甜菜堿對鹽脅迫下馬鞭草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

崔 行，華智銳，2*

（1.商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000；2.商洛市秦嶺植物良種繁育中心，陜西 商洛 726000）

柳葉馬鞭草(Verbena bonariensisL.)是馬鞭草科(Verbenaceae)馬鞭草屬(Verbena)中的多年生草本植物，也被稱為風頸草，原產于南美洲巴西和阿根廷等地［1］，有清熱、止血、利尿、消炎的功效，其根可治療紅白痢疾等疾病，已被列入《中國藥典》［2］。近年來，柳葉馬鞭草以其搖曳的姿態(tài)、優(yōu)雅的色澤、芬芳的花序和較長的開花期而受到園林工作者的青睞，其大規(guī)模種植的景觀效果尤為壯觀，很受觀光游客的喜愛［3］。

隨著柳葉馬鞭草藥用和觀賞價值逐漸被開發(fā)，其市場需求量也在不斷地增加，迫切需要對其進行大規(guī)模繁殖及開展種植方面的相關研究。羅麗［2］通過綜合指標加權比較，得出了柳葉馬鞭草在湖南省適宜種植的草本地被植物中排名第6位。商旭文等［4］通過對柳葉馬鞭草栽培試驗研究發(fā)現(xiàn)，柳葉馬鞭草的定植時間應為每年的5月10日前后，且其對土壤、水肥的要求嚴格。閆雪梅等［5］研究了柳葉馬鞭草在金昌地區(qū)的適應性表現(xiàn)及栽培技術要點。國外專家通過對柳葉馬鞭草扦插方面的研究發(fā)現(xiàn)，經過生根促進劑處理的插條的生根數(shù)量增多，柳葉馬鞭草小苗扦插生根率在95%以上［6］。馬會利等［3］研究表明，一定濃度的赤霉素對柳葉馬鞭草種子發(fā)芽有顯著影響，對柳葉馬鞭草種子發(fā)芽有促進作用。周亮［1］研究了NAA和IBA生根劑對柳葉馬鞭草插條生根的影響。郭艷超等［7］對柳葉馬鞭草耐鹽性進行了研究，結果表明：鹽脅迫下柳葉馬鞭草種子具有相應的耐鹽性。綜上所述，國內外有關柳葉馬鞭草的研究主要集中在基本形態(tài)特征、栽培技術和園林應用特性等方面。

目前，土壤鹽分破壞被認定為農業(yè)生產中的難題，鹽脅迫威脅著世界上大部分的耕地和灌溉地，鹽漬會使土壤硬化，導致土壤利用率降低，其通過抑制植物根和芽的生長而破壞植物的新陳代謝，從而限制其生長發(fā)育，降低作物的質量和產量［8］。柳葉馬鞭草作為一個常用的農業(yè)生產品種，具有極其重要的藥用和觀賞價值，然而卻受到了鹽脅迫的極大破壞。前人研究發(fā)現(xiàn)，添加外源性調節(jié)物質可以提高植物對鹽脅迫的耐受性［9-11］，如甜菜堿(Glycine betaine，GB)。甜菜堿作為常用的滲透調節(jié)物質，具有維持細胞滲透壓，保護酶活性，耐鹽，影響無機離子的分布等作用，可緩解植物生長過程中受到鹽害的影響［10-12］。近年來關于甜菜堿在植物抗逆中的作用已有大量研究，認為甜菜堿參與細胞的滲透調節(jié)［13］，且還具有極為重要的“非滲透調節(jié)”功能［14-15］。但外源甜菜堿對鹽脅迫下馬鞭草種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響研究未見報道。因此，本試驗采用NaCl溶液模擬鹽脅迫，研究分析了外源甜菜堿對柳葉馬鞭草種子萌發(fā)及幼苗生理指標的影響，旨在為鹽堿地種植的柳葉馬鞭草的優(yōu)質高產栽培、逆境生理機制及抗性育種研究提供一定的理論參考和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用馬鞭草種子由江蘇省宿遷市國際花木城提供，經旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室鑒定，為馬鞭草科馬鞭草屬柳葉馬鞭草的干燥成熟種子，是農業(yè)生產中常用的種子。

選擇大小一致、籽粒飽滿的種子進行試驗；選取株高在10～15 cm之間、生長狀況基本一致的幼苗，移栽至塑料花盆中，定時澆水松土，使其恢復到正常生理狀態(tài)后再進行后續(xù)試驗處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子消毒 首先用75%乙醇與1% HgCl2對柳葉馬鞭草種子進行消毒處理15 s，再將消毒后的種子用溫水浸泡12 h，備用［8］。

1.2.2 預試驗設計 分別用蒸餾水和分析純NaCl，配制1、2、3、4 g/L NaCl溶液處理柳葉馬鞭草種子，再用蒸餾水作為對照進行種子萌發(fā)試驗。培養(yǎng)皿中放入2層濾紙，添加10 mL NaCl處理液，使濾紙浸濕飽和，后放入100 粒種子至培養(yǎng)皿，共5組，每處理重復3次。通過分析柳葉馬鞭草的種子萌發(fā)指標和幼苗生物量下降到50%時的NaCl濃度，得出鹽脅迫的質量濃度閾值為2 g/L。

1.2.3 種子萌發(fā)試驗 在2 g/L NaCl的脅迫下，設定濃度分別為1、3、5、7 g/L甜菜堿處理，對應標記為T1、T2、T3、T4處理。將無鹽脅迫及未添加外源甜菜堿條件下生長的柳葉馬鞭草種子設為蒸餾水對照(CK1)，將鹽脅迫下未添加外源甜菜堿溶液處理的柳葉馬鞭草種子設為鹽脅迫對照(CK2)，共6組試驗處理。放入100粒馬鞭草種子在對應培養(yǎng)皿中，每處理重復3次，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每天添加5 mL對應濃度的甜菜堿(CK1和CK2均添加5 mL蒸餾水)，分別于處理4、8 d后統(tǒng)計其發(fā)芽勢、發(fā)芽率。

1.2.4 幼苗盆栽試驗 待種子萌發(fā)后幼苗長至10～15 cm時移栽到直徑為15 cm×20 cm的花盆中(園土∶蛭石=1∶1)培養(yǎng)(每盆栽3株)，保持幼苗植株良好的生長狀態(tài)，并定期澆水培養(yǎng)15 d后，選取長勢一致的柳葉馬鞭草幼苗，采用灌根的方法，每盆澆灌2 g/L NaCl處理液200 mL(CK1澆灌200 mL蒸餾水)，確保處理液滲透而不漏出。同時，對每株幼苗葉片噴灑濃度分別為1、3、5、7 g/L的甜菜堿5 mL(CK1和CK2均噴灑蒸餾水5 mL)，每個處理3次重復。幼苗培養(yǎng)10 d后取樣，并測定幼苗的相關生長和生理指標。

1.2.5 種子萌發(fā)指標的測定 萌發(fā)的標志為胚根伸出種皮。分別于處理的第4、第8天計算其發(fā)芽勢、發(fā)芽率［2］。計算公式為：

發(fā)芽勢(%)=發(fā)芽初期(第4天)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽終期(第8天)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

1.2.6 幼苗生長指標和生理指標的測定 采用直尺測定幼苗根長(cm)和株高(cm)，采用天平測定幼苗鮮重(g)和干重(g)。超氧化物歧化酶(SOD)、 過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性的測定參照李合生［16］的方法。丙二醛(MDA)含量的測定參照張志良等［17］的硫代巴比妥酸(TBA)檢測法，用少量1 mol/L NaOH溶解0.6 g TBA，再用10% TCA 定容至100 mL，即為MDA反應液?？扇苄缘鞍缀康臏y定：將0.1 g G-250用50 mL 90%乙醇溶解，用100 mL 85%磷酸定容至1000 mL，再過濾備用，20 μL酶液混合3 mL G-250后放置2 min，同時以20 μL緩沖液混合3 mLG-250作空白對照［18］，于波長595 nm下測定其吸光度。葉綠素含量的測定參照張志良等［17］的丙酮—碳酸鈣法。

1.3 數(shù)據處理

采用SPSS 22.0軟件對所測數(shù)據進行統(tǒng)計分析，用平均值±標準誤表示測定結果，分別對不同濃度外源甜菜堿處理進行單因素方差分析，取3次重復測得的各項指標數(shù)據平均值，并采用Excel 2010軟件制圖和分析。

2 結果與分析

2.1 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草種子萌發(fā)指標的影響

從表1可看出，在NaCl脅迫下，隨著GB濃度的增加，T1～T4處理的發(fā)芽率、發(fā)芽勢均呈現(xiàn)先增后降的趨勢。在GB濃度為3 g/L(T2)時，柳葉馬鞭草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢最高，分別為52.67%和42.67%，與CK2鹽脅迫對照相比，顯著上升且增加幅度分別高達21.33、19.67個百分點，且差異顯著(P＜0.05)。由此可知，添加甜菜堿可以緩解鹽脅迫對柳葉馬鞭草種子萌發(fā)的抑制作用，其中GB濃度為3 g/L時的作用效果最佳。

表1 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草種子萌發(fā)的影響 %

2.2 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗生長的影響

由表2可知，與CK1對照相比，在CK2的鹽脅迫處理下，柳葉馬鞭草幼苗的根長、株高、鮮重和干重均顯著降低；但與CK2相比，添加不同質量濃度外源甜菜堿后，鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗各生長指標均不同程度地升高，在GB濃度為3 g/L(T2)時，鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗的根長、株高、鮮重和干重增加幅度最大，分別增加了57.97%、22.11%、46.03%、55.73%。這表明適量甜菜堿可以有效地緩解鹽脅迫對柳葉馬鞭草幼苗生長的影響，且添加3 g/L甜菜堿的緩解效果最佳。

表2 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗生長的影響

2.3 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗保護酶活性的影響

由圖1～圖3可知，與對照組(CK1)相比，在2 g/L NaCl脅迫(CK2)下，SOD、CAT的活性呈顯著上升趨勢(P＜0.05)，增幅分別為26.67%、16.15%；POD活性呈顯著下降趨勢(P＜0.05)，降幅為33.47%，說明NaCl脅迫處理對柳葉馬鞭草葉片3種保護酶活性有顯著影響。在同一濃度NaCl的脅迫下，經不同濃度GB處理(T1～T4)后，相比于CK2，柳葉馬鞭草幼苗的SOD、POD活性均呈現(xiàn)先升后降趨勢，而CAT活性呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢。其中，3種保護酶活性均在T2(3 g/L GB)處理下達到最大增幅且與其他處理差異顯著(P＜0.05)。說明在NaCl脅迫下，GB處理濃度為3 g/L時可顯著提高柳葉馬鞭草幼苗保護酶的活性，從而增強馬鞭草幼苗對鹽脅迫的耐受性。

圖1 GB對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗SOD活性的影響

圖2 GB對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗POD活性的影響

圖3 GB對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗CAT活性的影響

2.4 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗膜脂過氧化的影響

由圖4可知，與對照組(CK1)相比，在2 g/L NaCl脅迫(CK2)下，MDA的含量呈顯著上升趨勢(P＜0.05)，說明NaCl脅迫處理導致柳葉馬鞭草葉片MDA的大量積累；在同一濃度NaCl的脅迫下，與CK2相比，不同濃度GB(T1～T4)處理下柳葉馬鞭草幼苗的MDA含量呈現(xiàn)出明顯降低的趨勢，分別下降了12.29%、58.14%、41.79%、25.58%。試驗表明，柳葉馬鞭草幼苗MDA含量在T2(3 g/L GB)處理下達到最大降幅，且與T1、T3、T4相比差異顯著(P＜0.05)。

圖4 GB對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗MDA含量的影響

2.5 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素含量作為植物生理研究的關鍵指標，它能有效地反映植物的光合能力［19］。由圖5可知，NaCl脅迫(CK2)的柳葉馬鞭草幼苗體內的葉綠素含量與對照組(CK1)相比有顯著下降趨勢(P＜0.05)，降幅達38.42%，這表明鹽脅迫會降低植物光合色素的含量。但T1～T4處理后的葉綠素含量相比于NaCl脅迫CK2有明顯上升趨勢，增幅分別為2.62%、74.98%、39.45%、9.97%。表明噴灑不同濃度的甜菜堿可顯著提升馬鞭草幼苗的葉綠素含量，其中在T2(3 g/L GB)處理下達到最大增幅，說明3 g/L GB處理可以顯著降低NaCl脅迫對植物葉片葉綠素含量的影響，從而緩解鹽脅迫的傷害程度。同時，從圖5還可以看出，T2處理下的葉綠素含量顯著高于CK1，這表明適量GB處理有利于馬鞭草在逆境條件下積累葉綠素。

圖5 GB對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗葉綠素含量的影響

2.6 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗可溶性蛋白含量的影響

由圖6可知，與對照組(CK1)相比，在2 g/L NaCl脅迫(CK2)下，馬鞭草幼苗的可溶性蛋白含量呈顯著下降趨勢(P＜0.05)，降幅達69.31%，這表明鹽脅迫對馬鞭草幼苗葉片的可溶性蛋白含量有明顯影響；但在鹽脅迫下，添加不同濃度GB 處理(T1～T4)對柳葉馬鞭草幼苗的可溶性蛋白含量有提升作用，且相比于CK2呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，其中在T2(3 g/L GB)處理下的可溶性蛋白含量達到最大增幅。說明在NaCl 脅迫下，添加濃度為3 g/L的GB 可以顯著提高柳葉馬鞭草幼苗的可溶性蛋白含量。

圖6 GB對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗可溶性蛋白含量的影響

3 討論

3.1 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

種子萌發(fā)是植物生命的開始，是植物生長最重要的一個過程，但也同樣是最脆弱的階段，非常容易受到外界環(huán)境的影響［20］。從預試驗結果中可看出鹽脅迫對柳葉馬鞭草種子萌發(fā)具有較大的影響。但相關研究表明，在鹽脅迫下添加外源甜菜堿明顯會改善煙草(Nicotiana tabacum)、枸杞(Lycium barbarum)、番茄(Solanum lycopersicum)和白三葉(Trifolium repens)等種子的萌發(fā)情況［21］。此外，羅黃穎等［22］也發(fā)現(xiàn)，添加甜菜堿可促進鹽脅迫下設施番茄(Lycopersicon esculentumMill)種子的萌發(fā)和幼苗生長。本試驗通過添加適量的外源甜菜堿，能有效地緩解鹽脅迫對馬鞭草種子萌發(fā)和幼苗生長指標的影響，這與前人的研究結論一致，且本試驗得出在GB濃度為3 g/L時的處理效果最佳。

3.2 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草保護酶活性的影響

POD、SOD和CAT均是植物抗氧化系統(tǒng)中的保護酶，能將逆境脅迫條件下產生的H2O2分解為H2O、O2，在植物面對逆境時起自我保護的作用。趙英等［23］研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的NaCl脅迫會對植物幼苗的抗氧化酶造成嚴重的影響，從而表現(xiàn)為相應酶活性的降低。

本試驗中，在2 g/L NaCl的脅迫下，柳葉馬鞭草幼苗中SOD、CAT的活性均有所上升，充分證明了植物在生長過程中受到鹽脅迫傷害時，可通過提高體內相應抗氧化酶的活性，從而達到保持自身正常生理狀態(tài)的效果，這與陸安橋等［8］在鹽脅迫對湖南稷子苗期生長及生理特性影響研究中的結論一致。郭艷超等［7］在柳葉馬鞭草耐鹽性評價研究中發(fā)現(xiàn)，添加一定濃度的NaCl脅迫后，隨著時間的變化，其相應的抗氧化酶活性呈現(xiàn)先增后降的趨勢。由此可以解釋本試驗在T1處理添加1 g/L GB后的CAT活性呈下降的趨勢，可能是因為在測定時CAT的活性已處于刺激過后的下降階段。在本試驗中，與鹽脅迫CK2相比，施加3 g/L GB時，這3種保護酶活性的升高均達到最顯著(P＜0.05)，這表明甜菜堿有助于激發(fā)柳葉馬鞭草幼苗體內保護酶的活性，從而提高植物自身抵御非生物脅迫的能力。

3.3 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗膜脂過氧化的影響

在逆境中受到威脅時，植物體內會產生活性氧自由基，會氧化細胞膜的膜脂，MDA含量可以反映植物在逆境中受到傷害的程度?？娚旱龋?4］研究表明，隨著鹽濃度的增加，狼尾草(Pennisetum alopecuroides)的丙二醛含量呈先上升后下降再上升的變化趨勢。本研究結果顯示，在2 g/L NaCl脅迫下柳葉馬鞭草幼苗的MDA含量較對照組CK1顯著增加，這與繆珊等［24］的研究結果類似。表明鹽脅迫對柳葉馬鞭草幼苗的影響較大，使其膜脂發(fā)生過氧化，從而MDA含量發(fā)生變化。但在添加不同濃度的GB后，其MDA含量均比鹽脅迫(CK2)處理顯著降低，并在GB濃度為3 g/L時達到最低值，充分說明適量外源甜菜堿能有效緩解馬鞭草幼苗膜脂過氧化傷害程度。

3.4 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗葉綠素含量的影響

葉綠體色素是綠色植物進行光合作用的物質基礎，光合作用生產的變化和威脅因素對植物的影響程度都通過其含量的變化來體現(xiàn)。本試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組CK1相比，在2 g/L NaCl脅迫下柳葉馬鞭草幼苗的葉綠素含量明顯降低，這與張強等［25］得出的鹽脅迫下葉綠素含量呈減少趨勢的研究結果一致。本試驗研究還發(fā)現(xiàn)，添加不同濃度的GB處理后，柳葉馬鞭草幼苗的葉綠素含量呈現(xiàn)出先上升后降低的變化趨勢，且GB濃度為3 g/L時達到最高值，這與翟乃家等［26］的研究結果一致，充分表明在鹽脅迫下添加適量甜菜堿，會促進柳葉馬鞭草幼苗葉片葉綠素的積累，從而緩解鹽脅迫對光合作用的抑制作用。

3.5 甜菜堿對鹽脅迫下柳葉馬鞭草幼苗可溶性蛋白含量的影響

在鹽脅迫下，為了維持細胞正常的滲透壓，植物體會儲存大量的可溶性蛋白，以保障植物體正常水分供給。王國霞等［27］發(fā)現(xiàn)，施加外源甜菜堿，顯著增加了低溫脅迫下油茶可溶性蛋白的含量；張濤［28］發(fā)現(xiàn)，花楸樹葉片的可溶性蛋白含量在鹽脅迫下先升高后降低，但當鹽濃度高到一定程度時，植物體內合成可溶性蛋白的組織或者酶類就會失活，從而使花楸樹的自我調節(jié)能力受到抑制。在本試驗中，在2 g/L NaCl脅迫下，柳葉馬鞭草幼苗的可溶性蛋白含量較CK1顯著降低，可以看出鹽脅迫處理對柳葉馬鞭草植株造成了嚴重的傷害。但添加不同濃度的GB后，其可溶性蛋白含量均比CK2鹽脅迫處理下呈現(xiàn)出明顯上升趨勢，并在GB濃度為3 g/L時達到最高值，充分說明適宜濃度的外源甜菜堿處理可以緩解柳葉馬鞭草幼苗的鹽脅迫傷害。

4 結論與展望

本試驗研究得出，鹽脅迫雖然抑制了柳葉馬鞭草種子萌發(fā)和幼苗的生長，但添加不同濃度甜菜堿后，與鹽脅迫對照相比，種子萌發(fā)指標、幼苗生長指標、抗氧化酶活性、葉綠素含量、可溶性蛋白含量等均不同程度升高，MDA含量明顯降低，從而有效緩解了鹽脅迫造成的傷害。當外源GB濃度為3 g/L時，與鹽脅迫對照相比，各指標變化幅度最大，處理效果最顯著(P＜0.05)。綜上所述，添加外源甜菜堿處理可以緩解鹽脅迫對柳葉馬鞭草種子萌發(fā)和幼苗生長造成的傷害程度，且GB濃度為3 g/L時的作用效果最佳。但本研究僅開展了馬鞭草種子萌發(fā)和幼苗盆栽試驗，對逆境條件下更深層次的抗性生理和分子機制方面的研究有待進一步開展。