固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定鐵皮石斛中2,4-表蕓苔素內(nèi)酯殘留

陸蘭菲,趙學(xué)平,馬 正,方 楠,駱玉琴,王曉梅,葉 會,雷 圓,王 強,*,張昌朋,*

(1.中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018; 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所,浙江 杭州 310021)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為我國中醫(yī)藥記載的名貴藥食兩用藥材,素有“神仙草”之稱[1]。鐵皮石斛中富含多糖、多酚、氨基酸、黃酮等活性物質(zhì)[2],具有預(yù)防及治療癌癥[3],改善肝臟氧化應(yīng)激、炎癥和肝脂質(zhì)積累等作用[4]。最新研究表明,鐵皮石斛對慢性免疫性疾病具有潛在的治療作用[5],還可增強自身免疫及抗氧化等多種功能[6]。2008—2014年鐵皮石斛鮮莖產(chǎn)量由1 200 t增至14 800 t,呈現(xiàn)逐年增加的態(tài)勢[7]。因其生長條件不喜陽不耐干燥,鐵皮石斛黑斑病、蛞蝓等病蟲害發(fā)生較嚴(yán)重。經(jīng)查詢,目前在鐵皮石斛上登記的農(nóng)藥產(chǎn)品僅23個(殺蟲劑8個);在鐵皮石斛生產(chǎn)過程中,存在著超范圍使用農(nóng)藥的情況。Zhang等[8]研究了24種農(nóng)藥在鐵皮石斛中殘留,83.33%的樣品檢出農(nóng)藥殘留,農(nóng)藥殘留是影響鐵皮石斛質(zhì)量安全的重要因素。

蕓苔素內(nèi)酯(圖1-A)是一類具有顯著促進作物生長的新型植物激素,被認(rèn)為是具有多效作用的植物生長調(diào)節(jié)劑[9-10]。蕓苔素內(nèi)酯可有效誘導(dǎo)番茄果實成熟,增加番茄中可溶性糖、番茄紅素含量、抗壞血酸、呼吸速率和乙烯生成,這說明蕓苔素內(nèi)酯在調(diào)節(jié)果實成熟的同時也參與了番茄果實品質(zhì)性狀的形成[11];通過葉面噴施蕓苔素內(nèi)酯固醇類似物(Biobras-16)對菠蘿果實生長具有積極的作用[12]。這類化合物不含離子基團故很難離子化;不含共軛結(jié)構(gòu)以及光電響應(yīng)基團導(dǎo)致常規(guī)紫外檢測器、熒光檢測器無法檢測其含量;沸點高,不易氣化。目前檢測方法有高效液相紫外檢測技術(shù)[13]、高效液相色譜熒光檢測器檢測技術(shù),因其結(jié)構(gòu)的特性,這些方法繁雜且需衍生化。蕓苔素內(nèi)酯種類眾多,2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯(圖1-B)因生物活性和人工合成效率高等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用在各種農(nóng)作物中。2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯相關(guān)農(nóng)藥殘留研究少及進展不足,但在前期調(diào)查表明,盡管尚未登記,但鐵皮石斛生產(chǎn)中已使用2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯。因此進一步研究2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛中殘留,為其在鐵皮石斛上合理使用和提升鐵皮石斛質(zhì)量安全提供數(shù)據(jù)支撐。

圖1 蕓苔素內(nèi)酯(A)和2,4-表蕓苔素內(nèi)酯(B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of brassinolide (A) and 2, 4-epibrassinolide (B)

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯原藥[13-14](純度93%,CAS:78821-43-9)購自浙江世佳科技股份有限公司;2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;甲醇、乙腈 (HPLC級,Merck公司);甲酸 (HPLC級,美國ACS公司);甲酸銨(HPLC級,德國Honeywell公司);丙酮、正己烷(AR級)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;試驗用水為屈臣氏瓶裝礦泉水;萃取鹽包(含1.5 g NaCl和6 g MgSO4,分析純)購自杭州易鎂創(chuàng)科技有限公司;Cleanert Pesti carb/NH2固相萃取小柱(500 mg,6 mL)購自上海安普實驗科技股份有限公司;陶瓷均質(zhì)子購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;0.22 μm一次性針式過濾器有機尼龍針頭濾膜購自天津博納艾爾杰科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

G 6470型高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);SK-7200 H型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);NMSG-12型渦旋振蕩器(泰州米諾醫(yī)療科技有限公司);6430 R型高速冷凍離心機(Pendorf 公司);BSA2202S型萬分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 樣品制備

選2年生鐵皮石斛組培苗為供試材料,種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地大棚內(nèi)。在大棚中煉苗一個月后進行噴霧處理[15]。噴霧時添加助劑:1%乙醇與3%吐溫80[16]。試驗共設(shè)3組:T1組,2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯濃度為0.02 mg·L-1;T2組,2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯濃度為0.05 mg·L-1;T3組,對照組。采用葉面噴施方式共施藥兩次,施藥間隔為30 d,在第二次施藥后采集0、1、7、14、28和35 d的鐵皮石斛樣品(莖、葉),留樣500 g,保存在-20 ℃冰箱待測。

1.4 樣品前處理

提取:分別精準(zhǔn)稱取10.00 g(精準(zhǔn)至0.01 g)鐵皮石斛葉和莖樣品于50 mL離心管中,加入5 mL水充分浸潤樣品后再加入15 mL乙腈,超聲提取15 min,然后加入1.50 g NaCl和6.00 g MgSO4,在每個離心管中放置一只陶瓷均質(zhì)子,渦旋振蕩2 min后以8 000 r·min-1離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶,在40 ℃水浴下旋蒸近干,然后用2 mL丙酮∶正己烷=6∶4(體積比)的混合液復(fù)溶,待凈化。

凈化:Cleanert Pesti carb/NH2小柱用10 mL混合液活化,將2 mL上述復(fù)溶液上樣,再用25 mL混合液淋洗小柱,收集所有濾液,40 ℃水浴旋蒸近干,再用2 mL乙腈復(fù)溶,超聲1 min,過0.22 μm有機濾膜,待上機測定。

1.5 儀器條件

液相色譜條件:色譜柱為Waters C18柱 (100 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動相為甲醇(A)、含0.1%甲酸和2 mmol·L-1的甲酸銨水溶液(B),柱溫40 ℃,流速為0.4 mL·min-1,進樣體積20 μL。梯度洗脫為:0～0.5 min,10% A;0.5～2.5 min,10%～92% A;2.5～4 min 92% A;4～4.01 min,92%～10% A;5.5 min,10% A。

質(zhì)譜條件:采用ESI+模式,MRM多反應(yīng)監(jiān)測,干燥器溫度300 ℃,干燥器流量為5 L·min-1,霧化器壓力為45 psi,鞘氣溫度為350 ℃,鞘氣流量為11 L·min-1,毛細(xì)管電壓為4 000 V。2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的監(jiān)測離子對及相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 2,4-表蕓苔素內(nèi)酯的質(zhì)譜條件Table 1 The mass spectrometric parameters of 2, 4-epibrassinolide

1.6 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品0.011 1 g于100 mL容量瓶中,用乙腈定容,配制成100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,4 ℃下保存。用空白基質(zhì) (莖、葉)提取液逐級稀釋成0.000 5、0.002 5、0.025、0.05、0.1、0.25 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。按1.5節(jié)中儀器條件測定,重復(fù)3次,以2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),對應(yīng)濃度的峰面積為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用外標(biāo)定量法。通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)有明顯的基質(zhì)效應(yīng),故選擇基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行濃度的計算[17]。

1.7 添加回收試驗

在空白鐵皮石斛莖和葉中分別添加0.005、0.05、0.5 mg·kg-1的2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯,同時設(shè)置空白對照,每個處理重復(fù)3次,混勻后靜置30 min,樣品前處理及儀器測定分別按1.4節(jié)與1.5節(jié)進行,并計算平均回收率(average recovery,%)以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD,%)。

1.8 統(tǒng)計分析

基質(zhì)效應(yīng)[18]由公式(1)計算所得:

(1)

其中VME為基質(zhì)效應(yīng),A為繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線所得斜率,B為繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得斜率。 當(dāng)VME值為正時,基質(zhì)呈增強作用;VME值為負(fù)時為抑制作用,絕對值越大則相應(yīng)作用愈明顯。

農(nóng)藥降解動態(tài)方程和半衰期[19](T1/2)由公式(2)和公式(3)計算所得:

Ct=C0e-kt;

(2)

(3)

其中Ct為t時刻農(nóng)藥濃度(mg·kg-1),C0為農(nóng)藥初始濃度即原始沉積量(mg·kg-1),k為2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛中降解速率常數(shù)。

采用Excel 2019和SPSS 26進行殘留數(shù)據(jù)分析,Graph Pad Prism 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

比較了同等梯度下甲醇和乙腈作為有機溶劑時,2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的峰型以及峰面積,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇作為溶劑時靈敏度更高且峰型更好,水相中加入2 mmol·L-1甲酸銨能使2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯更容易離子化,響應(yīng)值更佳。對比色譜柱T3與C18的響應(yīng)值發(fā)現(xiàn)C18柱無論是響應(yīng)值還是峰形均比T3色譜柱好。所以最終選取甲醇-0.1%甲酸水(內(nèi)含2 mmol·L-1甲酸銨)和C18為最佳流動相和色譜柱。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選用正離子ESI+模式對2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣,先進行質(zhì)譜全掃描從而確定母離子,通過離子掃描以優(yōu)化錐孔電壓,最后在子離子掃描模式通過優(yōu)化碰撞電壓。優(yōu)化后的2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的質(zhì)譜條件及離子色譜圖見表1和圖2。

圖2 2,4-表蕓苔素內(nèi)酯(0.1 mg·L-1)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子色譜圖Fig.2 Quantitative ion chromatogram of 2, 4-epibrassinolide (0.1 mg·L-1) matrix standard solution

2.3 前處理的優(yōu)化

2.3.1 提取方式的選擇

對比超聲、渦旋、超聲與渦旋聯(lián)用3種方式進行提取條件優(yōu)化,以回收率為指標(biāo),3種提取方式回收率結(jié)果:81.67%、67.63%、90.50%,如圖3-A。超聲有助于提高2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在乙腈中的溶解,渦旋有效提取目標(biāo)化合物,二者聯(lián)用提升2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯提取率。

圖3 不同條件對回收率的影響Fig.3 The effect of different conditions on the recovery rate

2.3.2 提取溶劑選擇

實驗選擇乙腈[20-21]、丙酮、甲醇這3種提取溶劑進行對比優(yōu)化,以提取效率為指標(biāo)對3種不同試劑進行對比,提取率分別為84.98%、95.18%、77.46%,如圖3-B所示。丙酮能將樣品中的脂類、大量色素等物質(zhì)提取出來,經(jīng)SPE小柱凈化后提取液顏色呈黃綠色,且色譜圖基線雜質(zhì)干擾較大。鮮樣水分較干樣多,用乙腈提取后鹽析效果比丙酮佳,且色譜圖基線穩(wěn)雜質(zhì)干擾較小,因此選擇乙腈作為提取溶劑。為了讓樣品充分浸潤,提高提取率,添加乙腈前加入5 mL水。

2.3.3 提取溶劑體積的優(yōu)化

比較了10 mL、15 mL、20 mL乙腈對2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯回收率的影響,結(jié)果如圖3-C所示。加入10 mL乙腈時,回收率小于70.00%;加入15 mL乙腈時,回收率為95.18%;加入20 mL乙腈時,回收率為88.10%。因此,提取溶劑乙腈的體積選取15 mL。

2.3.4 凈化材料的選擇

考察Oasis HLB (500 mg,6 mL)、Cleanert NH2(500 mg,6 mL)、Cleanert Pesti Carb/NH2(500 mg,6 mL)、 Cleanert PEP-2(500 mg,6 mL)、 Cleanert TPH (2 g,12 mL)和Cleanert NANO(1 mL)碳納米凈化萃取小柱等6種凈化材料對2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯回收率的影響,結(jié)果如圖3-D所示。選用Cleanert Pesti Carb/NH2固相萃取小柱時,回收率達到91.52%,RSDs在5.1%～7.9%,且雜質(zhì)凈化效果佳。因此,選擇Cleanert Pesti Carb/NH2對樣品進行凈化。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)工作方程、線性范圍和基質(zhì)效應(yīng)

在0.000 5～0.25 mg·L-1范圍內(nèi),2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛莖、葉中的線性方程分別為:y=421 887x+391.91和y=441 297x+5 053.1,兩種基質(zhì)條件下相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99,峰面積和質(zhì)量濃度之間線性關(guān)系良好?；|(zhì)效應(yīng)在-31%～-53%,有明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。定量限(LOQs)和檢出限(LODs)分別為0.005 mg·kg-1和0.000 5 mg·L-1,該方法靈敏度高。

2.4.2 平均回收率及精密度

在鐵皮石斛的莖、葉中分別添加2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液,進行3個水平上的添加回收試驗,每一個添加水平重復(fù)6次,添加回收率以及RSD結(jié)果見表2所示。結(jié)果表明,2,4-表蕓苔素內(nèi)酯平均回收率在94.70%～102.25%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.3%～3.4%,方法的準(zhǔn)確度及精密度均滿足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》(NY/T 788—2018)的殘留分析要求。

表2 鐵皮石斛中2,4-表蕓苔素內(nèi)酯的回收率和精密度Table 2 Average recovery and precision of 2, 4-epibrassinolide in Dendrobium officinale

2.5 實際樣品中的應(yīng)用

利用室內(nèi)盆栽試驗獲得鐵皮石斛樣品。在40盆鐵皮石斛上噴施2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯(內(nèi)含1%乙醇與3%吐溫80)。根據(jù)不同劑量分別為T1組0.02 mg·L-1;T2組0.05 mg·L-1;進行葉面噴施兩次,間隔一個月后,根據(jù) 0、1、7、14、28和35 d的鐵皮石斛(莖、葉)樣品進行采集,待測鐵皮石斛樣品置-20 ℃冰箱保存。2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯將本文建立的方法應(yīng)用于實際鐵皮石斛樣品中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的測定。經(jīng)HPLC-MS/MS測定數(shù)據(jù)與Excel數(shù)據(jù)分析得出2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛(莖、葉)中的殘留動態(tài)(表3)符合一級動力學(xué)方程,結(jié)果見表3。2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛(莖、葉)中殘留量隨時間推遲而降低。如圖4-A、B,T1組鐵皮石斛葉中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯14 d的降解率為85.59%;莖中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在14 d的降解率為75.06%。T2組鐵皮石斛葉中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在35 d的降解率為87.33%;莖中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在35 d的降解率為71.34%。2,4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛莖中的半衰期為10.35～22.36 d,在葉中的半衰期為8.89～11.00 d。2,4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛莖中的消解半衰期(22.36 d)大于葉中的消解半衰期(11.00 d)[22]。結(jié)果表明,該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均滿足鐵皮石斛實際樣品中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的分析要求。

表3 不同濃度2,4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛中的殘留、線性方程、相關(guān)系數(shù)和半衰期Table 3 Residues, linear equations, correlation coefficients and half-lives of different concentrations of 2,4-epibrassinolide in Dendrobium officinale

圖4 不同濃度2,4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛(莖和葉)中的殘留動態(tài)Fig.4 Residue dynamics of 2, 4-epibrassinolide at different concentrations in Dendrobium officinale (stem and leaf)

3 結(jié)論

本文建立了基于固相萃取結(jié)合HPLC-MS/MS檢測鐵皮石斛莖、葉中2,4-表蕓苔素內(nèi)酯殘留分析方法,其定量限和檢出限分別為0.005 mg·kg-1和0.000 5 mg·L-1。在0.005、0.05和0.5 mg·kg-1添加水平下,2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛中的平均回收率在94.70%～102.25%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～3.4%。該方法操作簡便、凈化干凈,且回收率、精密度、重現(xiàn)性等指標(biāo)均滿足農(nóng)藥殘留檢測要求。利用該方法檢測了鐵皮石斛實際樣品,結(jié)果顯示,T1組鐵皮石斛葉中2,4-表蕓苔素內(nèi)酯14 d 的降解率(85.59%)大于莖(75.06%);T2組鐵皮石斛莖、葉中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯35 d的降解率分別為71.34%和87.33%。和T1組(0.02 mg·L-1)相比,T2組(0.05 mg·L-1)2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛莖葉中的降解更慢。2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛莖和葉中的半衰期分別為10.35～22.36 d和8.89～11.00 d。本研究為鐵皮石斛中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的殘留檢測提供了可靠的分析方法。