微鏡（型號：ST6024-B1）由科學實驗中心動物房提供。萬分之一電子天平（型號：PL203）購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。TUNEL試劑盒（批號：11684817910）、PCR儀（型號：LC96）購自上海羅氏制藥有限公司。電泳儀（型號：PowerPacTMHC）、化學發(fā)光成像儀（型號：732BR2019）購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司。

2 方法

2.1? 動物造模

2.1.1? 造模方法? 參考Zea Longa改良的線栓法對C57BL6J小鼠進行大腦中動脈缺血再灌注的造模[7]。隨機選擇6～7周齡實驗小鼠，術前24 h禁食不禁水，麻醉備皮后仰臥置于37 ℃恒溫墊上，于頸后墊一棉簽以更好地暴露術口，在搖臂顯微鏡下操作，正中切口，小心暴露左側頸總動脈（common carotid artery， CCA），沿CCA向上繼續(xù)分離頸外動脈（external carotid artery， ECA）、頸內(nèi)動脈（internal carotid artery， ICA），術中注意避免觸及迷走神經(jīng)。兩次結扎ECA后在結扎處中間剪斷，使用動脈夾夾閉CCA和ICA，夾持住ECA殘端，使用0.5 mL注射器楔形面緊貼血管，與ECA上滑刺一小缺口，將線栓送入缺口處后，稍用力向外（以頸部正中為內(nèi)）牽拉ECA殘端，以避免線栓誤入翼腭動脈（pterygopalatine artery， PPA），松開ICA上的血管夾，將線栓緩緩向里推送，至線栓黑色標記處接近分岔處，稍微感受到阻力時，立即停止插入線栓，結扎線栓入口處，清理并整理傷口，俯臥位置于恒溫墊上。梗死1 h后，再次暴露CCA，取出線栓，拉緊結扎線，確認無出血后縫合傷口。

2.1.2? 成模的判斷及造模后的護理? 動物蘇醒后，具有以下4項體征則表示模型制作成功[8]：（1）提尾時右前肢內(nèi)收屈曲（即提尾懸空實驗陽性）；（2）左眼Horner征；（3）爬行時向右劃圈；（4）站立時向右側傾倒。

小鼠腦缺血再灌注損傷造模難度較大，文獻報道的死亡率較高，本實驗在造模過程中全程使用搖臂顯微鏡以充分暴露術野，在插入線栓時向外稍用力牽拉ECA殘端，以防止誤插入PPA，推送線栓時稍看到線栓彎曲即停止，以避免蛛網(wǎng)膜下腔出血，采用取出線栓后再次結扎血管再縫合皮膚的辦法，以防止拔栓后出血。術后立即予生理鹽水以補充體液流失并消毒傷口。蘇醒后每日常規(guī)消毒、抗感染、補充能量并嚴格控制環(huán)境溫度。使用此飼養(yǎng)和護理方案，能夠明顯提升模型小鼠的成活率，預實驗小鼠成活率為93.33%。

2.1.3? 分組與給藥方法? 隨機挑選出空白組與假手術組后，將造模成功的小鼠隨機分為模型組、壯通飲組、阿司匹林組、壯通飲聯(lián)合阿司匹林組，每個給藥組再隨機分為1、3、7時點組，每時點每組10只。實驗過程中每天10：00給予每只小鼠10%葡萄糖水0.2 mL/10 g灌胃，16：00給予聚維酮碘擦拭傷口消毒，并腹腔注射獸用青霉素鈉4萬單位。20：00按分組以0.1 mL/10 g的灌胃體積灌胃給藥，空白組不給藥，假手術組及模型組予生理鹽水兩次，壯通飲組予壯通飲溶液1次及生理鹽水1次，阿司匹林組予阿司匹林溶液1次及生理鹽水1次，壯通飲聯(lián)合阿司匹林組予壯通飲溶液1次及阿司匹林溶液1次。

2.2? 神經(jīng)功能評估

各組實驗動物在造模成功后8 h以及此后每天參照Zea Longa 5分評分法[7]進行神經(jīng)功能缺損評分，評分者為3人，每人獨立評分后匯總，求其平均值作為該小鼠神經(jīng)功能得分。

2.3? 腦梗死體積百分比測定

到達相應各組時間點后隨機選取5只小鼠，采用TTC染色法測定腦梗死體積百分比。小鼠麻醉后心臟灌注冰生理鹽水，而后快速斷頭取腦，去除嗅腦、小腦和低位腦干，置于-20 ℃冰箱中冷凍20 min，從額極開始，每隔2 mm切1片。將切片置于2% TTC染液中，置于37 ℃溫箱30 min，每隔10 min翻面1次。染色結束后，將切片放置于多聚甲醛溶液中，固定24 h后，白光下拍照。拍照結果用Image-pro plus6.0掃描并計算腦梗死體積百分比。校正腦梗死體積百分比=[總梗死體積-（梗死側半球體積-梗死對側半球體積）]/梗死對側半球體積×100%[9]。

2.4? HE染色

小鼠麻醉后心臟灌注冰生理鹽水，而后快速斷頭取腦，將梗死側腦組織保存于多聚甲醛溶液中靜置24 h后，制成石蠟塊。制作成石蠟切片后將其依次放入二甲苯、無水乙醇中，而后將切片放入蘇木素染液染3～5 min，再用分化液分化，返藍液返藍，每個步驟后都使用純水沖洗切片。將切片入梯度乙醇脫水，入伊紅染液中染色5 min。將切片依次放入無水乙醇、二甲苯中使其透明，中性樹膠封片。使用顯微鏡鏡檢，采集圖像進行分析。

2.5? TUNEL法檢測小鼠神經(jīng)細胞凋亡

將制好的石蠟切片依次放入二甲苯、梯度乙醇中脫水，按照TUNEL試劑說明書依次進行操作，將最終的切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。隨機選擇5個視野，計算凋亡細胞核（綠色熒光）與細胞核總數(shù)（藍色熒光）的百分比。即TUNEL指數(shù)=（凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%。

2.6? 透射電鏡觀測線粒體結構

小鼠麻醉后心臟灌注冰生理鹽水，而后快速斷頭取腦，避免牽拉與擠壓，剪下相對小的梗死側腦組織置于戊二醛電鏡固定液中室溫固定20 min，使組織變硬后修剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，置于充足電鏡固定液中4 ℃固定2 h，室溫固定、脫水、包埋后使用超薄切片機切制成60～80 nm的超薄切片。鈾鉛雙染色后，透射電子顯微鏡下觀察神經(jīng)細胞的線粒體結構，采集圖像，分析結果。

2.7? 免疫印跡技術檢測梗死側P62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ情況

小鼠麻醉后心臟灌注冰生理鹽水，而后快速斷頭取腦，取梗死側大腦皮層組織，使用液氮轉移至-80 ℃冰箱中保存。取出組織樣本，提取總蛋白后使用BCA法測定總蛋白濃度，使用雅酶預制膠試劑盒制作12.5%電泳膠，以75 V/0.5 h-110 V/1.0 h條件電泳，200 mA/1 h條件轉膜，一抗4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h，使用雅酶ECL超敏化學發(fā)光液顯影，以β-actin為內(nèi)參對照進行條帶的數(shù)據(jù)標準化，使用Image lab對條帶信號進行分析。

2.8? RT-PCR檢測梗死側P62、Bc1-2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3（Bc1-2/adenovirusE1B 19kDa interacting protein3， BNIP3）的表達

取出保存在-80 ℃中的組織樣本，使用Promega RNA提取試劑盒，按說明書逐步進行總RNA的提取，變性后使用Roche試劑盒進行逆轉錄及上機，以β-actin為內(nèi)參，在Roche LC96 PCR儀上擴增進行反應，引物序列詳見表1。記錄ct值作為統(tǒng)計參數(shù)，用比較2-△△CT法計算mRNA相對表達水平。

2.9? 統(tǒng)計學處理

實驗結果采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析處理。所有數(shù)據(jù)均以“ｘ±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t法或S-N-K法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1? 壯通飲對小鼠體質(zhì)量及行為學評分的影響

造模前，各組小鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與同時點空白組、假手術組比較，模型組小鼠在1、3、7 d時體質(zhì)量均下降（P＜0.05）。與同時點模型組比較，給藥組小鼠在3、7 d時體質(zhì)量均上升（P＜0.05）。與同時點阿司匹林組比較，壯通飲聯(lián)合阿司匹林組小鼠在3、7 d時的體質(zhì)量均上升（P＜0.05）。詳見表2。

各組造模后Zea Longa評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與同時點模型組比較，給藥組小鼠在1、3、7 d時Zea Longa評分均下降（P＜0.05）。給藥組各時點組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組3、7 d時的Zea Longa評分均較造模后下降（P＜0.05）。詳見表3。

3.2? 壯通飲對小鼠腦梗死體積百分比的影響

與模型組比較，在1 d時，壯通飲聯(lián)合阿司匹林組腦梗死體積百分比下降，在3、7 d時，給藥組腦梗死體積百分比均下降（P＜0.05）。與模型組1 d時比較，同組3 d時升高，7 d時下降（P＜0.05）。給藥組腦梗死體積百分比與同組前一時間點比較，均下降（P＜0.05）。給藥組腦梗死體積百分比同時點組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表4。

3.3? 壯通飲對小鼠病理改變及神經(jīng)細胞凋亡率的影響

HE染色結果如圖1所示。與空白組及假手術組比較，造模組、給藥組在1 d時均呈中度異常，其后給藥組病理改變均得到緩解，至7 d時腦組織結構輕度異常，少量神經(jīng)元變性，被膠質(zhì)細胞吞噬，給藥組之間未見明顯差異。模型組病理改變在3 d時加重，在7 d時緩解。TUNEL凋亡結果詳見圖2、表5。與空白組、假手術組比較，模型組神經(jīng)細胞凋亡率升高（P＜0.01）。與模型組比較，在1 d時，壯通飲聯(lián)合阿司匹林組神經(jīng)細胞凋亡率下降，在3、7 d時，給藥組的神經(jīng)細胞凋亡率均下降（P＜0.05）。與本組1 d時比較，模型組在3 d時神經(jīng)細胞凋亡率升高，在7 d時神經(jīng)細胞凋亡率下降，給藥組在3、7 d時均下降（P＜0.05）。與本組3 d時比較，給藥組在7 d時神經(jīng)細胞凋亡率均下降（P＜0.05）。給藥組各時點比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3.4? 壯通飲對小鼠神經(jīng)細胞線粒體結構的影響

本實驗中線粒體電鏡超微結構顯示，空白組、假手術組神經(jīng)元細胞線粒體結構尚可，膜完整，嵴平行排列，偶見個別膜內(nèi)基質(zhì)變淡、嵴減少，未見典型自噬小體及自噬溶酶體形成。在各造模組中可觀測到線粒體腫脹、空泡變性和嵴消失等損傷現(xiàn)象。模型組線粒體受損程度明顯較給藥組嚴重，在1 d時可見較多受損線粒體，僅偶見線粒體自噬小體存在，在3 d時可見較多線粒體自噬小體，在7 d時可見自噬小體及自噬溶酶體存在。各給藥組在電鏡結果上未見明顯差異，均在1 d時可觀測到線粒體自噬小體較模型組多，在3 d時可見自噬溶酶體及脂滴，在7 d時大多數(shù)線粒體結構完整，可見被溶酶體消化完成的脂滴，壯通飲聯(lián)合阿司匹林組的神經(jīng)元細胞在第7天時已未見明顯損傷。詳見圖3。

3.5? 壯通飲對MCAO小鼠P62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、BNIP3表達的影響

與假手術組比較，同時點模型組P62蛋白表達下降（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組的P62蛋白表達均在1 d時降低，在3、7 d時升高（P＜0.05）。與阿司匹林組比較，壯通飲聯(lián)合阿司匹林組的P62蛋白表達在1 d時降低，在3、7 d時升高（P＜0.05）。與本組1 d時比較，壯通飲組在3、7 d時的表達差異無統(tǒng)計學意義，而阿司匹林組、壯通飲聯(lián)合阿司匹林組P62蛋白表達升高（P＜0.05）。與本組3 d時相比，壯通飲聯(lián)合阿司匹林組在7 d時P62蛋白表達降低（P＜0.05）。詳見圖4、表6。

與假手術組比較，同時點模型組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值上升（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值均在1 d時上升，在3 d時下降（P＜0.05）。與阿司匹林組比較，壯通飲聯(lián)合阿司匹林組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值在1 d時升高，在3、7 d時降低（P＜0.05）。與本組1 d時比較，在3、7 d時模型組蛋白比值均上升，各給藥組蛋白比值均下降（P＜0.05）。與本組3 d時比較，除假手術組、壯通飲聯(lián)合阿司匹林組外，其余各組蛋白比值均上升（P＜0.05）。詳見圖4、表7。

與同時點假手術組比較，模型組P62 mRNA、BNIP3 mRNA表達在3、7 d時升高（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組P62 mRNA、BNIP3 mRNA表達均在1 d時升高，在7 d時降低（P＜0.05）。與阿司匹林組比較，壯通飲聯(lián)合阿司匹林組P62 mRNA、BNIP3 mRNA表達在1 d時升高，在3、7 d時降低（P＜0.05）。與同組1 d時比較，7 d時模型組P62 mRNA、BNIP3 mRNA表達均上升，給藥組P62 mRNA、BNIP3 mRNA表達均下降（P＜0.05）。詳見表8—9。

4 討論

腦梗死，在壯醫(yī)學中稱為“麻邦”，是由各種原因?qū)е氯纼陕凡煌?，三氣不能同步，氣血上逆沖擊“巧塢”，致使“巧塢”功能失調(diào)所致。壯通飲由扶芳藤、黃花倒水蓮、參三七組成，是壯醫(yī)治療腦梗死的經(jīng)驗方[10]。前期研究證實，壯通飲能夠減輕缺氧/復氧細胞屏障的損傷[11]，能夠保護糖氧剝奪誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷[12]，可以促進腦梗死后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖分化，新分化的神經(jīng)元細胞有正常的興奮性，表明其能夠發(fā)揮正常的神經(jīng)功能[13]。本研究采用TTC染色法探討壯通飲對腦缺血再灌注小鼠腦梗死面積的影響，結果表明壯通飲能夠顯著減輕小鼠腦梗死體積，結合TUNEL染色、HE染色結果，提示壯通飲在腦卒中早期具有神經(jīng)保護和抗細胞凋亡作用，這與此前報道相一致[11-12]。再灌注后，與模型組比較，壯通飲組、阿司匹林組體質(zhì)量上升，神經(jīng)系統(tǒng)行為學改善，提示壯通飲能夠有效緩解腦組織缺血缺氧損傷。

線粒體是細胞的能量代謝中心，被稱為細胞的“動力工廠”，參與細胞多種生命活動，發(fā)揮重要作用[14]。線粒體自噬是指通過自噬途徑清除受損線粒體，或為降低耗氧量選擇性地清除部分線粒體，維持線粒體穩(wěn)態(tài)的過程[15]。在缺血性腦卒中過程中，細胞受缺血缺氧刺激，首先累及的亞細胞器就是線粒體，線粒體發(fā)生損傷，可以通過誘發(fā)線粒體自噬以清除受損的線粒體，降低細胞需氧量，以保護神經(jīng)細胞，避免神經(jīng)細胞凋亡[4-5]。因此，在細胞的缺血缺氧損傷仍然處于可承受的范圍時，細胞可以通過激活線粒體自噬途徑完成細胞的自我修復及時止損[16]，干預線粒體自噬可能是缺血性腦卒中的一種有效治療策略[17]，相關研究也證明保護線粒體能夠改善MCAO大鼠的認知功能[18]。P62蛋白是一種重要的選擇性自噬接頭蛋白[19]，經(jīng)P62-LC3途徑進入自噬-溶酶體系統(tǒng)被降解，從而清除蛋白聚合物和受損的細胞器[20]。BNIP3是一種促凋亡蛋白[21]，僅在腦組織與平滑肌中極低水平表達，當腦組織遭受缺血缺氧刺激時，其表達量升高。其定位于線粒體外膜并能引起細胞凋亡，與誘導線粒體自噬關系密切[22]。P62蛋白表達的降低以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平的升高，BNIP3 mRNA表達水平的升高，電鏡觀測到的線粒體自噬小體，提示著細胞處于線粒體自噬狀態(tài)。由于P62蛋白的降低是由于自噬過程中被降解，而不是表達被抑制，因此，其mRNA表達的升高進一步說明大量的P62被降解，也印證了細胞處于線粒體自噬狀態(tài)。當電鏡觀測到線粒體自噬溶酶體時，表面此時已處于自噬后期，溶酶體包裹線粒體進行消化降解，當觀測到脂滴時，表明自噬已結束，受損線粒體已被清除。

基于此，在本實驗中，模型組的線粒體損傷較重，可觀測到線粒體腫脹、空泡變性和嵴消失等損傷現(xiàn)象，且其在缺血再灌注造模后第1天時，并未發(fā)生或僅少量發(fā)生線粒體自噬現(xiàn)象，在第3、第7天時有較多線粒體自噬現(xiàn)象發(fā)生，且第7天時自噬中期、自噬后期同時存在。各給藥組均在第1天時即有較高的線粒體自噬程度，第3天時已處于自噬后期，第7天時線粒體自噬已基本結束。結合Western blot及RT-PCR結果顯示，壯通飲、阿司匹林陽性對照干預能夠促進線粒體自噬的發(fā)生，且壯通飲聯(lián)合阿司匹林組對線粒體自噬的調(diào)控水平更高。

缺血性腦卒中發(fā)病率、死亡率、致殘率、復發(fā)率高，嚴重影響患者的生活，加重社會負擔。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后前3天小鼠處于缺血病理加重狀態(tài)，考慮與腦缺血再灌注損傷后3～5 d處于腦水腫高峰期的病理過程以及再灌注損傷引起鈣離子超載、自由基大量產(chǎn)生的病理改變有關。缺血再灌注后，神經(jīng)細胞的線粒體自噬即被激活，但前3天時的激活程度不足以有效清除受損的線粒體，維持細胞內(nèi)線粒體穩(wěn)態(tài)，從而無法遏制細胞損傷加重，3天以后線粒體自噬水平被進一步激活，受損線粒體得以有效清除，死亡的細胞被吞噬清理，剩下的神經(jīng)細胞內(nèi)線粒體穩(wěn)態(tài)得以恢復，再灌注損傷得到代償減輕。而壯醫(yī)經(jīng)驗方壯通飲，能夠緩解缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺損，減少梗死面積，減少神經(jīng)細胞凋亡，并能在腦缺血再灌注后第1天時即較高水平的促進缺血缺氧神經(jīng)細胞的線粒體自噬，使受損的細胞器第1時間得到有效清除，維持細胞內(nèi)線粒體穩(wěn)態(tài)，挽救受損的神經(jīng)細胞，減輕再灌注損傷。表明壯通飲可能是通過促進線粒體自噬途徑保護神經(jīng)細胞，且阿司匹林聯(lián)用壯通飲能夠取得更好的療效。

壯通飲能夠緩解腦缺血再灌注模型小鼠腦缺血再灌注后的體質(zhì)量下降及運動神經(jīng)功能缺損癥狀，提高存活率，減少神經(jīng)細胞凋亡，減輕病理改變，減小梗死面積，這可能與促進神經(jīng)細胞發(fā)生線粒體自噬，維持細胞內(nèi)線粒體穩(wěn)態(tài)有關。壯通飲與阿司匹林組之間未見明顯差異，而壯通飲聯(lián)合阿司匹林組療效稍優(yōu)于單獨使用壯通飲或阿司匹林，臨床上值得考慮在基礎治療上加用壯通飲以協(xié)助患者獲得最大治療收益。

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