夏水英 孫全敏 王嚴(yán) 袁文濤 遲乃玉 張慶芳

摘要：為探究發(fā)酵菜在不同發(fā)酵階段的菌群結(jié)構(gòu)，解析優(yōu)勢乳酸菌與功能代謝的關(guān)系，該研究采用小型獨(dú)立發(fā)酵體系制備發(fā)酵菜，以大白菜發(fā)酵液及其平板培養(yǎng)物為研究對象，利用高通量測序技術(shù)，通過生物信息學(xué)、Alpha多樣性分析，解析發(fā)酵過程中的菌群結(jié)構(gòu)并挖掘優(yōu)勢乳酸菌與功能代謝的關(guān)系。研究表明，物種多樣性隨發(fā)酵的進(jìn)行逐漸降低。在發(fā)酵湯汁中，Chryseobacterium（金黃桿菌屬）、uncultured_Bacterium_f_Enterobacteriaceae（未培養(yǎng)的腸桿菌屬）、Lactobacillus（乳桿菌屬）分別在發(fā)酵12 h、24 h和15 d占據(jù)絕對優(yōu)勢；在優(yōu)勢菌中，Lactobacillus（乳桿菌屬）與Carbohydrate metabolism（碳水化合物代謝）、Transcription（轉(zhuǎn)錄）等代謝途徑呈正相關(guān)；Leuconostoc（明串株菌屬）與Infectious diseases：Bacterial（細(xì)菌性傳染?。?、Nucleotide transport and metabolism（核苷酸代謝與運(yùn)輸）等代謝途徑呈正相關(guān)；Lactococcus（乳球菌屬）與Amino acid metabolism（氨基酸代謝）、Cell wall/membrane/envelope biogenesis（細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/膜結(jié)構(gòu)的生物合成）等代謝途徑呈正相關(guān)。該研究闡明了發(fā)酵菜中優(yōu)勢乳酸菌與功能代謝的關(guān)系，為后續(xù)發(fā)酵菜風(fēng)味的改善、發(fā)酵工藝的改良提供了新思路，為研發(fā)最佳菌種配比的發(fā)酵菌劑提供了參考。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵菜；小型獨(dú)立發(fā)酵體系；優(yōu)勢乳酸菌；功能代謝途徑；高通量測序技術(shù)

中圖分類號：TS201.3????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2023）08-0050-10

Analysis of Bacterial Community Structure and Functional Metabolism in

Fermented Vegetables Prepared by Small Independent Fermentation System

XIA Shui-ying1，2， SUN Quan-min1，2， WANG Yan1，2， YUAN Wen-tao1，2， CHI Nai-yu1，2， ZHANG Qing-fang1，2*

（1.School of Life and Health， Dalian University， Dalian 116622， China; 2.Liaoning Marine

Microbial Engineering Technology Research Center， Dalian 116622， China）

Abstract： In order to explore the bacterial community structure of fermented vegetables at different fermentation stages and analyze the relationship between dominant lactic acid bacteria and functional metabolism， in this study，a small-scale independent fermentation system is used to prepare fermented vegetables. With Chinese cabbage fermentation broth and its plate culture as the research objects， the bacterial community structure during fermentation process is analyzed， and the relationship between dominant lactic acid bacteria and functional metabolism is explored by using high-throughput sequencing technology， bioinformatics and Alpha diversity analysis. The results show that the species diversity decreases gradually as the fermentation goes on. In the fermentation broth， Chryseobacterium， uncultured_Bacterium_f_Enterobacteriaceae and Lactobacillus occupy absolute advantages at 12 h， 24 h and 15 d of fermentation respectively.Lactobacillus is positively correlated with the metabolic pathways

such as Carbohydrate metabolism and Transcription.Leuconostoc is positively correlated with the metabolic pathways such as Infectious diseases： Bacterial， Nucleotide transport and metabolism. Lactococcus is positively correlated with the metabolic pathways such as Amino acid metabolism， Cell wall/membrane/envelope biogenesis. In this study， the relationship between dominant lactic acid bacteria and functional metabolism in fermented vegetables is clarified， which has provided new? ideas? for the improvement of the flavor of fermented vegetables and fermentation process in the future， and provided references for the development of fermenting agents with the optimal proportion of strains.

Key words：fermented vegetables; small-scale independent fermentation system; dominant lactic acid bacteria; functional metabolic pathway; high-throughput sequencing technology

收稿日期：2023-02-19

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC0311100）

作者簡介：夏水英（1997－），女，碩士，研究方向：微生物及酶工程的基礎(chǔ)理論與應(yīng)用。

通信作者：張慶芳（1965－），女，教授，博士，研究方向：微生物及酶工程的基礎(chǔ)理論與應(yīng)用。

泡菜又稱發(fā)酵菜，由各類蔬菜經(jīng)乳酸發(fā)酵而成。我國泡菜歷史可以追溯到3 000年前，《詩經(jīng)》有云：“中田有廬，疆場有瓜，是剝是菹，獻(xiàn)之皇祖”，“瓜”有蔬菜之意，“菹”即鹽漬工藝，其中鹽漬蔬菜就是發(fā)酵菜的原型[1]。發(fā)酵菜的制作方法各地大同小異，傳統(tǒng)的方法是將新鮮的瓜果蔬菜洗凈，瀝干水分后裝壇，加入鹵水、冰糖、香辛料、調(diào)味料等，進(jìn)行自然發(fā)酵制得的。但隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，發(fā)酵菜的制作工藝也得到了進(jìn)一步優(yōu)化，主要通過控制發(fā)酵溫度[2]、pH值[3]、鹽濃度[4]、乳酸菌接種量[5]、接種不同菌劑[6]等來達(dá)到增產(chǎn)、改善品質(zhì)與口感的目的。成熟的發(fā)酵菜色澤鮮亮、呈草黃色、酸香濃郁、口感脆嫩，具有開胃、解膩和促消化的功效。近年來，有研究表明，發(fā)酵菜中的植物乳桿菌具有預(yù)防糖尿病[7]、抗肥胖[8]、抗鼠傷寒沙門氏菌感染[9]以及提高免疫力的作用[10]。

各地水質(zhì)、環(huán)境、氣候、溫度等差異賦予了發(fā)酵菜獨(dú)特的風(fēng)味與口感，其根源在于菌群結(jié)構(gòu)的差異。在發(fā)酵菜的發(fā)酵體系中，具有成千上萬甚至更多菌群，有益菌會產(chǎn)生對人體有益的代謝產(chǎn)物，腐敗菌則會產(chǎn)生不利于身體健康甚至致癌的物質(zhì)，例如亞硝酸鹽。根據(jù)我國國家標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)酵菜中亞硝酸鹽含量不得超過 20 mg/kg。當(dāng)亞硝酸鹽攝入超標(biāo)時，會導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥、維生素A缺乏癥與胎兒畸形，還會產(chǎn)生強(qiáng)致癌的N-亞硝基化合物，引發(fā)食道癌和胃癌等疾病[11]。正因?yàn)榘l(fā)酵菜的營養(yǎng)與危害由微生物的菌群結(jié)構(gòu)決定，所以近年來學(xué)者們專注于發(fā)酵體系的菌群結(jié)構(gòu)以及細(xì)菌多樣性的研究，而對發(fā)酵菜中優(yōu)勢菌群與功能代謝的關(guān)系的研究在國內(nèi)鮮有報(bào)道，國外僅兩篇文章有與此相關(guān)的內(nèi)容。由于發(fā)酵菜的營養(yǎng)及風(fēng)味來自于微生物代謝，且乳酸菌在發(fā)酵體系中起主導(dǎo)發(fā)酵的作用，所以解析乳酸菌與功能代謝的關(guān)系對于改善發(fā)酵菜的風(fēng)味、豐富其營養(yǎng)、優(yōu)化發(fā)酵工藝和研發(fā)最佳菌種配比的發(fā)酵菌劑具有重要意義。

本研究以大白菜為原料，采用小型獨(dú)立發(fā)酵體系進(jìn)行自然發(fā)酵，選取發(fā)酵12 h、24 h、15 d的發(fā)酵菜湯汁與其平板培養(yǎng)物，進(jìn)行高通量測序，通過生物信息學(xué)的方法分析其多樣性與潛在功能，并對二者的菌群結(jié)構(gòu)、功能代謝進(jìn)行分析，解析了乳酸菌與功能代謝的關(guān)系，以期為改善發(fā)酵菜的品質(zhì)、發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐，為新型發(fā)酵菌劑的研發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

新鮮大白菜（大連91-12）；DP812土壤基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；16S rRNA基因V3～V4區(qū)引物合成及建庫測序：由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.1.2 培養(yǎng)基配方

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，蛋白胨 10 g，牛肉膏 10 g，酵母膏5 g，三水合乙酸鈉 5 g，檸檬酸氫二銨 2 g，四水磷酸氫二鉀 2 g，七水硫酸鎂 2 g，硫酸錳 0.05 g，吐溫80 1 mL，調(diào)pH為6.2～6.6，定容至1 000 mL。

MRS固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，每1 000 mL加20 g瓊脂，調(diào)pH為6.2～6.6， 于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。

1.1.3 儀器與設(shè)備

PHS-3E pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份技術(shù)有限公司；CRY-2112恒溫?fù)u床 上海茸研儀器有限公司；Thermo Multiskan 1510酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems公司；AL204天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-1200紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵制品的制備

采用小型獨(dú)立發(fā)酵體系進(jìn)行發(fā)酵。挑選新鮮、無病害、無枯葉的大白菜，用流水洗凈后瀝干，將白菜切成均勻的小塊（0.5～1 cm），將不同部分的小塊混勻，分別稱取160 g混勻的白菜小塊于若干統(tǒng)一規(guī)格為555 mL的無菌礦泉水瓶中，加入1.5%的鹽水至完全淹沒小塊，擰緊瓶蓋，置于恒溫箱中25 ℃發(fā)酵。工藝流程：新鮮、無病害的大白菜→清洗→瀝水→切塊混勻→裝瓶→注鹽水→封蓋→恒溫發(fā)酵。將發(fā)酵12 h、24 h、15 d的湯汁樣品分別命名為S2、S3、S5，將這組命名為S組。

1.2.2 發(fā)酵湯汁中微生物的培養(yǎng)

分別取10 mL發(fā)酵12 h、24 h、15 d的發(fā)酵菜湯汁，于90 mL無菌生理鹽水中，加入適量玻璃珠充分振蕩，使菌落分散均勻。吸取上述菌液1 mL于9 mL無菌生理鹽水試管中，再用另一支1 mL無菌移液管在該試管中吹吸數(shù)次，然后精確吸取1 mL菌液至下一試管內(nèi)，如此重復(fù)至稀釋到10-7，即得10-1～10-7的稀釋液。在無菌條件下選取3個適宜的稀釋梯度進(jìn)行平板涂布，在每個稀釋度的試管內(nèi)吸取200 μL菌液，均勻涂布，每個稀釋度做3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待長出明顯菌落后，將平板中的所有菌落轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期后，以3%的接種量二次轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中，設(shè)置3組重復(fù)，每12 h取樣測定其pH值、OD600 nm值。將發(fā)酵12 h、24 h、15 d的發(fā)酵湯汁平板培養(yǎng)物分別命名為J2、J3、J5，將這組命名為J組。

1.2.3 平板上菌落的轉(zhuǎn)接

取一個無菌鑷子，將長有菌落的整塊瓊脂培養(yǎng)基夾入裝有適量玻璃珠的液體培養(yǎng)基中，輕微振蕩瓶身，避免弄碎瓊脂，待所有菌落完全洗入液體培養(yǎng)基后，用無菌鑷子將瓊脂夾出。全過程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。

1.2.4 pH值的測定

每隔12 h，使用精密pH計(jì)直接測定湯汁與發(fā)酵液的pH值，取3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值為最終讀數(shù)。

1.2.5 OD600 nm值的測定

采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，取1 mL MRS液體培養(yǎng)液于9 mL無菌生理鹽水中稀釋至10-1倍，然后取200 μL稀釋后的發(fā)酵液于無菌96孔板中，在600 nm波長處測定其吸光度，取3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值為最終讀數(shù)。

1.2.6 發(fā)酵制品與平板培養(yǎng)物基因組DNA的提取

按照土壤基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣品DNA。將提取的樣品DNA經(jīng)純化后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.7 發(fā)酵制品湯汁與平板培養(yǎng)物高通量測序

以提取的DNA為模板，采用338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化構(gòu)建測序文庫，并對文庫進(jìn)行質(zhì)檢，將合格的文庫用 Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測序，測序任務(wù)委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.8 生物信息學(xué)分析

首先使用Trimmomatic軟件[12]對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾，然后使用Cutadapt軟件進(jìn)行引物序列的識別與去除，其后使用Usearch軟件[13]對雙端reads進(jìn)行拼接并去除嵌合體，最終得到高質(zhì)量的序列用于后續(xù)分析。

用Usearch軟件對相似度為97.0%的有效序列進(jìn)行聚類分析，獲得操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[13]。使用QIIME 2軟件進(jìn)行α多樣性分析。使用PICRUSt2軟件對發(fā)酵菜樣本中的微生物進(jìn)行基因功能預(yù)測，并比較樣本在不同功能之間存在的差異[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化特性差異分析

發(fā)酵過程中pH值與OD600 nm值變化曲線見圖1。

由圖1中a可知，J2、J3、S樣品的pH值均呈現(xiàn)下降的趨勢，J5樣品呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。其中J5樣品的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，在24 h時發(fā)酵液的pH值最低，為3.54，低于其他樣品的最低pH值，表明該樣品中含有大量耐酸菌，能夠在低pH值下繼續(xù)產(chǎn)酸；J3樣品產(chǎn)酸最快，發(fā)酵12 h時pH值降至4.19，低于其他樣品，表明該樣品中含有大量的產(chǎn)酸菌；S樣品在發(fā)酵前36 h，pH值高于其他3個樣品，在發(fā)酵36 h以后，pH值逐漸低于J2、J3樣品，但仍高于J5樣品，表明發(fā)酵湯汁中含有大量的雜菌，抑制了產(chǎn)酸菌的生長繁殖，當(dāng)?shù)蚿H值抑制雜菌生長時，產(chǎn)酸菌的生長抑制解除而大量產(chǎn)酸。由圖1中b可知，J2、J3、S樣品的OD600 nm均呈現(xiàn)上升趨勢，表明在發(fā)酵48 h時，體系環(huán)境（J2、J3、S的pH值分別為4.01，3.68，3.54）依舊適宜微生物生長。J5樣品的OD600 nm值在各個時間點(diǎn)均大于其余3個樣品，表明該樣品中耐酸菌的含量遠(yuǎn)大于其他樣品；且J5樣品的OD600 nm值在發(fā)酵24 h左右呈先升后降的趨勢，原因可能是24 h時pH值最低，超出了微生物的承受范圍，因此OD600 nm值下降，這一解釋與圖1中a相符合。

2.2 高通量測序質(zhì)量評估

本實(shí)驗(yàn)測序結(jié)果見表1。

6個樣品共獲得566 432條原始序列，經(jīng)過雙端序列質(zhì)量控制和拼接后共得到564 758條高質(zhì)量序列，再將高質(zhì)量序列進(jìn)行拼接、過濾和嵌合后共得到533 350條有效序列，每個樣品的有效序列數(shù)均在70 000條以上，序列的平均堿基長度≥426 bp，平均GC含量>50%，另外，所有樣本的測序質(zhì)量值Q20＞98%、Q30＞95%，有效序列占比＞92%。以上表明本測序結(jié)果數(shù)據(jù)可信。

2.3 稀釋曲線分析

稀釋曲線可以評估樣品的測序量以及飽和情況，也可以間接評價物種豐富度，其橫坐標(biāo)表示個體數(shù)，縱坐標(biāo)表示物種數(shù)。該方法通過逐步擴(kuò)大測序深度，從而觀察曲線的變化情況。隨著樣品測序深度的增加，曲線隨之上升，當(dāng)達(dá)到一定值時，增加測序深度，曲線趨于平緩，說明取樣量足夠，能覆蓋樣品的所有物種，從而真實(shí)有效地反映樣品中絕大多數(shù)物種信息[15]。

由圖2可知，S組中各樣品曲線均呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，而J組各樣品中，隨著測序深度的增加，曲線的斜率逐漸減小，但未達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，說明測序量未飽和，需進(jìn)一步擴(kuò)大測序深度。

2.4 Shannon指數(shù)曲線分析

Shannon指數(shù)能反映樣品中的物種多樣性，指數(shù)越大說明物種種類越多、越豐富，表明樣本中絕大多數(shù)的物種信息已被覆蓋[16]。Shannon指數(shù)曲線見圖3，各樣品Shannon指數(shù)均先隨著測序量的擴(kuò)大而增加，之后Shannon指數(shù)增加量逐漸減小，最終曲線趨于平穩(wěn)，表明測序量已達(dá)到飽和。此外，Shannon指數(shù)：S2>S3>S5>J2>J3>J5，表明發(fā)酵初期的物種豐富度與物種多樣性大于發(fā)酵后期。

2.5 細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

為明確發(fā)酵進(jìn)程中的物種豐富度，從而進(jìn)行細(xì)菌群落Alpha多樣性分析，結(jié)果見表2。

ACE指數(shù)、Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)合稱為Alpha多樣性指數(shù)，ACE指數(shù)與Chao 1指數(shù)可以用于衡量物種豐富度，指數(shù)越大說明樣品的物種豐富度越大；Shannon指數(shù)通常用于衡量樣品中的物種多樣性，Shannon指數(shù)越大，說明樣品的物種多樣性越高；覆蓋率則表示可觀測到的OUT數(shù)目，每個OUT數(shù)則對應(yīng)一個不同的微生物種。其中ACE指數(shù)和Chao 1指數(shù)表現(xiàn)為S2>S3>S5>J5>J3>J2，Shannon指數(shù)表現(xiàn)為S2>S3>S5>J2>J3>J5，表明S2樣品物種豐富度與物種多樣性最大，即發(fā)酵12 h的湯汁中，微生物數(shù)目和種類最多；各樣品的覆蓋率均大于99%，說明樣品中所有物種均能被檢測出，測序數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

2.6 物種組成與結(jié)構(gòu)的差異分析

為揭示發(fā)酵湯汁與平板培養(yǎng)物的菌群結(jié)構(gòu)差異，將發(fā)酵湯汁及其平板培養(yǎng)物進(jìn)行高通量測序，結(jié)果見表3，可以看出發(fā)酵湯汁中，發(fā)酵12 h的物種數(shù)明顯多于24 h與15 d時，此結(jié)果與前文所述相一致。

2.6.1 門水平上的菌群結(jié)構(gòu)差異

由圖4中a可知，門水平上，共注釋到9個菌門，兩體系菌群結(jié)構(gòu)組成差異顯著，且各菌門的相對豐度有所差異。由圖4中b可知，各發(fā)酵時間點(diǎn)各樣品之間菌群結(jié)構(gòu)及相對豐度有所差異。在S2樣品中相對豐度>1%的菌門有Firmicutes（25%）、Proteobacteria（36.43%）、Bacteroidetes（33.90%）、Cyanobacteria（4.08%），J2樣品中相對豐度>1%的僅有Firmicutes（80.36%）、Proteobacteria（19.32%）。在S3樣品中，F(xiàn)irmicutes（57.06%）、Proteobacteria（37.32%）、Bacteroidetes（1.05%）、Cyanobacteria（4.33%）占據(jù)優(yōu)勢，J3樣品僅Firmicutes（55.64%）、Proteobacteria（44.32%）占據(jù)優(yōu)勢。由此表明在發(fā)酵12 h與24 h時發(fā)酵湯汁中優(yōu)勢菌門相同，僅相對豐度存在差異，發(fā)酵湯汁與其平板培養(yǎng)物中菌群結(jié)構(gòu)與相對豐度存在顯著差異。在S5樣品中占據(jù)優(yōu)勢的菌門有Firmicutes（68.84%）、Proteobacteria（27.54%）和Cyanobacteria（2.95%），J5樣品中僅Firmicutes（98.48%）、Proteobacteria（1.08%）占據(jù)優(yōu)勢。由此表明，在發(fā)酵15 d后，發(fā)酵菜湯汁中優(yōu)勢菌群發(fā)生改變，推測由低pH值導(dǎo)致。綜上所述，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria、Cyanobacteria在發(fā)酵菜各發(fā)酵時間點(diǎn)均占據(jù)優(yōu)勢，Bacteroidetes僅在發(fā)酵12 h和24 h占據(jù)優(yōu)勢，其中Firmicutes在發(fā)酵進(jìn)程中呈上升趨勢，Proteobacteria和Cyanobacteria呈先上升后下降的趨勢，Bacteroidetes呈下降趨勢。

2.6.2 屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)差異

所有樣品共注釋到89個菌屬，本部分僅對相對豐度排名前十的物種進(jìn)行分析，見圖5。

由圖5中a可知，S組與J組間屬水平上菌群結(jié)構(gòu)組成及相對豐度差異顯著。由圖5中b可知，在屬水平上，各發(fā)酵時間點(diǎn)各樣品之間菌群結(jié)構(gòu)及其相對豐度差異明顯。在S2樣品中，相對豐度>1%的有uncultured_Bacterium_f_Enterobacteriaceae（28.49%）、Leuconostoc（10.11%）、Lactococcus（13.87%）、Chryseobacterium（33.14%）、uncultured_Bacterium_o_Chloroplast（4.08%）、Acinetobacter（2.77%）；在J2樣品中，Lactobacillus（58.24%）、uncultured_Bacterium_f_Enterobacteriaceae（17.55%）、Leuconostoc（17.16%）、 Lactococcus（4.93%）、Acinetobacter（1.76%）占據(jù)優(yōu)勢。由此可知，在發(fā)酵12 h時，發(fā)酵湯汁中Chryseobacterium占據(jù)絕對優(yōu)勢，平板培養(yǎng)物中Lactobacillus占據(jù)絕對優(yōu)勢。

在S3樣品中，優(yōu)勢菌屬（相對豐度>1%）有Lactobacillus（22.50%）、uncultured_Bacterium_f_Enterobacteriaceae（35.90%）、Leuconostoc（8.32%）、Lactococcus（25.15%）、uncultured_Bacterium_o_Chloroplast（4.33%）、Enterococcus（1.01%）；J3中僅uncultured_Bacterium_f_Enterobacteriaceae（44.27%）、Leuconostoc（44.78%）、Lactococcus（10.16%）為優(yōu)勢菌屬。由此可知，在發(fā)酵24 h時，發(fā)酵湯汁中uncultured_Bacterium_f_Enterobacteriaceae占據(jù)絕對優(yōu)勢，平板培養(yǎng)物中Leuconostoc占據(jù)絕對優(yōu)勢。在S5樣品中，Lactobacillus（44.50%）、uncultured_Bacterium_f_Enterobacteriaceae（26.14%）、Leuconostoc（6.36%）、Lactococcus（17.77%）、uncultured_Bacterium_o_Chloroplast

（2.95%）占據(jù)優(yōu)勢；J5樣品中僅Lactobacillus（97%）為優(yōu)勢菌屬。由此可知，發(fā)酵15 d時，無論是發(fā)酵湯汁中，還是平板培養(yǎng)物中，Lactobacillus均占據(jù)絕對優(yōu)勢。

此外，在優(yōu)勢菌中，Lactobacillus、Leuconostoc、Lactococcus等乳酸菌在不同發(fā)酵時間點(diǎn)、不同發(fā)酵體系中相對豐度不同，Lactobacillus在所有樣品中的相對豐度出現(xiàn)S2J3、S5J5的情況，Lactococcus則出現(xiàn)S2>J2、S3>J3、S5>J5的情況，這將在后面進(jìn)行解釋。

2.7 KEGG功能預(yù)測差異分析

通過KEGG代謝途徑的組成及差異分析，可以觀測不同樣品間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化，是研究在環(huán)境條件變化下群落代謝功能改變的有效手段。KEGG代謝途徑差異見圖6，P<0.05表示KEGG代謝差異顯著。

由圖6可知，在43條KEGG代謝途徑（S5、J5中僅42條）中，相對豐度排名前三的為Global and overview maps（全局和總覽圖）、Carbohydrate metabolism（碳水化合物代謝）、Amino acid metabolism（氨基酸代謝），表明這3個代謝途徑對樣品中微生物的生長繁殖非常重要，其中Global and overview maps為關(guān)鍵代謝途徑。

此外，由圖6可知Endocrine system （內(nèi)分泌系統(tǒng)）、Cellular community-prokaryotes（細(xì)胞群落-原核生物）、Carbohydrate metabolism（碳水化合物代謝）、Metabolism of terpenoids and polyketides（萜類和酮類化合物代謝）、Membrane transport（膜運(yùn)輸）5個代謝途徑在樣品中的相對豐度出現(xiàn)S2J3、S5J5，表明這3個途徑受Leuconostoc影響。Circulatory system（循環(huán)系統(tǒng)）、Energy metabolism（能量代謝）、Amino acid metabolism（氨基酸代謝）、Transport and catabolism（運(yùn)輸與分解代謝）等16條代謝途徑的相對豐度出現(xiàn)S2>J2、S3>J3、S5>J5的情況，與Lactococcus的相對豐度情況相同，表明Lactococcus直接影響上述16條代謝途徑。

2.8 COG功能預(yù)測差異分析

COG（Clusters of orthologous groups of proteins）即原核生物同源蛋白簇?cái)?shù)據(jù)庫，是原核生物常用的蛋白功能分類數(shù)據(jù)庫。COG功能差異柱狀圖見圖7。

由圖7可知，樣品間COG功能差異顯著，經(jīng)過基因注釋共得到24條COG功能代謝途徑，其中General function prediction only （一般功能預(yù)測） 在所有樣品中相對豐度最大，表明該途徑為關(guān)鍵COG代謝途徑；相對豐度較大的還有Amino acid transport and metabolism（氨基酸運(yùn)輸與代謝）、Translation， ribosomal structure and biogenesis（核糖體和生物發(fā)生）、Transcription（轉(zhuǎn)錄）等代謝途徑，表明這些COG代謝途徑為生物生長繁殖所必需。

此外，Defense mechanisms（防御機(jī)制）、Carbohydrade transport and metabolism（碳水化合物的運(yùn)輸和代謝）、General function prediction only（一般功能預(yù)測）、Signal transduction mechanisms（信號傳導(dǎo)機(jī)制）、Transcription（轉(zhuǎn)錄）5個代謝途徑相對豐度出現(xiàn)S2J3、S5J5的情況，與Leuconostoc情況相同，說明這2條途徑受Leuconostoc影響。Cell wall/membrane/envelope biogenesis（細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/膜結(jié)構(gòu)的生物合成）、Chromatin structure and dynamics（染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)）、Inorganic ion transport and metabolism（無機(jī)離子運(yùn)輸級分解代謝）、Cytoskeleton（細(xì)胞骨架）和Function unknown（未知功能）5條COG代謝途徑的相對豐度與乳球菌屬的情況相同，即S2>J2、S3>J3、S5>J5，表明這5條途徑受Lactococcus影響。

2.9 優(yōu)勢乳酸菌與功能代謝的相關(guān)性分析

基于上述結(jié)果，為了進(jìn)一步明確優(yōu)勢乳酸菌與功能代謝的關(guān)系，利用Canoco 5軟件進(jìn)行RDA分析，結(jié)果見圖8。

由圖8中a和b可知，Endocrine system（內(nèi)分泌系統(tǒng)）、Cellular community-prokaryotes（細(xì)胞群落-原核生物）、Carbohydrate metabolism（碳水化合物代謝）、Metabolism of terpenoids and polyketides（萜類和酮類化合物代謝）、Membrane transport（膜運(yùn)輸）等KEGG代謝途徑，以及Defense mechanics（防御機(jī)制）、Carbohydrade transport and metabolism（碳水化合物的運(yùn)輸和代謝）、General function prediction only（一般功能預(yù)測）、Signal transduction mechanisms（信號傳導(dǎo)機(jī)制）、Transcription（轉(zhuǎn)錄）等COG代謝途徑與Lactobacillus呈正相關(guān)；由圖8中c和d可知，Translation（翻譯）、Infectious diseases：Bacterial（細(xì)菌性傳染病）、Signaling molecules and interaction（信息分子與相互作用） 3條KEGG代謝途徑，以及Translation， ribosomal structure and biogenesis（翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生）、Nucleotide transport and metabolism（核苷酸代謝與運(yùn)輸）2條COG代謝途徑與Leuconostoc呈正相關(guān)；由圖8中e和f可知，Circulatory system（循環(huán)系統(tǒng)）、Energy metabolism（能量代謝）、Amino acid metabolism（氨基酸代謝）、Transport and catabolism（運(yùn)輸與分解代謝）、Excretory system（排泄系統(tǒng)）等KEGG代謝途徑，以及Cell wall/membrane/envelope biogenesis（細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/膜結(jié)構(gòu)的生物合成）、Chromatin structure and dynamics（染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)）、Inorganic ion transport and metabolism（無機(jī)離子運(yùn)輸級分解代謝）、Function unknown（未知功能）等COG代謝途徑與Lactococcus呈正相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

發(fā)酵菜物種豐富、組成多樣，因此受到了大批學(xué)者的青睞。根據(jù)文獻(xiàn)[17-19]對發(fā)酵食品在發(fā)酵前、中、后期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究，再結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，即發(fā)酵12 h、24 h、15 d時發(fā)酵菜理化指標(biāo)及 OD600 nm 值變化明顯[20]，本研究選取發(fā)酵12 h、24 h、15 d的發(fā)酵菜湯汁及其平板培養(yǎng)物作為研究對象，通過高通量測序技術(shù)，研究各發(fā)酵時間點(diǎn)兩組樣品的菌群結(jié)構(gòu)，并通過生物信息學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法對其潛在功能進(jìn)行預(yù)測，進(jìn)一步分析優(yōu)勢乳酸菌與潛在功能代謝的關(guān)系。

目前，通常采用泡菜壇、玻璃罐、大型塑料桶和發(fā)酵池制作發(fā)酵菜[21]，這在食用和取樣時帶來發(fā)酵菜腐敗的風(fēng)險(xiǎn)，也無法保證發(fā)酵過程中的安全問題。而本研究采用小型獨(dú)立發(fā)酵體系制作發(fā)酵菜，制造了多個獨(dú)立的發(fā)酵環(huán)境。在取樣時，直接取其中一瓶發(fā)酵菜進(jìn)行相關(guān)測定，下次取樣時再取另一瓶，該方法避免了因反復(fù)取樣帶來的雜菌污染問題，防止了腐敗現(xiàn)象的發(fā)生，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確；另外，有利于簡化取樣操作，一般需要分別從泡菜壇的上、中、下層取樣[22]，而該體系僅需要將發(fā)酵容器搖勻即可取樣。此外，該體系也避免了家庭式手工制作的發(fā)酵菜因制作過多、食用不及時而帶來的食品腐敗問題和食品浪費(fèi)問題，保證了工廠式大規(guī)模發(fā)酵過程中的生產(chǎn)衛(wèi)生問題。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，體系中物種多樣性呈下降趨勢。該結(jié)果已被先前的研究所證實(shí)，例如Yang等[23]研究發(fā)現(xiàn)蘿卜泡菜中細(xì)菌多樣性隨著發(fā)酵的進(jìn)行而顯著下降。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，泡菜中的雜菌在發(fā)酵過程中出現(xiàn)“自凈”的現(xiàn)象。本研究還發(fā)現(xiàn)， Firmicutes、Proteobacteria是發(fā)酵菜湯汁與其平板培養(yǎng)物中的優(yōu)勢菌門，uncultured_Bacterium_f_Enterobacteriaceae、Lactobacillus、Lactococcus和Leuconostoc是二者的優(yōu)勢菌屬。該結(jié)果與Rao等[24]的研究結(jié)果相符合，但該研究并未對平板培養(yǎng)物中的物種情況作介紹。此外，Chryseobacterium、uncultured_Bacterium_f_Enterobacteriaceae、Lactobacillus分別在發(fā)酵12 h、24 h、15 d的湯汁中占絕對優(yōu)勢，因此發(fā)酵12 h與24 h的發(fā)酵菜不適宜食用。有研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus能減少4種苦味氨基酸（His、Met、Phe、Lys）的含量，具有降低發(fā)酵菜苦味的功效[27]，還能提高發(fā)酵菜的感官品質(zhì)和風(fēng)味[25]。所以，為減少發(fā)酵菜的苦味，改善發(fā)酵菜的風(fēng)味，可以采取接種Lactobacillus的方式進(jìn)行發(fā)酵。在本研究中，無論是發(fā)酵湯汁還是平板培養(yǎng)物中，Lactobacillus在發(fā)酵15 d時相對豐度最高，分別為44.5%、97.6%，所以，以發(fā)酵15 d的發(fā)酵液作為母水進(jìn)行發(fā)酵，有望提升發(fā)酵菜的口感。

揮發(fā)性成分與非揮發(fā)性成分共同貢獻(xiàn)發(fā)酵菜的風(fēng)味，揮發(fā)性成分決定發(fā)酵菜的香味，非揮發(fā)性成分則影響發(fā)酵菜的口感[26]。這些均歸功于微生物的代謝，例如，有研究發(fā)現(xiàn)，Bacteroides、Lactobacillus、Lactococcus、Enterobacteriaceae等菌屬是發(fā)酵菜中產(chǎn)揮發(fā)性成分的主要物種[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，Glabal and overview maps、Carbohydrate metabolism和Amino acid metabolism為主要的KEGG代謝途徑。此結(jié)果與文獻(xiàn)[28]的研究結(jié)果一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)Carbohydrate metabolism、Metabolism of terpenoids and polyketides等5條KEGG代謝途徑以及Carbohydrade transport and metabolism、Transcription等5條COG代謝途徑受Lactobacillus影響，且呈正相關(guān)。Liang等[29-30]也發(fā)現(xiàn)Lactobacillus參與碳水化合物、氨基酸、脂類的代謝，從而形成風(fēng)味物質(zhì)。所以為增加發(fā)酵菜的風(fēng)味，在研發(fā)發(fā)酵菌劑時可以適當(dāng)提高乳桿菌屬的比例。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Infectious diseases等3條KEGG代謝途徑與Translation，ribosomal structure and biogenesis、Nucleotide transport and metabolism 2條COG代謝途徑與Leuconostoc呈正相關(guān)。由于該菌具有Infectious diseases的功能，可在發(fā)酵菌劑的研發(fā)中適當(dāng)降低其比例。Lactococcus影響Amino acid metabolism等5條KEGG代謝途徑和Cell wall/membrane/envelope biogenesis等4條COG代謝途徑，隨著其豐度的增加而增加。由于Amino acid metabolism能夠產(chǎn)生改善發(fā)酵菜風(fēng)味的氨基酸，所以在發(fā)酵菌劑的研發(fā)中，可以增加其比例。但目前沒有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)此類現(xiàn)象，所以本課題組下一步工作將致力于研發(fā)發(fā)酵菌劑，該菌劑能生產(chǎn)出最佳風(fēng)味與口感的發(fā)酵菜。

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