鹽酸克林霉素膠囊隨機開放兩周期兩交叉的人體生物等效性試驗

賈彩云 趙娜 宋浩靜 萬青華 許玉芳 胡義亭 郭彩會 董占軍

1966 年由Magerlein等首次合成克林霉素,作用機制為作用于敏感菌核糖體50S亞基,抑制細菌細胞的蛋白質(zhì)合成[1]。克林霉素是治療金黃色葡萄球菌骨髓炎的首選藥物,對需氧革蘭陽性球菌有較高抗菌活性,如葡萄球菌屬(包括耐青霉素及甲氧西林敏感株)、草綠色鏈球菌等;對厭氧菌也有抗菌作用,如梭形桿菌屬、消化鏈球菌等[2]。鹽酸克林霉素胃腸道吸收迅速,分布廣泛[3,4]。多次給藥無藥物蓄積現(xiàn)象,血透及腹透不能清除克林霉素[5,6]。參考《以藥動學參數(shù)為終點評價指標的化學藥物仿制藥人體生物等效性研究技術指導原則》[7],本研究選用石藥集團歐意藥業(yè)有限公司研發(fā)的克林霉素膠囊為受試者制劑,美國法瑪西亞普強公司(Pharmacia &UpjohnCo) 生產(chǎn)的鹽酸克CLEOCIN HCL為參比制劑,進行人體生物等效性臨床試驗。

1 資料與方法

1.1 一般資料 試驗方案經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會批準。試驗中的所有受試者均在充分了解試驗的目的、方法及風險后,自愿簽署知情同意書,年齡≥18歲,體重指數(shù) 18.0～26.0 kg/m2,進行體格檢查和實驗室檢測后合格的受試者隨機納入空腹試驗24例,餐后試驗24 例。空腹組年齡( 27.3±4.6) 歲,體重指數(shù)(22.56±1.89) kg/m2。餐后組年齡(25.7±4.1) 歲,體重指數(shù)(22.51±1.87) kg/m2。完成例數(shù):空腹試驗完成23例,1例受試者無脫落;餐后試驗完成24例,無脫落/剔除。

1.2 納入標準 (1)年齡>18周歲的女性和男性受試者; (2)女性體重≥45.0 kg,男性體重≥50.0 kg,體重指數(shù)(BMI)在19.0～26.0 kg/m2(包括臨界值);(3)體格檢查、生命體征檢查、12導聯(lián)心電圖、胸部X片、心臟彩超檢查、實驗室檢測及酒精呼氣檢測,結果正?；虍惓o臨床意義者;(4)沒有心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、精神神經(jīng)系統(tǒng)異常及代謝異常等病史。

1.3 排除標準 (1)對克林霉素或其他相關藥物(如林可霉素)有過敏史者;(2)有胃腸道疾病史或(和)存在吞咽困難者;(3)在篩選前3個月內(nèi)接受過手術治療,或者近期有手術計劃者,及既往接受過任何有可能會影響藥物代謝的手術者;(4)篩選前14 d內(nèi)發(fā)生腹瀉者;(5)有暈針暈血史者,不能耐受靜脈穿刺者;(6)篩選前6個月內(nèi)有藥物濫用史者;(7)篩選前3個月內(nèi)使用過毒品;(8)篩選前3個月內(nèi)入組了其他藥物臨床試驗或參加過其他的藥物臨床試驗;(9)篩選前3個月內(nèi)有獻血史者或失血≥200 ml者;(10)篩選前30 d內(nèi)使用過任何抑制或誘導肝臟對藥物代謝的藥物者,給藥前14 d內(nèi)使用過任何處方藥、非處方藥、中草藥、和維生素者等。

1.4 藥品 克林霉素膠囊受試制劑[T,規(guī)格:0.15 g/片,石藥集團歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號:國藥準字H13020795]; 克林霉素膠囊參比制劑[R,規(guī)格:0.15 g/片,Pharmacia and Upjohn Co生產(chǎn),批號:SGYM]?？肆置顾鼗瘜W對照品(純度94.7%,批號137371),Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn);鹽酸克林霉素-d3(內(nèi)標,純度96.0%,批號:9-AKS-149-2),Toronto Research Chemicals Inc公司生產(chǎn)?？瞻谆|(zhì),抗凝劑為肝素鈉的空白人血漿和全血(考察全血穩(wěn)定性)來自中國健康志愿者捐獻。甲醇(HPLC級)購于美國Fisher Chemical公司,乙腈(HPLC級)購于美國Fisher Chemical公司,甲酸(MS級)購于美國Honeywell公司。

1.5 給藥方案與血樣采集

1.5.1 本研究為在健康成年受試者中進行的單中心、單劑量、隨機、開放、雙周期、自身交叉對照試驗設計,評價克林霉素膠囊在空腹及高脂餐后兩種狀態(tài)下的生物等效性研究[8]。每周期給藥1次,健康受試者隨機分為2組,每組人數(shù)相等,

1.5.2 空腹組和餐后組受試者各24人,隨機分為2組進行,交叉給藥(12人/組),口服克林霉素膠囊受試制劑和參比制劑0.15 g,隔洗脫 7 d,每周期第1天服藥。空腹組受試者空腹過夜 >10 h,服用相應受試制劑,240 ml 水送服,在服藥0 h(服藥前1 h內(nèi))和服藥后10 min,20 min,30 min,45 min,1.00 h,1 h 20 min,1 h 40 min,2.00 h,2 h 30 min,3.00 h,4.00 h,5.00 h,6.00 h,8.00 h,12.00 h,24.00 h共17個時間點采集靜脈血,每次4 ml至EDTA-K2抗凝真空采血管中。餐后組受試者空腹過夜>10 h,于第2天早上在服藥前 30 min 開始高脂(提供食物中約50%的熱量)高熱量(約800～1 000 kcal)餐[9](30 min 內(nèi)結束進餐),在進餐后且以開始進餐時間計的30 min時服用相應受試制劑或參比制劑,240 ml水送服,在服藥0 h(餐后至服藥前)和服藥后0.25 h,0.50 h,0.75 h,1.00 h,1.50 h,2.00 h,2.50 h,3.00 h,3.50 h,4.00 h,4.50 h,5.00 h,6.00 h,8.00 h,10.00 h,12.00 h,24.00 h共18個時間點采集靜脈血,每次4 ml至EDTA-K2抗凝真空采血管中。見表1。

1.5.3 空腹組和餐后組所采集的血樣在1 h內(nèi)4℃條件下離心(1 700 g,10 min),從采血至離心的時間全程置于冰浴中,所有離心后血漿樣品將被分成兩份,2 h內(nèi)存放于≤-60℃冰箱中,以供藥代動力學分析。

1.6 測定方法與血樣處理

1.6.1 色譜條件:色譜柱:SHIMADZU,Shim-packGIST,C8,3 μm,2.1*50 mm;流動相:0.1%甲酸水(A)-100% 乙腈(B),梯度洗[0～0.30 min,20.0%;0.30～2.00 min,20.0% B→40.0% B ;2.00～2.01 min,40% B～90.0% B;2.01～2.60 min,95% B;2.60～2.61 min,95%B～20.0% B;2.61～3.10 min,20%B],流速:流速:0.400 ml/min; 柱溫:40℃;分析時間為3.10 min; 進樣量:2.0 μl。

1.6.2 質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,正離子方式檢測(ESI+);監(jiān)測方式:MRM 模式;接口溫度:300℃;脫溶劑管溫度:250℃;加熱塊溫度:400℃;霧化器流量:3 L/min;加熱器流量:10 L/min;干燥器流量:10 L/min?？肆置顾仉x子對為425.10/126.10,駐留時間為150.0 ms,預四級桿偏轉(zhuǎn)電壓偏差Q1 Pre為-13.0V,碰撞能量(CE)為-30.0 eV,預四級桿偏轉(zhuǎn)電壓偏差Q3 Pre為-24.0 V;克林霉素-d3離子對 428.10/129.10,駐留時間為150.0ms,Q1 Pre為-10.0 V,CE為-29.0eV,Q3 Pre 為-20.0 V。

1.6.3 血漿樣品處理:樣品室溫下融化后,渦旋混勻,取30.0 μl樣品(校正標樣,質(zhì)控樣品或測試樣品;對于雙空白樣品或QC0樣品,加入30.0 μl空白基質(zhì))至96孔板中,對于雙空白樣品及不含內(nèi)標的定量上限樣品加入30.0 μl 50% MeOH;其他樣品加入30.0 μl內(nèi)標溶液,搖勻;加入300 μl的100%MeOH,然后搖勻,約10 min,在約4℃條件下2 600×g離心10 min;轉(zhuǎn)移100.0 μl上清液至新的96孔板中,加入400 μl H2O,然后搖勻,約5 min,待進樣。

1.7 方法學考察 克林霉素在組織、體液或細胞中含量測定的方法報道較多。常用的有微生物法[10,11]、放射免疫分析法(RIA)、分光光度法[12]、氣相色譜法(GC)[13]、液相色譜法(HPLC)[14]、反相高效液相法(RP-HPLC)[15]或高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[16]等。本文采用的LC-MS/MS方法具有靈敏度高、選擇性高、分析速度快、使用范圍廣等特點,液質(zhì)聯(lián)用法的方法學驗證由蘇州國辰生物科技股份有限公司生物分析部完成。

1.8 統(tǒng)計學分析 應用Phoenix WinNonlin軟件(Certara USA Inc,7.0)對血藥濃度進行非房室模型藥代動力學參數(shù)的估算分析,計算主要藥代動力學參數(shù),使用SAS 9.2軟件進行生物等效性評價,將藥代動力學參數(shù) Cmax、AUC0-t、AUC0-∞ 經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后,進行方差分析和90%置信區(qū)間分析,Tmax用非參數(shù)法進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾克林霉素的測定 克林霉素的標準曲線10.0～2 500 ng/ml,該范圍內(nèi),以克林霉素峰面積與克林霉素-d3峰面積之比與克林霉素和克林霉素-d3濃度比作線性回歸方程,權重因子采取1/C2,R>0.99,R2>0.985。血漿樣品中克林霉素的提取回收率為93.4%～94.7%,內(nèi)標克林霉素-d3 的回收率為 92.8%?？肆置顾卦?0～2 500 ng/ml濃度,稀釋因子為 1∶10 時具有良好的稀釋可靠性。血漿樣本在-20℃條件下儲存28 d的穩(wěn)定性良好,-60℃條件下儲存29 d穩(wěn)定性良好;血漿樣本在-60℃條件下經(jīng)歷5次冷凍-解凍循環(huán)的穩(wěn)定性良好;血漿樣本在處理前室溫白光條件下放置25 h以及提取后進樣器(溫度設置:4℃)放置120 h穩(wěn)定性良好;全血樣本于冰浴白光下放置2 h的穩(wěn)定性良好; 基質(zhì)效應(包括溶血基質(zhì)效應與高脂基質(zhì)效應)、殘留均不影響血漿中克林霉素的準確定量。方法學驗證結果表明本方法可用于臨床試驗血漿樣品的分析。見表2。

表2 血漿中克林霉素的精密度和準確度

2.2 受試者入組及完成情況 空腹組24例健康受試者參加試驗,其中1例因不良事件退出,未參加第2周期,剩余23例受試者均按照方案要求完成試驗;餐后組24例健康受試者入組。

2.3 血藥濃度-時間曲線 空腹組和餐后組受試者口服受試制劑和參比制劑后,克林霉素的平均血藥濃度-時間曲線。見圖1。

圖1 受試者服用受試制劑(T) 和參比制劑(R)后克林霉素均血藥濃度-時間曲線

2.4 藥代動力學參數(shù) 健康空腹組和餐后組受試者口服克林霉素膠囊受試制劑和參比制劑的的主要藥代動力學參數(shù)。見表3。

表3 空腹和餐后受試者口服受試制劑和參比制劑后的主要藥代動力學參數(shù)

2.5 生物等效性分析 口服克林霉素受試藥物和參比藥物在空腹狀態(tài)下的Cmax、AUC0-t及 AUC0-∞的幾何均值的比值分別為92.29%,95.32%和95.59%,90% CI分別為 84.12%～101.27%,90.14%～100.79%和90.49%～100.98%,個體內(nèi)變異分別為18.42%,11.03% 和10.83%。在餐后狀態(tài)下 Cmax、AUC0-t及AUC0-∞的幾何均值的比值分別為95.79%,100.92%和101.65%,90% CI 分 別 為87.75%～104.56%,93.48%～108.95%,個體內(nèi)變異分別為17.81%,15.54% 和15.67%。同參比制劑比較,受試制劑Cmax、AUC0-t及 AUC0-∞的 90% 置信區(qū)間均落在參比制劑的80.00%～125.00%,說明兩種制劑具有生物等效性。

2.6 安全性評價 空腹服用受試制劑后,共4例(17.4%)受試者發(fā)生9例次不良事件,2例(8.7%)受試者發(fā)生6例次藥物不良反應。服用參比制劑后,共3例(12.5%)受試者發(fā)生4例次不良事件,3例(12.5%)受試者發(fā)生4例次藥物不良反應。服用受試制劑或參比制劑后均無嚴重、導致死亡和退出的不良事件和藥物不良反應發(fā)生,餐后服用受試制劑后,共2例(8.3%)受試者發(fā)生4例次不良事件。服用參比制劑后,共3例(12.5%)受試者發(fā)生5例次不良事件。不良事件均為Ⅰ級(NCI CTCAE 5.0)。服用受試制劑或參比制劑后均無藥物不良反應、嚴重、導致死亡和退出的不良事件和藥物不良反應發(fā)生,兩制劑的安全性基本一致。

3 討論

克林霉素是臨床常用的抗生素,屬林可酰胺類抗生素。與林可霉素抗菌譜相同,其抗菌活性更強。與林可霉素比較,克林霉素的抗菌活性增強4～8 倍,常用于敏感革蘭陽性球菌和厭氧菌引起的感染,是β-內(nèi)酰胺類過敏患者的首選藥物。國內(nèi)目前測定克林霉素的血藥濃度的方法:微生物法,靈敏度低,專屬性差,較難真正反映藥物在人體內(nèi)血藥濃度變化情況;液質(zhì)聯(lián)用的方法,靈敏度高,成本較高,難以普及。目前多采用液質(zhì)聯(lián)用測定血漿藥物濃度。

本試驗采用乙晴沉淀,鹽酸克林霉素-d3做內(nèi)標,LCMS/MS法測定血漿中克林霉素濃度并進行生物利用度及生物等效性研究。本試驗中,空腹口服受克林霉素膠囊試制劑和參比制劑Tmax中位數(shù)為0.5 h(0.33～1.33 h)、0.75 h(0.33～1.33 h);餐后口服克林霉霉素膠囊受試制劑和參比制劑后Tmax中位數(shù)為3.5 h(1.00～4.51 h)、2.50 h(0.50～4.00 h)。消除半衰期為3～4 h,表明克林霉素口服吸收快速完全,組織穿透性良好。與文獻報道一致。本試驗中的受試制劑 Cmax、AUC0-t及 AUC0-∞ 的90% 置信區(qū)間均落在參比制劑80.00%-125.00% 內(nèi),表明本試驗達到生物等效。受試制劑鹽酸克林霉素膠囊與參比制劑CLEOCIN HCL在中國健康成年受試者中,在空腹和餐后狀態(tài)下單次口服給藥,安全性較好?？崭範顟B(tài)下服用受試制劑后,共4例(17.4%)受試者發(fā)生9例次不良事件,2例(8.7%)受試者發(fā)生6例次藥物不良反應。服用參比制劑后,共3例(12.5%)受試者發(fā)生4例次不良事件,3例(12.5%)受試者發(fā)生4例次藥物不良反應。服用受試制劑或參比制劑后均無嚴重、導致死亡和退出的不良事件和藥物不良反應發(fā)生,兩制劑的安全性基本一致。餐后狀態(tài)下服用受試制劑后,共2例(8.3%)受試者發(fā)生4例次不良事件。服用參比制劑后,共3例(12.5%)受試者發(fā)生5例次不良事件。不良事件均為Ⅰ級(NCI CTCAE 5.0)。服用受試制劑或參比制劑后均無藥物不良反應、嚴重、導致死亡和退出的不良事件和藥物不良反應發(fā)生,兩制劑的安全性基本一致。

兩制劑在空腹和餐后給藥后藥時曲線相似,所發(fā)生的不良事件及發(fā)生率均相似。經(jīng)生物等效性評價,兩制劑生物等效。