Smad7介導(dǎo)TGF-β信號通路對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響

郭澤媛，杜張勝，張雅琦，陳春路，馬曉燕，成穎，王鍇，呂麗華

介導(dǎo)TGF-β信號通路對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響

郭澤媛，杜張勝，張雅琦，陳春路，馬曉燕，成穎，王鍇，呂麗華

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801

【目的】卵泡發(fā)育是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，其中綿羊卵泡顆粒細(xì)胞（granulosa cells, GCs）的增殖，分化會直接影響卵泡的發(fā)育狀況。TGF-β信號通路在綿羊卵巢發(fā)育和卵泡生長過程中起著重要作用，作為TGF-β信號通路關(guān)鍵性的抑制基因也發(fā)揮重要作用，通過探究介導(dǎo)TGF-β信號通路對綿羊卵泡 GCs增殖凋亡的影響，為進(jìn)一步研究在卵泡GCs增殖凋亡過程中的調(diào)控作用提供依據(jù)。【方法】選取4—6月齡未懷孕的晉中健康杜湖雜交母羊20只，屠宰后采集雙側(cè)卵巢組織，分離培養(yǎng)卵泡顆粒細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光鑒定，細(xì)胞免疫熒光的表達(dá)定位，CCK8法測定細(xì)胞增殖情況，繪制生長曲線；細(xì)胞傳代后外源添加不同濃度激動劑積雪草苷（asiaticoside，AS）（0、100、200、400、600 ng·mL-1）培養(yǎng)綿羊卵泡GCs，選擇AS最佳作用濃度處理二代顆粒細(xì)胞，采用實(shí)時熒光定量PCR和Western blotting檢測TGF-β信號通路中關(guān)鍵基因及細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)基因表達(dá)水平；合成3個siSmad7，轉(zhuǎn)染至卵泡GCs中，選擇干擾效果最佳的，采用實(shí)時熒光定量PCR和Western blotting檢測TGF-β信號通路中關(guān)鍵基因及細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)基因表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】在綿羊卵泡GCs中有表達(dá)；200 ng·mL-1AS能極顯著上調(diào)在GCs的表達(dá)（＜0.01），siSmad7-1對綿羊卵泡GCs的轉(zhuǎn)染效果最佳（＜0.01）；上調(diào)能顯著增加TGF-β信號通路，和的表達(dá)量（＜0.05），極顯著增加TGF-β信號通路的表達(dá)（＜0.01），顯著增加凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量（＜0.05），極顯著增加凋亡相關(guān)基因和的表達(dá)量（＜0.01），顯著升高細(xì)胞周期相關(guān)基因和的表達(dá)量（＜0.05），極顯著升高細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)量（＜0.01），而的表達(dá)量顯著降低（＜0.05）；siRNA顯著降低TGF-β信號通路，和的表達(dá)量（＜0.05），極顯著降低TGF-β信號通路的表達(dá)量（＜0.01），顯著降低凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量（＜0.05），極顯著降低凋亡相關(guān)基因和的表達(dá)量（＜0.01），極顯著降低細(xì)胞周期相關(guān)基因，和的表達(dá)量（＜0.01），極顯著升高的表達(dá)量（＜0.01）；CCK8分析顯示，上調(diào)，GCs的增殖率在24和48 h顯著下調(diào)（＜0.01），siRNA在24和72 h顯著升高GCs的增殖率（＜0.05），在48 h極顯著升高GCs的增殖率（＜0.01）。【結(jié)論】介導(dǎo)TGF-β信號通路抑制綿羊卵泡GCs增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

積雪草苷；siRNA；；TGF-β信號通路；綿羊；顆粒細(xì)胞

0 引言

【研究意義】顆粒細(xì)胞作為哺乳動物卵巢卵泡的重要組成部分，在維持雌性動物生殖功能中起著重要作用[1]。顆粒細(xì)胞的增殖分化可促進(jìn)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟，其凋亡是卵泡閉鎖的主要原因，而其抗氧化能力也有利于保護(hù)卵母細(xì)胞免受氧化損傷[2-4]。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族是哺乳動物中最大和最重要的生長因子家族之一，廣泛參與生殖調(diào)節(jié)[5]。TGF-β信號通路中斷會導(dǎo)致生殖障礙和癌癥的發(fā)展[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Smad蛋白是TGF-β信號通路的細(xì)胞內(nèi)組成部分。在哺乳動物中，已經(jīng)鑒定出8種Smad蛋白，并被分為受體調(diào)控的SMADs（SMAD1、2、3、5和8）、常見的SMAD（SMAD4）和抑制性SMADs（SMAD6和SMAD7）；其中Smad7是Smad信號蛋白家族中的抑制型亞家族，對TGF-β信號通路起負(fù)調(diào)節(jié)作用[7-8]。TGF-β/Smads信號通路在卵泡生長發(fā)育過程中有重要的調(diào)控作用。積雪草苷（asiaticoside，AS）是由積雪草中提取的一種三萜類化合物，是的激動劑，能顯著上調(diào)的表達(dá)量。TANG等[9]的研究表明AS能增加Smad7蛋白和mRNA的表達(dá)。QUEZADA等[10]的研究表明主要定位于卵母細(xì)胞，而在腔前和腔卵泡的卵泡細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)一步研究也表明介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)的小鼠顆粒細(xì)胞凋亡，表明的失調(diào)可能損害卵泡形成。李碧筠等研究表明抑制山羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和雌二醇分泌，促進(jìn)凋亡和孕酮的合成，并且抑制、的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育與閉鎖。GAO等[11]的研究確定了是小鼠顆粒細(xì)胞中關(guān)鍵TGF-β超家族信號的負(fù)調(diào)控因子。【本研究切入點(diǎn)】近年來，對于綿羊卵泡發(fā)育過程已有較多研究，然而抑制性Smads的作用仍然是這一領(lǐng)域缺失的部分，關(guān)于在綿羊卵泡GCs中的發(fā)育中的作用機(jī)制尚未見報道。因此，本研究意在探討在卵巢TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以綿羊卵泡GCs為研究對象，對在綿羊卵泡GCs中進(jìn)行定位。通過外源添加AS和轉(zhuǎn)染siRNA，進(jìn)而探究對TGF-β信號通路關(guān)鍵因子和對細(xì)胞增殖、凋亡和周期相關(guān)基因的影響。研究結(jié)果可進(jìn)一步為在綿羊卵泡中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織材料

2021年11月，在山西省晉中市太古區(qū)綿羊屠宰基地挑選4—6月齡體況良好的健康母羊20頭，屠宰后采集有不同大小卵泡的雙側(cè)卵巢，剪去多余的組織，酒精消毒，放入滅菌的4 ℃DPBS緩沖液中，在冰上30 min內(nèi)運(yùn)至山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

Smad7 Rabbit pAb 購于ABclonal公司；β-actin polyclonal antibody購于BioWorld（美國）；Asiaticoside（積雪草苷）購于MedChenExpress公司；PBS 緩沖液購于索萊寶（北京）；雙抗購于索萊寶（北京）；DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液購于博士德（武漢）；胎牛血清（FBS）購于CellMax（澳大利亞）；胰蛋白酶購于Gibco（美國）；二甲基亞砜（DMSO）購于索萊寶；RNAiso Plus購于Takara（日本）；PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser購于Takara；TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 購于Takara；CCK-8購于Dojindo（日本）；4%多聚甲醛購于博士德；FITC-goat anti-rabbit IgG購于博士德；蛋白上樣緩沖液購于博士德，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于索萊寶；LipoFiter 3.0TM購于漢恒（上海）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綿羊卵泡GCs的收集和培養(yǎng) 卵巢用滅菌的DPBS沖洗干凈，分離直徑為3—5 mm的卵泡，放入盛有DMEM/F12培養(yǎng)液的表面皿中，逐一將其剪開并用刮刀輕輕刮取卵泡內(nèi)的GCs，用細(xì)胞篩過濾除去組織雜質(zhì)，收集培養(yǎng)液于無菌的EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，將GCs重懸于完全培養(yǎng)基中，在37 ℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁GCs長滿培養(yǎng)皿后可進(jìn)行傳代和凍存。

1.3.2 卵泡顆粒細(xì)胞的鑒定與在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)定位 將無水乙醇浸泡的蓋玻片放入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)獲得的貼壁細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)，按1×105個/mL密度取一滴細(xì)胞懸液滴加到蓋玻片上，并將整個6孔板置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜爬片。次日，棄培養(yǎng)基，PBS清洗3次，每次5 min。每孔加500 μL 4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次；后向6孔板中加500 μL 1% TritonX-100溶液通透30 min，PBS清洗3次；每孔中加入500 μL 1% BSA溶液封閉1 h，PBS清洗1次；每孔中加入200 μL rabbit anti-Smad7和rabbit anti-FSHR稀釋液，陰性對照加 200 μL PBS，4 ℃過夜孵育；回收一抗，PBS清洗3次，每次5 min；FITC-goat anti-rabbit IgG稀釋液避光孵育1 h，PBS避光清洗3次，每次5 min；加入DAPI染液避光孵育20 min后再次清洗3次，使用倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.3 AS處理和siRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞 將GCs接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞密度長到80%時，向細(xì)胞中添加不同濃度（0、100、200、400、600 ng·mL-1）的的激動劑Asiaticoside，每個濃度的培養(yǎng)孔做3個技術(shù)重復(fù)，48 h后提取RNA。

用于基因干擾試驗(yàn)的及無義序列siRNA（NC）由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)及合成，這些RNA的序列如下：siSmad7-1：5′-CCAGAUACC CGAUGGAUUUTT-3′，siSmad7-2：5′-UGGCAUACUG GGAGGAGAATT-3′，siSmad7-3：5′?CAGAAAGUAC GGAGCAAAATT-3′，Negative Control：5′-UUCUCCG AACGUGUCACGUTT-3′。將顆粒細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%以上，參照LipoFiter 3.0TM說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

1.3.4 CCK8檢測細(xì)胞增殖 顆粒細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿時，消化、計(jì)數(shù)，按1×105個/mL密度接種于96孔板，放置在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。在細(xì)胞中添加激動劑與小干擾，分為對照組和試驗(yàn)組，將培養(yǎng)板放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48 和 72 h。等細(xì)胞試驗(yàn)處理完畢后，向每個孔加入CCK-8試劑10 μL，在此過程中盡量不要產(chǎn)生氣泡。將96孔板繼續(xù)放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，之后用酶標(biāo)儀測定其在450 nm處的吸光度。

1.3.5 總RNA提取和cDNA合成 Trizol法提取總RNA，提取步驟按RNAiso Plus試劑盒說明書進(jìn)行。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明書合成cDNA。

1.3.6 引物的合成 在NCBI中設(shè)計(jì)定量引物并由上海生工合成，引物信息如表1所示。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物

1.3.7 qRT-PCR 培養(yǎng)試驗(yàn)中的cDNA為模板，根據(jù)TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒的操作說明建立qRT-PCR反應(yīng)體系。使用CFX Connect TM Real-Time System 進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95°C 30 s，95°C 5 s，60°C 30 s，總共40個循環(huán)。之后進(jìn)行熔解曲線分析，驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的純度。根據(jù)閾值循環(huán)（CT）值計(jì)算各基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)量。

1.3.8 Western blotting檢測 提取GCs的總蛋白，用BCA測定總蛋白濃度，根據(jù)SDS-PAGE Gel Kit說明書配置10%的分離膠和5%的濃縮膠，蛋白上樣緩沖液與蛋白樣品以1﹕4比例混合，100 ℃ 10 min蛋白變性后，上樣至凝膠加樣孔，上樣量為20 μL，80 V 30 min濃縮膠電泳；120V 50min分離膠電泳。將目的條帶所在的膠條進(jìn)行割膠，與NC膜貼合，100 V 90 min，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜電泳。5 %封閉蛋白干粉封閉90 min。一抗4 ℃孵育過夜14 h，試驗(yàn)組Smad7兔抗以1﹕1 000稀釋，對照組一抗β-actin兔多克隆抗體以1﹕10 000稀釋，TBST清洗10 min，重復(fù)3次；二抗室溫孵育90 min，以1﹕15 000稀釋，TBST清洗10 min，重復(fù)3次；NC膜在凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。采用ImageJ軟件對Western blot蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt的計(jì)算方法，將各個目的基因與內(nèi)參基因的CT值按照2-ΔΔCt算法，得出相對表達(dá)量。Western blotting結(jié)果用ImageJ軟件對Western blotting蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，得出相對表達(dá)量。利用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)的方法，所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）”表示，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 顆粒細(xì)胞的免疫熒光鑒定

DAPI染液使細(xì)胞核呈藍(lán)色，F(xiàn)SHR的一抗和二抗的結(jié)合使含有 FSHR 蛋白的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。將不同激發(fā)光下的圖像混合發(fā)現(xiàn)所有細(xì)胞均帶有綠色熒光（圖1）。GCs 特異性FSHR 的表達(dá)證明試驗(yàn)采集的原代 GCs 純度較高，不含其他雜細(xì)胞。

2.2 Smad7在綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中的定位

細(xì)胞免疫熒光結(jié)果如圖2所示，表明在顆粒細(xì)胞表面有較強(qiáng)的陽性信號，說明在在綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中有表達(dá)。

圖1 綿羊GCs免疫熒光鑒定

圖2 綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中Smad7免疫熒光定位

2.3 激動劑和siRNA對卵泡顆粒細(xì)胞Smad7表達(dá)的影響

激動劑和siRNA對卵泡GCs表達(dá)的影響見圖3-A，添加激動劑后mRNA的相對表達(dá)量在100、200、400和600 ng·mL-1均升高，在100 ng·mL-1差異顯著（＜0.05），在200和400 ng·mL-1差異極顯著（＜0.01），在600 ng·mL-1時差異不顯著。結(jié)果表明，AS可以使mRNA的相對表達(dá)量明顯升高，在200 ng·mL-1時，的mRNA相對表達(dá)量最大。Western blotting的結(jié)果也表明，在200 ng·mL-1時，Smad7蛋白表達(dá)量與對照組相比極顯著差異升高（＜0.01）（圖4）。由圖3-B可見，轉(zhuǎn)染siRNA后，siSmad7-1和siSmad7-2與Negative siRNA相比的相對表達(dá)量極顯著降低（＜0.01），siSmad7-3的的相對表達(dá)量顯著降低（＜0.05），表明siSmad7-1，siSmad7-2和siSmad7-3均干擾Smad7 mRNA的表達(dá)量，且siSmad7-1的干擾效果最好。Western blotting的結(jié)果表明：siSmad7-1中Smad7蛋白表達(dá)量與對照組相比顯著降低（＜0.05）（圖5）。

* 表示P＜0.05表示差異顯著，**表示P＜0.01表示差異極顯著。下同

圖4 200 ng·mL-1 AS處理綿羊卵泡GCs后對Smad7蛋白表達(dá)的影響

2.4 Smad7對TGF-β信號通路的影響

上調(diào)，TGF-β信號通路下游基因的表達(dá)量與對照組相比極顯著上升（＜0.01），，和的表達(dá)量與對照組相比顯著升高（＜0.05）（圖6-A）；siRNA組和表達(dá)量與對照組相比顯著降低（＜0.05），的表達(dá)量與對照組相比極顯著降低（＜0.01）（圖6-B）。

圖5 siSmad7-1處理綿羊卵泡GCs后對Smad7蛋白表達(dá)的影響

圖6 Smad7對TGF-β信號通路相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

2.5 Smad7對綿羊顆粒細(xì)胞增殖的影響

采用CCK-8檢測處理綿羊卵泡顆粒細(xì)胞后在0、24、48和72 h的OD值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。如圖7-A所示，上調(diào)后，24和48 h的細(xì)胞增殖率極顯著低于對照組（＜0.01）；在圖7-B中，siRNA，在24和72 h的細(xì)胞增殖率顯著高于對照組（＜0.05），在48 h細(xì)胞增殖率極顯著高于對照組（＜0.01）。

圖7 Smad7上調(diào)和下調(diào)對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖率的影響

2.6 Smad7對綿羊GCs周期的影響

為探究對綿羊卵泡GCs周期的影響，通過qRT-PCR檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)。如圖8所示，上調(diào)時和與對照組相比表達(dá)量顯著升高（＜0.05），表達(dá)量極顯著升高（＜0.01），但的表達(dá)量與對照組相比顯著降低（＜0.05，圖8-A）；siRNA組和的相對表達(dá)量與對照組相比極顯著降低（＜0.01），的表達(dá)量與對照組相比極顯著升高（＜0.01，圖8-B）。

圖8 Smad7上調(diào)和下調(diào)對綿羊卵泡GCs周期相關(guān)基因的影響

2.7 Smad7對綿羊顆粒細(xì)胞凋亡的影響

對綿羊GCs中凋亡相關(guān)基因的影響如圖9所示，在圖9-A中和的表達(dá)量極顯著升高（＜0.01），的表達(dá)量顯著升高（＜0.05）；在圖9-B中，和的表達(dá)量極顯著降低（＜0.01），的表達(dá)量顯著降低（＜0.05）。

圖9 Smad7對綿羊卵泡GCs凋亡相關(guān)基因的影響

3 討論

3.1 Smad7在綿羊卵泡GCs中的定位表達(dá)

在哺乳動物卵巢中，超過99%的卵泡發(fā)生退行性閉鎖，而在卵巢卵泡發(fā)育過程中，只有少數(shù)卵泡發(fā)生排卵。GCs在卵泡發(fā)育和閉鎖中具有重要作用，而GCs的凋亡與卵泡閉鎖密切相關(guān)[3]。編碼一個屬于TGF-β超家族的I-Smad，是TGF-β信號通路中的一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中具有重要作用，對于女性生殖各方面都是很重要的[12-13]。LIU等[14]研究表明沉默可以降低豬GCs的凋亡，李碧筠等[15]研究表明抑制山羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖。TIAN等[16]研究發(fā)現(xiàn)定位于小鼠卵母細(xì)胞，是在GCs中的定位、調(diào)控和功能的首次報道，提示對卵巢發(fā)育過程存在調(diào)節(jié)作用。作為確定潛在卵巢功能的第一步，本研究檢測了在綿羊卵泡GCs中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在綿羊卵泡GCs有表達(dá)，這與QUEZADA等[10]研究在小鼠卵泡GCs中表達(dá)的研究結(jié)果一致，說明在綿羊卵泡發(fā)育過程中起到的重要作用。

3.2 smad7介導(dǎo)TGF-β信號通路的作用機(jī)制

現(xiàn)代臨床及藥理研究顯示：積雪草主含積雪草甙、羥基積雪草甙、羥基積雪草酸、積雪草酸等多種三萜類化合物，目前臨床主要用于治療及預(yù)防燒傷、外傷、手術(shù)等所致瘢痕增生，以及傳染性肝炎，流行性腦脊髓膜炎、慢性腎炎等病的治療[17]。LEE等[18]研究發(fā)現(xiàn)AS的作用與Smad信號通路相關(guān)，TANG等[9]研究也證實(shí)，在疤痕組織中，AS抑制膠原增生的機(jī)制主要是通過增加的表達(dá)，進(jìn)而抑制TGF-βR1的病理性作用，使成纖維細(xì)胞增殖受阻。為了進(jìn)一步研究在綿羊卵泡GCs中的作用，通過外源添加AS使mRNA表達(dá)量上調(diào)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源添加AS，使mRNA相對表達(dá)量均顯著升高，這與QI等[19]研究發(fā)現(xiàn)AS能顯著增強(qiáng)抑制性的表達(dá)的結(jié)果一致。

TGF-β家族的生長因子在維持卵巢細(xì)胞的生長和分化中發(fā)揮著重要作用[20]，TGF-β/Smad信號通路是調(diào)控哺乳動物卵泡生長發(fā)育和GCs增殖凋亡的主要通路[21]。TGF-β/Smads信號通路是由細(xì)胞外配體、細(xì)胞表面特異受體及細(xì)胞內(nèi)Smads信號傳導(dǎo)分子共同組成的，它們之間會形成緊密聯(lián)系的級聯(lián)反應(yīng)，最終將細(xì)胞外信號傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)。TGF-β/Smads通路中I-Smads通過阻斷R-Smad和Co-Smad的激活，與活化的受體或受體激活的Smads競爭性結(jié)合形成無活性復(fù)合物來負(fù)調(diào)控此信號通路[22]。在小鼠和豬等哺乳動物的卵巢GCs中，激活TGF-β信號通路可增強(qiáng)GCs增殖，抑制GCs凋亡[23-25]，而TGF-β信號通路失活導(dǎo)致GCs凋亡和濾泡閉鎖[26]。Smad7屬于抑制型Smad蛋白，大量實(shí)驗(yàn)證明其作為內(nèi)源性TGF-β拮抗劑從而產(chǎn)生抑制TGF-β/Smad信號通路的結(jié)果，可與或競爭結(jié)合TGF-βRⅠ或，抑制/磷酸化及向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，還可誘導(dǎo)與TGF-βR-I的泛素-蛋白酶體降解，通過E3泛素連接酶-Smad泛素化調(diào)節(jié)因子（Smuf1和Smurf2）從而對TGF-β1/Smad通路產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)作用[27]。TGF-β/Smad信號通路已有較多研究，但仍有許多未研究的領(lǐng)域。本試驗(yàn)主要通過上調(diào)和下調(diào)的表達(dá)量，檢測TGF-β/Smad信號通路下游關(guān)鍵基因表達(dá)量，進(jìn)而研究在TGF-β/Smad信號通路中的作用。研究結(jié)果表明：mRNA相對表達(dá)量上調(diào)后，的表達(dá)量與對照組相比極顯著上升，，和的表達(dá)量與對照組相比顯著升高；mRNA相對表達(dá)量被干擾后，，，和表達(dá)量與之相反。PANGAS等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢中特異性敲除導(dǎo)致小鼠卵泡功能早衰，GCs過早黃體化，生育能力下降。的表達(dá)量與對照組相比顯著上調(diào)，信號通路下游的基因（transcription factor Dp-1），（轉(zhuǎn)錄因子特殊蛋白因子1，transcription factor Sp1）和與對照組相比差異顯著，說明介導(dǎo)TGF-β信號通路對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞有一定的調(diào)控作用。是TGF-β信號通路的下游基因，家族蛋白作為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的重要分子，正常情況下和E2F家族基因以二聚體的形式發(fā)揮作用，并且受到口袋蛋白RB和p107的調(diào)控[29-30]。屬于SP/Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子（Sp-like and Kruppel-like transcription factors, Sp/KLFS）家族，是該家族第1個被發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子[31]。姚一龍等[32]研究表明湖羊可抑制卵巢GCs增殖、誘導(dǎo)凋亡。EP300和CBP（cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白）作為轉(zhuǎn)錄共激活因子通過和不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，參與調(diào)控靶基因表達(dá)，蛋白表達(dá)變化影響細(xì)胞許多基本功能，包括增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和DNA損傷反應(yīng)等，進(jìn)而影響了細(xì)胞表型[33]。

3.3 smad7介導(dǎo)TGF-β信號通路調(diào)控GCs增殖與凋亡

TGF-β/Smad信號通路是調(diào)控哺乳動物卵泡生長發(fā)育和GCs增殖凋亡的主要通路[21]。是TGF-β信號通路的特異性抑制劑，并在體內(nèi)和體外阻斷TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[34-35]。Liu等[14]研究表明沉默降低豬GC細(xì)胞的凋亡，是GCs中一種促凋亡因子。本試驗(yàn)中通過CCK8檢測上調(diào)和下調(diào)對細(xì)胞增殖率的影響，上調(diào)降低了綿羊卵泡GCs的增殖，siRNA的結(jié)果則與之相反。與前人研究-SiRNA提高豬卵巢GCs的活力，促進(jìn)GCs增殖的研究結(jié)果一致[36]。P21和P27蛋白是重要的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，通過特定分子機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和抑制細(xì)胞增殖[37-38]。細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin DI，CCNDI）和細(xì)胞周期蛋白D2（Cyclin D2，CCND2）是細(xì)胞周期蛋白D型家族（CyclinDs，CCNDs）中的成員，是細(xì)胞有絲分裂G1期到S期的限速因子，能強(qiáng)制性誘導(dǎo)細(xì)胞通過G1期限制點(diǎn)進(jìn)入S期，正向調(diào)控細(xì)胞周期，加快增殖[39]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，上調(diào)，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，和與對照組相比顯著升高，的表達(dá)量與對照組相比顯著降低，而當(dāng)被干擾時，結(jié)果與之相反。這表明，在綿羊卵泡GCs發(fā)育過程中，通過調(diào)控周期相關(guān)基因而影響細(xì)胞的增殖和凋亡。

細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。優(yōu)勢卵泡選擇和卵泡閉鎖是通過GCs凋亡來實(shí)現(xiàn)[40-41]。Caspase家族成員也參與程序性細(xì)胞死亡的過程，某些Caspases缺失導(dǎo)致細(xì)胞凋亡嚴(yán)重缺陷[42]。Caspase3作為凋亡途徑下游，導(dǎo)致底物酶解的蛋白酶，是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行者。在本研究中，通過調(diào)節(jié)的表達(dá)，從而影響，和的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明在GCs凋亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Quezada等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠中，當(dāng)過表達(dá)時，GCs中的細(xì)胞凋亡明顯增加，而當(dāng)被沉默時，GCs中TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被阻斷。

4 結(jié)論

在綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中有表達(dá)；介導(dǎo)TGF-β信號通路抑制綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。該結(jié)果可為在綿羊卵泡中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

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Effects of Smad7-Mediated TGF-β Signaling Pathway on Proliferation of Sheep Granulosa Cells

GUO ZeYuan, DU ZhangSheng, ZHANG YaQi, CHEN ChunLu, MA XiaoYan, CHENG Ying, WANG Kai, Lü LiHua

College of Animal Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi

【Background】Follicle development is a complex regulatory process, in which the proliferation and differentiation of ovine follicular granulosa cells (Granulosa Cells, GCs) will directly affect the development of follicles. TGF-β signaling pathway plays an important role in sheep ovarian development and follicle growth, andalso plays an important role as a key inhibitor of TGF-β signaling pathway. 【Objective】In this study, the effect of-mediated TGF-β signaling pathway on the proliferation and apoptosis of ovine follicular GCs was explored to provide a basis for further research on the regulatory role of【Method】20 non-pregnant Jinzhong Duhu hybrid ewes aged 4-6 months were selected. After slaughtering, bilateral ovaries were collected, and GCs were isolated and cultured in vitro. And then,cell and expression localization ofcells was identified by immunofluorescence, the cell proliferation was measured by CCK8 method, and the growth curve was drawn. After the cells were passaged, different concentrations ofagonist Asiaticoside AS (0, 100, 200, 400, 600 ng·mL-1) were added exogenously, and the optimal concentration of AS was selected to treat the second generation GCs. The expression levels of key genes as well as apoptosis and cycle-related genes in the TGF-β signaling pathway were detected using qRT-PCR and Western blotting. Three siSmad7s were synthesized and transfected into follicular GCs, and the one with the best interference effect was selected. The expression levels of key genes in the TGF-β signaling pathway, apoptosis and cycle-related genes were detected by qRT-PCR and Western blotting. 【Result】was expressed in ovine follicular GCs; 200 ng·mL-1AS could significantly up-regulate the expression of＜0.01), siSmad7-1 could effectively transfected ovine follicle GCs (＜0.01); Up-regulation ofcould significantly increase the expressions of,and＜0.05), extremely significantly increase the expression of＜0.01), and significantly increase the expression of apoptosis-related gene(＜0.05), extremely significantly increased the expressions of apoptosis-related genesand(＜0.01), significantly increased the expressions of cell cycle-related genesand(＜0.05), extremely significantly increased the expression of cell cycle-related gene(＜0.01), while the expression ofwas significantly decreased (＜0.05);siRNA significantly decreased the expressions of,and＜0.05), extremely significantly decreased the expression of＜0.01), and significantly decreased the apoptosis-related gene(＜0.05), extremely significantly decreased the expressions of apoptosis-related genesand(＜0.01), extremely significantly decreased the expressions of cell cycle-related genes,and(＜0.01), extremely significantly increased the expression of(＜0.01); CCK8 analysis demonstrated into that whenwas up-regulated, the proliferation rate of GCs was significantly down-regulated at 24 h and 48 h (＜0.01).siRNA significantly increased the proliferation rate of GCs at 24 h and 72 h (＜0.05), which also extremely significantly increased the proliferation rate of GCs (＜0.01).【Conclusion】In summary, it was suggested thatmediated TGF-β signaling pathway to inhibit the proliferation of ovine follicular GCs and to promote cell apoptosis.

asiaticoside (AS); siRNA;; TGF-β signaling pathway; sheep; granulosa cells

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.13.013

2022-05-06；

2023-02-13

山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（20210302123393）、山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金、大同市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（農(nóng)業(yè)，2021027）

郭澤媛，E-mail：gzy15581741973@163.com。通信作者呂麗華，E-mail：lihualvsxau@126.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）