付瑞強(qiáng)，張燕寧，毛連綱，朱麗珍，蔣紅云，劉新剛，張 蘭

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

四氯蟲(chóng)酰胺（tetrachlorantraniliprole）是國(guó)內(nèi)創(chuàng)制的一種雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑（圖1），其對(duì)水稻二化螟、稻縱卷葉螟效果優(yōu)異[1]，對(duì)蚜蟲(chóng)類(lèi)、葉蟬類(lèi)、飛虱類(lèi)以及部分鞘翅目和雙翅目害蟲(chóng)也具有較好的防效[2]。四氯蟲(chóng)酰胺是以氯蟲(chóng)苯甲酰胺為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到，二者都屬于鄰甲酰氨基苯甲酰胺類(lèi)化合物。通過(guò)與魚(yú)尼汀受體結(jié)合，打開(kāi)鈣離子通道，使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子持續(xù)釋放到肌漿中[3]，鈣離子和肌漿中基質(zhì)蛋白結(jié)合，進(jìn)而引起害蟲(chóng)肌肉持續(xù)收縮，靶標(biāo)害蟲(chóng)因此表現(xiàn)為抽搐、麻痹、拒食，最終死亡[4]。

圖1 四氯蟲(chóng)酰胺結(jié)構(gòu)式

鑒于雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)環(huán)境和非靶標(biāo)生物的安全性也需引起關(guān)注。有研究證明，四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)天敵昆蟲(chóng)、家蠶、蜜蜂、水生生物存在潛在風(fēng)險(xiǎn)[5]；張琦等[6]研究證明氯蟲(chóng)苯甲酰胺和四氯蟲(chóng)酰胺2種雙酰胺類(lèi)農(nóng)藥對(duì)2齡家蠶毒性均屬于中毒，在應(yīng)用于桑園害蟲(chóng)防治中該農(nóng)藥毒性殘留相對(duì)其他農(nóng)藥較低，四氯蟲(chóng)酰胺相比氯蟲(chóng)苯甲酰胺對(duì)家蠶的毒性更強(qiáng)。且四氯蟲(chóng)酰胺在土壤中不易降解，在pH=7的水中中等光解，其在土壤中也較易被吸附[7]。

大型溞（Daphnia magna）廣泛分布于淡水、海水和內(nèi)陸半咸水中[8]，其作為受試生物的優(yōu)點(diǎn)為：對(duì)環(huán)境變化的敏感性高，繁殖周期短，容易培養(yǎng)，體型透明易觀察等[9]。本文以四氯蟲(chóng)酰胺設(shè)計(jì)暴露濃度，進(jìn)行大型溞生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等指標(biāo)測(cè)試，主要包括首胎時(shí)長(zhǎng)、初次產(chǎn)溞數(shù)、單雌總產(chǎn)溞數(shù)、產(chǎn)胎數(shù)、蛻皮次數(shù)、體長(zhǎng)等[10]，評(píng)價(jià)四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)浮游動(dòng)物的毒理效應(yīng)，為四氯蟲(chóng)酰胺使用對(duì)水生生物影響的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

91.3%四氯蟲(chóng)酰胺原藥，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供；99.9%四氯蟲(chóng)酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，天津阿爾塔科技有限公司；乙腈（色譜純），F(xiàn)isher公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；乙腈（分析純），北京市通廣精細(xì)化工公司；甲酸（分析純）、氯化鈉（分析純）、無(wú)水硫酸鎂（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

萬(wàn)分之一天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；人工氣候箱，寧波海曙賽福儀器廠；150 mL燒杯，北京廣達(dá)恒益科技有限公司（北玻博美）；體式鏡OLYMPUS SZX10，廣州市明美光電技術(shù)有限公司；全溫度光照振蕩器DHZ-DB，寧波海曙賽福儀器廠；超高效液相色譜儀Agilant 1290-DAD，美國(guó)安捷倫科技有限公司；三重四極桿質(zhì)譜儀SCIEX TRIPLE QUAD 3500，SCIEX 公司；高速離心機(jī)75007211，Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)生物

大型溞，引自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，于室內(nèi)多年飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為（22±1）℃，L//D=16 h//8 h，每24 h投喂一次近頭狀尖胞藻（Pseudokirchneriella subcapitata）（濃度約為1.00×106個(gè)/mL）。

試驗(yàn)用溞為24 h內(nèi)的非頭胎溞，來(lái)源于同一母系，且母溞保種培養(yǎng)期間未表現(xiàn)出任何受脅迫現(xiàn)象，例如死亡率高、出現(xiàn)雄溞和冬卵、頭胎延遲、體色異常等。試驗(yàn)用溞在試驗(yàn)條件下馴養(yǎng)至少3 w。馴養(yǎng)期間，大型溞的日常培養(yǎng)條件如光照、溫度、飼喂量等須與試驗(yàn)條件一致。每24 h投喂一次近頭狀尖胞藻，每48 h更換曝氣自來(lái)水。

1.3 儀器分析條件

（1）液相色譜。Agilent 1290 Infinity 型液相色譜儀（UHPLC），SCIEX TRIPLE QUAD 3500質(zhì)譜儀；色譜柱：Acquity UPLC BEH C18，2.1 mm×50 mm（1.7 μm）；柱溫箱：35℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相洗脫：A：0.2%甲酸水，B：色譜純乙腈。洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫參數(shù)

表2 MRM 模式下四氯蟲(chóng)酰胺質(zhì)譜分析參數(shù)

（2）質(zhì)譜分析條件。電離方式：電噴霧電離（ESI），負(fù)離子；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；離子源噴針電壓（IS）：4 500.0V；離子源溫度（TEM）：500.0℃；碰撞氣（CUR）：68.95 kPa；氣簾氣（CAD）：55.16 kPa；離子源氣1（GS1）：344.75 kPa；離子源氣2（GS2）：413.7 kPa。

1.4 四氯蟲(chóng)酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取1.01 mg四氯蟲(chóng)酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈做溶劑，配制100 mg/L的儲(chǔ)備液10 mL，繼續(xù)用乙腈分別稀釋成0.30、0.50、1.00、3.00、6.00、10.00 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3的條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積和進(jìn)樣濃度為縱、橫坐標(biāo)做圖，得到四氯蟲(chóng)酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液線性回歸曲線。

1.5 水樣中四氯蟲(chóng)酰胺檢測(cè)

量取10 mL水樣于50 mL離心管中，加入10 mL萃取液（0.2%甲酸乙腈），在振蕩機(jī)上振蕩提取15 min后，加入氯化鈉1 g，無(wú)水硫酸鎂4 g，搖勻后再次振蕩提取5 min。置于臺(tái)式高速離心機(jī)以4 000 r/min離心5 min，分液后移取8 mL上清液至10 mL離心管中，吸取適量上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜待測(cè)。

1.6 試驗(yàn)中暴露溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取91.30%的原藥10.95 mg溶于50 mL水中，加入100 μL丙酮后超聲助溶，并定容至100 mL，得到母液濃度為100 mg/L的試驗(yàn)藥液，應(yīng)用于急性毒性試驗(yàn)和繁殖毒性試驗(yàn)。

1.7 急性毒性試驗(yàn)

參考經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則202[11]和童麗麗等[12]的方法并稍作改進(jìn)。用1.6中母液稀釋為1 mg/L后，配制急性毒性試驗(yàn)濃度依次為0、1.00×10-3、1.50×10-3、2.30×10-3、3.00×10-3、4.00×10-3、6.00×10-3mg/L的四氯蟲(chóng)酰胺溶液。其中曝氣水為空白對(duì)照組，0.1%丙酮為溶劑對(duì)照組。在每個(gè)150 mL燒杯中加入供試藥液75 mL和5只幼溞（出生6～24 h之內(nèi)的非頭胎溞），每處理設(shè)置4個(gè)平行試驗(yàn)共20只小溞。急性毒性試驗(yàn)期間不喂食，培養(yǎng)條件同1.2小節(jié)所述。分別在24 h和48 h觀察并記錄大型溞的活動(dòng)受抑制情況（或死亡率），并分析急性毒性結(jié)果。

1.8 繁殖毒性試驗(yàn)

參考經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則211[13]進(jìn)行試驗(yàn)并稍作修改。根據(jù)1.6中的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，參照48 h-EC50值1.31×10-3mg/L，分別設(shè)置1.25×10-6、6.25×10-6、2.50×10-5、5.00×10-5、1.00×10-4mg/L 5個(gè)暴露濃度，設(shè)曝氣水為空白對(duì)照組，同時(shí)設(shè)置0.1%的丙酮為溶劑對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。在每個(gè)150 mL燒杯中加75 mL試驗(yàn)藥液，每個(gè)燒杯中飼養(yǎng)1只溞，每24 h喂食一次，間隔48 h更換試驗(yàn)藥液。

試驗(yàn)周期為21 d，期間培養(yǎng)條件同1.2小節(jié)，每24 h統(tǒng)計(jì)大型溞首胎時(shí)長(zhǎng)、蛻皮次數(shù)、產(chǎn)小溞數(shù)、產(chǎn)胎數(shù)，并記錄21 d內(nèi)的死亡率和單雌總產(chǎn)溞數(shù)。在試驗(yàn)的最后1 d即第21 d，在體式鏡下測(cè)量存活大型溞的體長(zhǎng)（含肛刺）。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用胡好遠(yuǎn)等[14]的方法計(jì)算種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率；IBM SPSS Statistics 19軟件分析四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞急性毒性和繁殖毒性數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 試驗(yàn)藥液中四氯蟲(chóng)酰胺穩(wěn)定性分析

在0.3～10 μg/L范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積間呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=3705.1x＋65.552，R2=0.9972。根據(jù)測(cè)定的質(zhì)量濃度，換算得四氯蟲(chóng)酰胺的質(zhì)量濃度（表3）。結(jié)果表明，所測(cè)定的0.50、3.00、6.00 μg/L濃度處理組0 h和48 h的實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的偏差小于20%。因此，本研究中大型溞急性運(yùn)動(dòng)抑制試驗(yàn)過(guò)程中可不更換藥液，在繁殖毒性試驗(yàn)21 d暴露過(guò)程中每48 h更換一次藥液。

表3 四氯蟲(chóng)酰胺在試驗(yàn)水樣中48 h 實(shí)測(cè)濃度

2.2 急性毒性

在大型溞急性毒性試驗(yàn)中，空白對(duì)照組及溶劑對(duì)照組大型溞均活動(dòng)正常，無(wú)死亡。證明此次試驗(yàn)選用的大型溞狀態(tài)良好，試驗(yàn)結(jié)果可靠。其具體受抑制情況如表4所示。

表4 四氯蟲(chóng)酰胺大型溞急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表4，以IBM SPSS Statistics 19進(jìn)行分析，得到四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞急性毒性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果如表5，依據(jù)GB/T 31270.13—2014《化學(xué)農(nóng)藥安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第13部分：溞類(lèi)急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)》[15]中的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞急性毒性等級(jí)為劇毒。

表5 四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞急性毒性試驗(yàn)48 h 測(cè)定結(jié)果

2.3 繁殖毒性

試驗(yàn)進(jìn)行到21 d時(shí)，空白對(duì)照組及溶劑對(duì)照組中大型溞存活率為80%，表明試驗(yàn)結(jié)果可靠。由表6可以看出四氯蟲(chóng)酰胺可影響大型溞的首胎時(shí)長(zhǎng)，空白對(duì)照組與5.00×10-5mg/L和1.00×10-4mg/L處理組有顯著差異（p＜0.05），兩個(gè)濃度組使大型溞的首胎時(shí)長(zhǎng)顯著縮短；對(duì)初次產(chǎn)溞數(shù)來(lái)說(shuō)，2.50×10-5、6.25×10-6、1.25×10-6mg/L 3個(gè)處理組間差異不顯著。四氯蟲(chóng)酰胺暴露，縮短了大型溞首胎時(shí)長(zhǎng)，而對(duì)其初次產(chǎn)溞數(shù)有低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的現(xiàn)象。

表6 四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞首胎時(shí)長(zhǎng)和初次產(chǎn)溞數(shù)的影響

表7為四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞單雌總產(chǎn)溞數(shù)和平均產(chǎn)胎數(shù)的影響。由表中數(shù)據(jù)可以看出，各濃度處理組對(duì)單雌總產(chǎn)溞數(shù)無(wú)顯著影響。濃度為1.25×10-6～5.00×10-5mg/L的單雌總產(chǎn)溞數(shù)多于對(duì)照組單雌總產(chǎn)溞數(shù)，但濃度達(dá)到1.00×10-4mg/L時(shí)，單雌總產(chǎn)溞數(shù)降低；對(duì)于單雌平均產(chǎn)胎數(shù)來(lái)說(shuō)，四氯蟲(chóng)酰胺顯著促進(jìn)其產(chǎn)胎，5個(gè)濃度的處理組平均產(chǎn)胎數(shù)均高于兩對(duì)照組，其中，2.50×10-5、5.00×10-5mg/L和1.00×10-4mg/L處理組相比2個(gè)對(duì)照組有顯著差異。

表7 四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞單雌總產(chǎn)溞數(shù)和平均產(chǎn)胎數(shù)的影響

表8為四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞蛻皮次數(shù)和體長(zhǎng)的影響。由表中數(shù)據(jù)可以看出，隨著濃度的升高，大型溞21 d體長(zhǎng)無(wú)顯著差異；而四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞平均蛻皮次數(shù)也無(wú)顯著影響。

表8 四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞蛻皮次數(shù)和體長(zhǎng)的影響

采用胡好遠(yuǎn)等[14]的方法計(jì)算種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率，由表9可看出四氯蟲(chóng)酰胺暴露后，其種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率無(wú)明顯變化，空白對(duì)照和溶劑對(duì)照內(nèi)稟增長(zhǎng)率均為0.24；5個(gè)藥劑處理的內(nèi)稟增長(zhǎng)率為0.23～0.25，表明該試驗(yàn)濃度的持續(xù)暴露不會(huì)影響大型溞種群的繁衍。

表9 四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率的影響

3 結(jié)論

四氯蟲(chóng)酰胺在土壤中的殘留期比較長(zhǎng)，移動(dòng)比較活躍，所以一旦該藥在環(huán)境中富集到一定濃度，就會(huì)對(duì)非靶標(biāo)生物乃至其他生物產(chǎn)生慢性毒性[16]。本研究以四氯蟲(chóng)酰胺為供試藥劑，以大型溞為評(píng)估對(duì)象，研究了該藥劑對(duì)大型溞的急性毒性及繁殖毒性。急性毒性結(jié)果顯示，四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞EC50為1.31×10-3mg/L，表明該藥劑對(duì)大型溞急性毒性等級(jí)為劇毒。在供試藥劑暴露21 d后，評(píng)估其對(duì)大型溞的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的影響，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞的繁殖存在一定毒性：5.00×10-5、1.00×10-4mg/L濃度組使大型溞的首胎時(shí)長(zhǎng)顯著提前，而對(duì)其初次產(chǎn)溞數(shù)有低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的現(xiàn)象。各濃度處理組對(duì)單雌總產(chǎn)溞數(shù)無(wú)顯著影響，處理組單雌總產(chǎn)溞數(shù)稍多于空白對(duì)照組單雌總產(chǎn)溞數(shù)。對(duì)于平均產(chǎn)胎數(shù)來(lái)說(shuō)，2.50×10-5、5.00×10-5mg/L和1.00×10-4mg/L濃度處理組顯著促進(jìn)其產(chǎn)胎。但是其對(duì)大型溞的體長(zhǎng)無(wú)顯著抑制作用，隨著濃度的升高，大型溞體長(zhǎng)無(wú)顯著變化。四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞平均蛻皮次數(shù)也無(wú)顯著影響。本研究結(jié)果表明，四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)大型溞體長(zhǎng)、蛻皮次數(shù)、單雌總產(chǎn)溞數(shù)無(wú)顯著影響，對(duì)首胎時(shí)長(zhǎng)和平均產(chǎn)胎數(shù)有促進(jìn)作用，而對(duì)種群繁衍無(wú)不良影響。綜上，四氯蟲(chóng)酰胺在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用對(duì)大型溞存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，有必要進(jìn)一步進(jìn)行包括生態(tài)毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估在內(nèi)的一系列試驗(yàn)。