東北春小麥赤霉病抗性鑒定及抗病基因Fhb1檢測(cè)

劉東軍,宋維富,楊雪峰,趙麗娟,仇 琳,宋慶杰,張春利,辛文利,肖志敏

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所,黑龍江哈爾濱 150086)

小麥赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是由禾谷鐮孢菌(FusariumgraminearumSchwabe species complex)等多種鐮孢菌引起的一種全球性真菌病害[1]。近年來(lái),赤霉病暴發(fā)越來(lái)越頻繁,范圍越來(lái)越廣泛,危害越來(lái)越嚴(yán)重[2]。赤霉病不僅顯著降低了小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[3],而且,病原菌在侵染過(guò)程中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物——單端孢霉烯族毒素(trichothecene)被列為第三類(lèi)致癌物,對(duì)食品安全和人畜健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[4-5]。

培育抗性品種是解決赤霉病危害的根本方法,抗源是培育抗性品種的基礎(chǔ)。但是,赤霉病抗源十分匱乏。我國(guó)育種工作者通過(guò)大量工作篩選出了一些中抗品種(系),如:西農(nóng)511、揚(yáng)麥22、寧麥18、揚(yáng)輻麥2號(hào)、皖麥32等[6-14]。由于小麥赤霉病抗性遺傳基礎(chǔ)非常復(fù)雜,通過(guò)遺傳群體定位的赤霉病抗性數(shù)量性狀基因位點(diǎn)(quantitative trait loci, QTLs)多達(dá)432個(gè),覆蓋小麥21對(duì)染色體[15],培育抗性品種難度極大。當(dāng)前,赤霉病達(dá)到中抗水平的品種非常少,難以滿足生產(chǎn)需求。因此,我國(guó)赤霉病主要防治方法仍是選用中抗(感)品種結(jié)合化學(xué)防治[16]。目前,赤霉病已經(jīng)命名的抗性基因有Fhb1-Fhb7。其中,Fhb1基因來(lái)源于普通小麥,Fhb7基因是來(lái)源于長(zhǎng)穗偃麥草(Thinopyrumelongatum),二者均已被克隆,且可顯著減輕赤霉病危害[24-26]。

近年來(lái),隨著全球氣候變暖、雨熱同步效應(yīng)逐年加強(qiáng),赤霉病已經(jīng)成為東北春麥區(qū)第一大病害。與長(zhǎng)江中下游麥區(qū)相比,東北春小麥赤霉病抗源極端匱乏,抗性遺傳基礎(chǔ)研究相對(duì)滯后,難以滿足當(dāng)前小麥赤霉病抗性育種需求。因此,本研究對(duì)東北春小麥種質(zhì)資源進(jìn)行了赤霉病抗性鑒定,同時(shí)對(duì)來(lái)源于普通小麥且抗性效應(yīng)明確的Fhb1基因進(jìn)行了檢測(cè),以期篩選出優(yōu)異赤霉病抗性種質(zhì),加速東北春小麥赤霉病育種進(jìn)程,提升東北春小麥赤霉病抗性水平。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為1 592份東北春小麥種質(zhì)資源。其中包括農(nóng)家品種15份、推廣品種275份和優(yōu)良品系1 302份。另外引入材料7份(農(nóng)林34、農(nóng)林45、13DP33、13DP36、13DP38、13DP39和13DP40)。對(duì)照品種為蘇麥3(中抗)、龍麥36(中抗)、龍麥26(中感)、龍麥35(中感)、龍麥33(高感)和龍麥15(高感)。龍麥、龍輻麥和龍春系列小麥品種由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所提供,克豐、克旱、克澇和克春系列品種由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院提供,東農(nóng)系列品種由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供,墾大系列品種由八一農(nóng)墾大學(xué)提供,墾九系列品種由九三農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供,墾紅系列品種由紅興隆農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供,松花江系列品種由黑龍江種質(zhì)資源庫(kù)提供。師大系列材料由哈爾濱師范大學(xué)提供,遼春系列來(lái)源遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源庫(kù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 赤霉病抗性鑒定

赤霉病抗性鑒定于2019-2021年在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院民主科技園區(qū)的田間病圃和鑒病大棚同時(shí)進(jìn)行。每個(gè)材料種植1行,行長(zhǎng)1.5 m,行距0.3 m,株距5 cm,設(shè)3次重復(fù)。赤霉病菌為當(dāng)?shù)爻嗝共?yōu)勢(shì)致病鐮孢菌混合菌,由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保研究所提供。田間病圃鑒定方法:于小麥揚(yáng)花初期使用注射器進(jìn)行單花滴注接種,每個(gè)品種選取10個(gè)發(fā)育時(shí)期相近的單穗接種,選取穗中部露出黃色花藥小花注入10 μL分生孢子懸浮液(1×104個(gè)·mL-1),減去穗頂部作為標(biāo)記,記錄接種日期,接種后噴霧保濕。鑒病大棚鑒定方法:采用分生孢子噴霧法進(jìn)行接種。采用分生孢子噴霧法2 d接種1次,接種3～4次,鑒病大棚接種后每天噴霧保濕。接種21 d調(diào)查病小穗率。按NY/T2954-2016《小麥區(qū)域試驗(yàn)品種抗赤霉病鑒定技術(shù)規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)劃分抗性水平和小麥赤霉病嚴(yán)重度。田間單花滴注接種鑒定和大棚彌霧接種鑒定取嚴(yán)重度高的結(jié)果為準(zhǔn)。

1.2.2Fhb1基因分子檢測(cè)

在小麥三葉期取葉片,采用CTAB法提取小麥基因組DNA[27],用分子標(biāo)記鑒定Fhb1。采用Su等[28]開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記,TaHRC-STS-F:5′-ATTCCTACTAGCCGCCTGGT-3′,TaHRC-STS-R:5′-ACTGGGGCAAGCAAACATTG-3′,目標(biāo)片段大小為1.3 kb。PCR體系中包含1×PCR 緩沖液(10 mmol·L-1Tris-HCl pH8.8,50 mmol·L-1KCl),1.5 mmol·L-1MgCl2,0.2 mol·L-1dNTPs,0.1 mol·L-1引物,rTaqDNA聚合酶5 U·μL-1,40～60 ng模板DNA。PCR反應(yīng)在PCR儀(ETC811,東勝創(chuàng)新生物科技有限公司,中國(guó))上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃,5 min;95 ℃,30 s,55 ℃,60 s,72 ℃,90 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃,8 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%(g·mL-1)的瓊脂糖凝膠,以120 V恒壓電泳分離,溴化乙啶染色,凝膠成像系統(tǒng)(Essential V6,UVItec,法國(guó))進(jìn)行照相分析。其中,以蘇麥3號(hào)為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥赤霉病抗性鑒定

如表1所示,2019年,通過(guò)分生孢子噴霧法和單花滴注法鑒定578份材料,其中,中抗材料9份,占1.56%;中感材料191份,占33.04%;高感材料378份,占65.40%。13DP33、13DP36、13DP38、13DP39、13DP40表現(xiàn)出中抗,均來(lái)源于長(zhǎng)江中下游麥區(qū)。2020年,鑒定501份材料,其中,中抗材料11份,占2.20%;中感材料116份,占23.15%,高感材料374份,占74.65%。2021年,鑒定材料513份,其中,中抗材料9份,占1.75%;中感材料242份,占47.17%;高感材料262份,占51.07%。龍15-1557-1、龍17-4342-2、龍04-4230、龍10-0870和克春9在兩年均表現(xiàn)中抗。三年表型鑒定中抗材料共29份(表2),占1.82%;中感材料549份,占34.48%;高感材料1 014份,占63.69%,赤霉病抗性種質(zhì)資源較為匱乏,篩選出的29份材料為當(dāng)?shù)匦←溈剐杂N提供了寶貴的種質(zhì)資源。

表1 2019-2021年赤霉病抗性鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of FHB resistance during 2019-2021

表2 東北春小麥赤霉病抗性種質(zhì)資源篩選Table 2 Identification of FHB in northeast spring wheat

2.2 Fhb1基因分子檢測(cè)結(jié)果

分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn),在來(lái)源于日本的農(nóng)林34、農(nóng)林45和我國(guó)長(zhǎng)江中下游麥區(qū)的13DP33、13DP36、13DP38、13DP39和13DP40中均檢測(cè)出Fhb1基因;1 592份東北春小麥材料中均未檢測(cè)到Fhb1基因,表明赤霉病抗性抗性基因Fhb1在東北春小麥種質(zhì)資源中極其匱乏。29份中抗材料的抗性可能來(lái)源于其它赤霉病抗性基因。

M:DL2000;A圖,1:龍19-9718;2:龍19-9719;3:龍春208;4:13DP33;5:13DP36;6:13DP38;7:克春5;8:龍19-9170;9:龍麥15(陰性對(duì)照);10:蘇麥3號(hào)(陽(yáng)性對(duì)照);11:龍10-0870;12:龍04-4230;13:克14-891;14:農(nóng)林34;15:農(nóng)林45;16:龍09-9109;17:克春9;18:龍麥36;19:13DP39;20:13DP40。 B圖,1:龍麥23;2:龍麥24;3:龍麥26;4:龍麥27;5:龍麥29;6:龍麥30;7:龍麥31;8:龍麥32;9:龍麥15(陰性對(duì)照);10:蘇麥3號(hào)(陽(yáng)性對(duì)照); 11:龍麥33;12:龍麥35;13:龍麥36;14:龍麥37;15:龍麥39;16:龍麥40;17:龍麥51;18:龍麥59;19:龍麥60;20:龍麥67。M:DL2000;Fig.A, 1:Long 19-9718; 2:Long 19-9719; 3:Longchun 208; 4:13DP33; 5:13DP36; 6:13DP38 ; 7:Kechun 5; 8:Long 19-9170; 9:Longmai 15 (negative control); 10:Sumai 3(positive control); 11:Long 10-0870; 12:Long 04-4230; 13:Ke 14-891; 14:Nonglin 34; 15:Nonglin 45; 16:Long 09-9109; 17:Kechun 9; 18:Longmai 36; 19:13DP39; 20:13DP40. Fig.B, 1:Longmai 23;2:Longmai 24;3:Longmai 26;4:Longmai 27;5:Longmai 29; 6:Longmai 30;7:Longmai 31;8:Longmai 32;9:Longmai 15 (negative control); 10:Sumai 3 (positive control) ; 11:Longmai 33; 12:Longmai 35; 13:Longmai 36; 14:Longmai 37;15:Longmai 39;16:Longmai 40; 17:Longmai 51; 18:Longmai 59;19:Longmai 60;20:Longmai 67.圖1 小麥赤霉病抗性基因Fhb1分子標(biāo)記Fig.1 Molecular marker analysis of FHB resistance gene Fhb1of wheat

3 討論

3.1 拓寬東北春小麥赤霉病抗性種質(zhì)資源庫(kù)極為迫切

隨著全球氣候變暖,小麥赤霉病的發(fā)生愈加頻繁和嚴(yán)重。從赤霉病防治角度來(lái)看。培育赤霉病抗性品種是減輕赤霉病危害的最根本、最經(jīng)濟(jì)的方法。抗源是培育小麥赤霉病抗性品種根本,我國(guó)針對(duì)抗源篩選進(jìn)行了大量研究,并取得了一些進(jìn)展,2017-2021年,翟文玲等[7]鑒定了642份小麥種質(zhì)資源的赤霉病抗擴(kuò)展性,從中篩選出高抗種質(zhì)9份,占比1.40%,中抗種質(zhì)81份,占比12.62%。曹淑琳等[29]從江蘇省主推和新育成的280個(gè)小麥品種中,篩選到中抗及以上小麥種質(zhì)85份,占比30.36%。胡文靜等[10]發(fā)現(xiàn)黃淮麥區(qū)71個(gè)主栽小麥品種(系)中,7份為中抗,占比7.0%,17份材料為中感,占比24%。然而,東北春小麥赤霉病種質(zhì)資源中,中抗品種/系29份,占比僅1.82%,顯著低于長(zhǎng)江中下游麥區(qū)、黃淮麥區(qū)以及我國(guó)平均比例,表明東北春小麥赤霉病抗性種質(zhì)資源十分匱乏。當(dāng)前,赤霉病危害越來(lái)越嚴(yán)重,利用外引赤霉病抗性種質(zhì)拓寬東北春小麥赤霉病抗性種質(zhì)資源庫(kù)十分迫切。

3.2 加強(qiáng)赤霉病抗性基因在東北春小麥中的利用

目前,多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Fhb1基因可顯著降低赤霉病危害。張宏軍等[30]將Fhb1導(dǎo)入周麥16(赤霉病高感品種),通過(guò)對(duì)攜帶和不攜帶Fhb1基因的近等基因系的赤霉病抗性鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn):Fhb1顯著提升了小麥赤霉病抗性。許峰等[31]和馬紅勃等[32]將Fhb1基因?qū)敫胁∑贩N矮抗58中,顯著提高了株系赤霉病的抗擴(kuò)展能力。代旭冉等[33]發(fā)現(xiàn)含F(xiàn)hb1基因后代株系平均病小穗數(shù)和嚴(yán)重度均低于對(duì)照和輪回親本。此外,山東農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于長(zhǎng)穗偃麥草(Thinopyrumelongatum)Fhb7可降低赤霉病危害[26],提升小麥赤霉病抗性水平。

通過(guò)小麥赤霉病表型鑒定發(fā)現(xiàn):江蘇省59份小麥品種(系)中,9份攜帶Fhb1,占比15.25%[34]。四川省153份小麥品種/系中,12份含F(xiàn)hb1,占比7.8%[35]。寧麥系列23個(gè)品種中,攜帶Fhb1材料11個(gè),占比高達(dá)48.6%[36]。本研究中,除外引材料外,1 592份東北春小麥品種/系均未檢測(cè)到Fhb1。因此,在東北春麥區(qū),可加強(qiáng)赤霉病抗性基因Fhb1、Fhb7等應(yīng)用來(lái)提升赤霉病抗性水平。目前,本團(tuán)隊(duì)利用分子標(biāo)記和選擇性回交技術(shù)將Fhb1基因?qū)霒|北優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋春小麥遺傳背景中。

3.3 東北春小麥赤霉病抗性遺傳基礎(chǔ)有待發(fā)掘

胡文靜等[31]發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)江中下游地區(qū)小麥赤霉病抗性達(dá)到中感及以上水平的品種,攜帶Fhb1基因僅占26.9%,說(shuō)明Fhb1基因并非解決小麥赤霉病的唯一選擇。翟文玲等[8]對(duì)抗性種質(zhì)資源的分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn):抗性種質(zhì),如浩麥1號(hào)、冀師7225-28、南農(nóng)13Y110、石優(yōu)17和武農(nóng)6號(hào)等不攜帶目前已知抗赤霉病基因或QTLs[8]。廖森等[34]發(fā)現(xiàn)抗性種質(zhì),如:寧麥1529、鎮(zhèn)麥13322、K122、寧麥17320、寧麥17110和寧麥15219均不含F(xiàn)hb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5和QFhs.crc-2DL等已知抗性基因,表明可能存在著其他未被發(fā)掘的赤霉病抗性基因。本研究中的29份中抗材料均未檢測(cè)到抗病基因Fhb1,推測(cè)可能存在其他赤霉病抗性基因,有待于進(jìn)一步研究。