張玲玲 宋璐 韓冉 劉勝斌 孟夢 侯麗華

摘要：活性干酵母因其保存和運(yùn)輸方便、發(fā)酵進(jìn)程激活快、乙醇生成速率高等優(yōu)點(diǎn)逐漸在工業(yè)中被推廣。實(shí)驗(yàn)室前期篩選出了優(yōu)秀的釀酒酵母，但缺少活性干酵母制備工藝的研究與優(yōu)化，該研究在前期研究的基礎(chǔ)上，將篩選出的優(yōu)良釀酒酵母進(jìn)行活性干酵母制備條件的優(yōu)化。結(jié)果表明，釀酒酵母菌株H1制備活性干酵母的最佳工藝是離心速度4 500 r/min、離心時(shí)間10 min、添加10%乳糖作為保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥。將干酵母的菌體用水稀釋25倍，在水溫45 ℃、葡萄糖濃度為5%的條件下復(fù)水活化30 min，與鮮酵母同時(shí)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后，干酵母和鮮酵母試驗(yàn)組原料（還原糖）剩余量分別為0.93，0.82 g/dL，產(chǎn)物（乙醇）生成量分別為9.60，9.72 g/dL，可知干酵母依舊保持良好的發(fā)酵性能。該研究以期為小批量簡便制備活性干酵母提供理論依據(jù)和技術(shù)方法。

關(guān)鍵詞：活性干酵母；離心條件；冷凍干燥保護(hù)劑；復(fù)水活化條件；發(fā)酵性能

中圖分類號：TS201.3????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2023）08-0121-04

Study on the Preparation Process of Active Dry Yeast

ZHANG Ling-ling1，2， SONG Lu1，2， HAN Ran1，2， LIU Sheng-bin1，2， MENG Meng1，2， HOU Li-hua1，2*

（1.College of Food Science and Engineering， Tianjin University of Science & Technology， Tianjin 300457，

China； 2.Key Laboratory of Food Quality and Health in Tianjin， Tianjin 300457， China）

Abstract：Active dry yeast is gradually promoted in industry due to its convenient storage and transportation， fast activation of fermentation process and high ethanol production rate. In the laboratory， excellent Saccharomyces cerevisiae is screened out in the early stage， but there is a lack of research and optimization of the preparation process of active dry yeast. Based on the previous research， in this study， the preparation conditions of active dry yeast for the screened excellent Saccharomyces cerevisiae are optimized. The results show that the best process of preparing active dry yeast by Saccharomyces cerevisiae strain H1 is centrifugation speed of 4 500 r/min， centrifugation time of 10 min， and addition of 10% lactose as the protectant for freeze-drying. Dilute the dry yeast cells 25 times with water， and activate them by rehydrating under the conditions of 45 ℃ water temperature and 5% glucose concentration for 30 min. Add it into the fermentation medium with fresh yeast simultaneously for fermentation test. After fermentation， the remaining amount of raw material （reducing sugar） in the dry yeast and fresh yeast test groups is 0.93， 0.82 g/dL respectively， and the production amount of product （ethanol） is 9.60， 9.72 g/dL respectively. It can be seen that dry yeast still maintains good fermentation performance. The aim of this study is to provide a theoretical basis and technical method for the simple preparation of active dry yeast in small batches.

Key words： active dry yeast; centrifugal conditions; freeze-drying protectant; rehydration activation conditions; fermentation performance

收稿日期：2023-02-14

基金項(xiàng)目：天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（21ZYQCSY00050）資助

作者簡介：張玲玲（1990－），女，浙江嵊州人，工程師，碩士，研究方向：食品營養(yǎng)與化學(xué)。

通信作者：侯麗華（1974－），女，黑龍江哈爾濱人，教授，博士生導(dǎo)師，博士，研究方向：食品微生物、食品發(fā)酵。

活性干酵母是鮮酵母經(jīng)干燥脫水處理，復(fù)水活化后仍具備較強(qiáng)發(fā)酵能力的干酵母制品[1]。其水分含量在4%～6%左右，保存形式一般是細(xì)條狀或小球狀顆粒。相比于鮮酵母，活性干酵母具有鮮明的優(yōu)勢。第一，存儲物流方便：鮮酵母需要低溫保存[2]，且每隔一段時(shí)間需要活化并繁殖，恢復(fù)活性后需繼續(xù)低溫保存[3]。而活性干酵母粉水分含量低，酵母處于休眠狀態(tài)，可在常溫（25 ℃）下儲存24個(gè)月，期間不需做活化處理[4]，有效降低了保藏成本和運(yùn)輸成本。第二，發(fā)酵進(jìn)程激活快：鮮酵母需確定發(fā)酵能力才可使用，因此在使用前需要培養(yǎng)1～2 d，計(jì)算其活菌數(shù)后再投入使用[5]。而活性干酵母活化后便可使用，活化時(shí)間短則10～15 min，長則20～30 min，某些成熟的干酵母產(chǎn)品已投入商業(yè)使用[6]。第三，產(chǎn)物生成速率高：底物中的碳源作為其能源物質(zhì)[7]，活性干酵母活化后酵母菌擴(kuò)大培養(yǎng)與厭氧發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行，極大提高了底物的利用率，并提升了產(chǎn)物乙醇的生成速率。因此，活性干酵母的應(yīng)用更利于現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展。

我國從20世紀(jì)70年代開始研究和生產(chǎn)活性干酵母，雖然時(shí)間不長，但是活性干酵母的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展[8]。活性干酵母的生產(chǎn)工藝日趨成熟，工藝流程見圖1，酵母在與培養(yǎng)基分離以及干燥的過程中，數(shù)量和活性均會(huì)有所損失，因此優(yōu)化分離與干燥這兩個(gè)條件將是制備活性干酵母的關(guān)鍵，以期用溫和節(jié)能的方法獲得高活性的干酵母。酵母菌菌體細(xì)胞與培養(yǎng)液的分離普遍采用離心分離的方法，在離心過程中，不當(dāng)?shù)碾x心時(shí)間和速度會(huì)對酵母菌體產(chǎn)生不良影響。過高的速度和過長的時(shí)間會(huì)導(dǎo)致菌體損傷甚至死亡，過低的速度和過短的時(shí)間會(huì)造成離心不徹底，菌體大量損失。因此，需要找到最佳的離心參數(shù)?；钚愿山湍钢苽溥^程中的干燥方法有很多，如熱干燥法、滾筒干燥法、真空冷凍干燥法等[9-10]。其中真空冷凍干燥法[11]是將物料先冷凍成固體，然后在真空條件下對物料加熱，將冰升華為蒸氣使物料干燥的過程。與其他干燥方法相比，真空冷凍干燥能夠減少高溫對物料的影響，最大限度保持物料中的芳香物質(zhì)及營養(yǎng)成分，制品的含水量也更少，同時(shí)低溫和真空的狀態(tài)能夠抑制微生物的生長，保護(hù)物料不被氧化。因此，本研究采取真空冷凍干燥法進(jìn)行干燥條件的優(yōu)化。

實(shí)驗(yàn)室前期篩選出了優(yōu)良的釀酒酵母，但是缺少對活性干酵母制備工藝的研究與優(yōu)化，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，將篩選出的優(yōu)良釀酒酵母進(jìn)行活性干酵母的制備條件優(yōu)化，之后將最佳制備條件下的干酵母進(jìn)行復(fù)水活化條件的優(yōu)化，研究復(fù)水條件并檢驗(yàn)活性干酵母的活性，技術(shù)路線見圖2。本研究以期為小批量簡便制備活性干酵母提供理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

菌種：天津科技大學(xué)誘變選育的編號為H1的優(yōu)良釀酒酵母。

YPD培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）[12]：1%酵母膏、2%蛋白胨、1.5%瓊脂粉，115 ℃高溫滅菌20 min，添加5%的葡萄糖。

玉米培養(yǎng)基：玉米面經(jīng)糖化后得到葡萄糖濃度為240 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，添加0.05％的（NH4）2HPO4和0.05％的KH2PO4。

1.2 材料與試劑

玉米面：購于天津市濱海新區(qū)明耀超市；L-谷氨酸鈉、脫脂奶粉、麥芽糖、海藻糖（均為分析純）：Solarbio公司；乳糖（分析純）：天津市奧淇醫(yī)科醫(yī)藥銷售有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

微量離心機(jī)、冷凍大容量離心機(jī) 美瑞泰克科技（天津）有限公司；真空冷凍干燥機(jī) Christ公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 活性干酵母生產(chǎn)工藝流程

活性干酵母生產(chǎn)工藝流程見圖1。

1.4.2 本研究技術(shù)路線

活性干酵母制備工藝見圖2。

1.4.3 計(jì)算方法

參照GB 4789.15－2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[13]的方法進(jìn)行酵母菌的計(jì)數(shù)。

冷凍干燥后酵母菌的存活率=（冷凍干燥后的活菌數(shù)/冷凍干燥前的活菌數(shù)）×100%。

離心收得率=（沉淀中活菌數(shù)/初始活菌數(shù)）×100%。

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，所列的數(shù)據(jù)均是3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與討論

本研究以天津科技大學(xué)誘變選育的優(yōu)秀釀酒酵母H1進(jìn)行活性干酵母的制備試驗(yàn)，優(yōu)化活性干酵母制備過程中的離心條件并選擇合適的冷凍干燥保護(hù)劑，干酵母制備完成后優(yōu)化復(fù)水活化條件，試驗(yàn)結(jié)果如下。

2.1 離心條件

離心條件的篩選對菌體數(shù)量及活性起著關(guān)鍵的作用，是決定后續(xù)干酵母中活菌數(shù)量的重要環(huán)節(jié)，因此對離心速度和離心時(shí)間的優(yōu)化至關(guān)重要。本研究從離心速度3 500 r/min開始，隔一段速度設(shè)置一個(gè)取樣點(diǎn)，離心時(shí)間從10 min開始，每增加5 min設(shè)置一個(gè)取樣點(diǎn)，條件設(shè)置及得到的酵母收得率見圖3。

不同的離心速度和離心時(shí)間獲得的酵母收得率差距較大，分布在38%～75%區(qū)間，由圖3可知，離心速度越快，離心時(shí)間越長，酵母的收得率并非越高，離心速度為4 500 r/min時(shí)的收得率比其他轉(zhuǎn)速的收得率普遍要高，而當(dāng)離心速度為4 500 r/min、離心時(shí)間為10 min時(shí)，酵母收得率最高，為75%，即活性干酵母制備的最優(yōu)離心條件。

2.2 冷凍干燥保護(hù)劑選擇

冷凍干燥保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷、防止活性組分發(fā)生變性的物質(zhì)。在細(xì)胞懸液中加入冷凍干燥保護(hù)劑可保護(hù)酵母在冷凍過程中不受冰晶對細(xì)胞的損害。作用原理：一方面，冷凍干燥保護(hù)劑與溶液中的游離水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，游離水分子減少，則溶液的黏性增加，溫度降低時(shí)冰晶生成量減少，水的結(jié)晶過程被弱化；另一方面，冷凍干燥保護(hù)劑增加了溶液濃度，維持了細(xì)胞內(nèi)外的摩爾濃度，使細(xì)胞免受細(xì)胞質(zhì)中電解質(zhì)的傷害。因此，在冷凍干燥過程中選擇保護(hù)劑非常有必要。但是由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同，保護(hù)劑的選擇也不同，選擇合適的保護(hù)劑會(huì)有事半功倍的效果。

本研究選取市場上購買的8種不同的冷凍干燥保護(hù)劑添加在制備活性干酵母的中間過程，保護(hù)劑與菌懸液的比例為1∶3，得到的釀酒酵母存活率見圖4。

由圖4可知，不同的冷凍干燥保護(hù)劑對釀酒酵母的保護(hù)性能有很大差距，添加甘油保護(hù)劑的試驗(yàn)組，釀酒酵母在冷凍干燥后存活率不到2%，大部分沒有存活，保護(hù)效果不佳；而添加脫脂奶粉和乳糖保護(hù)劑的試驗(yàn)組，釀酒酵母在冷凍干燥后存活率分別達(dá)到22.10%和22.54%，是8種冷凍干燥保護(hù)劑中保護(hù)效果較好的。因此考慮這兩種保護(hù)劑，根據(jù)市場購入價(jià)格（見表1），乳糖比脫脂奶粉的單價(jià)低0.43元/g，與其他保護(hù)劑進(jìn)行比較，乳糖單價(jià)最低，保護(hù)效果最好，因此本研究中最優(yōu)冷凍干燥保護(hù)劑為乳糖。

2.3 復(fù)水活化條件

活性干酵母的含水量一般在4%～6%左右，與鮮酵母的含水量相差很多，干酵母在使用前需復(fù)水活化，才能激發(fā)其發(fā)酵活力，合適的復(fù)水活化條件可在最節(jié)省能源的條件下最大力度激發(fā)酵母的活性，且復(fù)水活化是活性干酵母使用的必經(jīng)流程，因此活化條件的優(yōu)化至關(guān)重要。據(jù)研究，活性干酵母復(fù)水后活性的好壞受活化用水稀釋數(shù)、活化溫度、活化葡萄糖濃度和活化時(shí)間的影響，因此，對上述4個(gè)因素對活性干酵母復(fù)水活化后的活性影響進(jìn)行了正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平表見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

通過極差分析可知，復(fù)水活化最關(guān)鍵的因素是活化溫度，其次是活化用水稀釋數(shù)、活化時(shí)間、活化葡萄糖濃度，各因素主次排序?yàn)锽＞A＞D＞C，由結(jié)果可知最優(yōu)的組合為A3B3C2D2，即活化用水稀釋倍數(shù)為25倍，活化溫度為45 ℃，活化葡萄糖濃度為5%，活化時(shí)間為30 min。

2.4 對比試驗(yàn)

將編號為H1的釀酒酵母菌株在離心速度4 500 r/min、離心時(shí)間10 min得到的菌體，添加10%乳糖作為保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥制得活性干酵母。將活性干酵母進(jìn)行復(fù)水活化，采用水稀釋25倍，水溫45 ℃，葡萄糖濃度5%，活化30 min，與鮮酵母同時(shí)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

由表4可知，鮮酵母和干酵母在發(fā)酵結(jié)束后，原料（還原糖）剩余量分別為0.82，0.93 g/dL，產(chǎn)物（乙醇）生成量分別為9.72，9.60 g/dL，可知干酵母消耗還原糖的量以及生成乙醇的量與鮮酵母相差不大，可認(rèn)為通過以上優(yōu)化條件制得的活性干酵母依舊保持著良好的發(fā)酵性能，表明活性干酵母的制備條件優(yōu)良。

3 結(jié)論

本研究對優(yōu)良酵母發(fā)酵菌株（天津科技大學(xué)誘變選育編號為H1）進(jìn)行了活性干酵母的制備工藝條件的探討和優(yōu)化，結(jié)果表明，H1釀酒酵母菌株的活性干酵母最優(yōu)制備條件為離心速度4 500 r/min、離心時(shí)間10 min、添加10%乳糖作為冷凍干燥保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥。將制得的活性干酵母用水稀釋25倍，水溫控制在45 ℃，葡萄糖濃度為5%，活化30 min，與鮮酵母同時(shí)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后，原料（還原糖）剩余量分別為0.93，0.82 g/dL，產(chǎn)物（乙醇）生成量分別為9.60，9.72 g/dL，可知干酵母消耗還原糖的量以及生成乙醇的量與鮮酵母相差不大，表明干酵母依舊保持著良好的發(fā)酵性能，本研究為進(jìn)一步促進(jìn)活性干酵母在乙醇工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了參考。

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