溫曉萍

【摘要】? 目的? ? 探討熒光PCR探針熔解曲線法檢測結核分枝桿菌復合菌群（MTBC）對利福平、異煙肼耐藥性的價值。方法? ? 回顧性分析2018年6月—2021年4月惠州市職業(yè)病防治院收治的528例肺結核與耐多藥結核病患者的臨床資料。所有患者均進行痰液標本采集，采集后進行送檢，之后進行分離培養(yǎng)和藥敏試驗，采用熒光PCR探針熔解曲線法對MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性進行測定分析，最終獲得211份陽性菌株，再經鑒定為MTBC 208份，3份為非結核分枝桿菌。對熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能進行分析。結果? ? 經比例法進行的藥敏試驗結果顯示，208份MTBC菌種標本中，120份對利福平具有耐藥性，146例對異煙肼具有耐藥性；經熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，135份對利福平耐藥，敏感73份，其中僅有114份確定對利福平具有耐藥性；經熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，134份對異煙肼耐藥，敏感74份，其中有131份確定對異煙肼具有耐藥性。熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的特異度分別為76.14%，95.16%，對異煙肼耐藥性的檢測特異度高于利福平，差異具備統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對異煙肼耐藥性的檢測靈敏度低于利福平，準確度高于利福平，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能較高，可應用于快速發(fā)現耐藥基因位點突變，篩查耐多藥肺結核，并在治療中進行動態(tài)監(jiān)測，進而可指導臨床調整治療方案。

【關鍵詞】? 結核分枝桿菌復合菌群； 熒光聚合酶鏈式反應； 探針熔解曲線法； 利福平； 異煙肼； 耐藥性

中圖分類號：R446? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1672-1721（2023）16-0101-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.16.034

臨床中結核病屬于一種多發(fā)疾病，其主要是因為感染結核分枝桿菌導致，為嚴重威脅人類健康的傳染性疾病。結核病的主要傳播途徑為飛沫傳染，在人口密集大、人口流動大的公共場所中極易傳播，所以積防治結核病具有十分重要的意義。臨床呼吸內科中，重癥結核病屬于一種常見疾病，具有較高的發(fā)生率和病死率，需及時采取有效的治療措施，從而降低患者的病死率。結核病主要經呼吸道飛沫傳播所致，主要癥狀包括咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困難、長期午后潮熱等，部分患者會有倦怠乏力、盜汗、食欲減退和體重減輕等癥狀[1]。結核分枝桿菌包括麻風分枝桿菌、非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌復合菌群（MTBC），其中MTBC又包含人型結核分枝桿菌、鼠型分枝桿菌、牛型分枝桿菌等，MTBC可侵犯整個身體的各個器官，以肺部最為多見[2]。由于目前我國的結核病感染者數量較多，且發(fā)病率、病死率及耐藥率均處于較高水平。因此，探究MTBC對各類結核病的常用藥，如利福平、異煙肼的耐藥性，對于結核病的防治具有深遠意義[3]。熒光聚合酶鏈式反應（PCR）探針熔解曲線法可快速檢測出MTBC的藥敏結果，具有較高的操作靈活性[4]。本研究旨在探討熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的價值，報道如下。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 一般資料? ? 回顧性分析2018年6月—2021年4月惠州市職業(yè)病防治院收治的528例肺結核與耐多藥結核病患者的臨床資料，男289例，女239例，年齡31～67歲，平均年齡（44.67±5.91）歲。診斷標準：以《臨床診療指南·結核病分冊》[5]中的相關診斷標準作為參照。納入標準：滿足上述診斷標準者；非精神疾病，可進行正常溝通；無嚴重心、肝等功能異常等。排除標準：合并腦腫瘤者；依從性差者；存在免疫功能障礙者；存在造血系統(tǒng)功能異常者；對研究所用藥物過敏者等。

1.2? ? 方法? ? 所有患者均進行痰液標本采集，采集后進行送檢，嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[6]進行分離培養(yǎng)。使用至善全自動細菌鑒定及藥敏分析儀進行菌種鑒定及藥敏試驗。使用比例法檢測MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性，并按照2004年美國臨床和實驗室標準化委員會藥敏試驗判斷標準進行藥敏試驗；參照抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準推薦的篩選試驗和確證試驗進行超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）檢測，所用質控菌株均采購自原衛(wèi)生部臨床檢驗中心。之后采用熒光PCR探針溶解曲線法MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性進行測定分析，最終獲得211份陽性菌株，再經鑒定為MTBC 208份，3份為非結核分枝桿菌。

1.3? ? 觀察指標? ? （1）熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性結果。（2）熒光PCR探針熔解曲線法與金標準的檢出結果比較，其中金標準為比例法藥敏試驗。（3）熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能，包括特異度=真敏感例數/（假耐藥+真敏感）例數×100%，靈敏度=真耐藥例數/（真耐藥+假敏感）例數×100%，準確度=（真耐藥+真敏感）例數/總例數×100%。

1.4? ? 統(tǒng)計學方法? ? 使用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計數資料以百分比表示，采用χ²檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? ? 結果

2.1? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性結果? ? 經比例法進行的藥敏試驗結果顯示，208份MTBC菌種標本中，120份對利福平具有耐藥性，146份對異煙肼具有耐藥性。經熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，135份對利福平耐藥，敏感73份，其中僅有114份確定對利福平具有耐藥性；經熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，134份對異煙肼耐藥，敏感74份，其中有131份確定對異煙肼具有耐藥性，見表1。

2.2? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的特異度分別為76.14%，95.16%，對異煙肼耐藥性的檢測特異度高于利福平，差異具備統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對異煙肼耐藥性的檢測靈敏度低于利福平，準確度高于利福平，但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

3? ? 討論

結核病是由于結核桿菌感染人體所導致，根據感染部位的不同，可分為肺結核、淋巴結核、骨骼結核，且腎臟等其他部位也有可能感染結核[7]。具體而言，結核桿菌會入侵人體多個臟器官，其中肺部為主要累及部位，所以通常將其稱之為肺結核。肺結核以青年人為主要高發(fā)人群，具有慢性和緩發(fā)傳染病的特點，四季均可能發(fā)病，潛伏期在4～8周之間，除了感染肺部外，還可能感染骨骼、皮膚、腸、腹膜、腦膜以及頸淋巴等[7]。人和人之間的傳播方式主要為呼吸道傳染，傳染源是接觸到已經被感染的肺結核患者。近幾年來，隨著環(huán)境污染問題的日益嚴重和艾滋病傳播率上升等多種因素的影響，結核病的發(fā)生率呈現出逐年上升趨勢。結核病的臨床表現以呼吸系統(tǒng)癥狀為主，如咳嗽、咯血等，同時伴隨全身癥狀，如乏力、低熱等?？菇Y核藥物包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇等[8-9]，但隨著抗結核藥物的使用，有耐藥性的結核病患者數量逐漸增加。當患者同時至少對兩種一線抗結核藥物——利福平和異煙肼均出現耐藥性，即被稱為耐多藥結核病[10]。傳統(tǒng)MTBC耐藥性的檢測方法為絕對濃度法，不僅操作繁瑣、耗時較長，同時對菌株分離培養(yǎng)的速度慢，進而影響對MTBC耐藥性的診斷結果[11]。

熒光PCR探針熔解曲線法是目前廣泛應用于食源性致病菌檢測的方法，是一種體外核酸擴增技術，以DNA為模板，在體外合適條件下和耐熱DNA聚合酶作用下，對人工合成的寡核苷酸為引物進行特異性擴增目的DNA片段。傳統(tǒng)方法檢測致病菌檢出限僅為104 cfu/mL，而大多數PCR體系的檢出限可達到10～104 cfu/mL，具有較高的靈敏度[12]。本研究結果顯示，經比例法進行的藥敏試驗結果顯示，208份MTBC菌種標本中，120份對利福平具有耐藥性，146例對異煙肼具有耐藥性。經熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，135份對利福平耐藥，敏感73份，其中有114份確定對利福平具有耐藥性；經熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，134份對異煙肼耐藥，敏感74份，其中有131份確定對異煙肼具有耐藥性。熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的特異度分別為76.14%，95.16%，對異煙肼耐藥性的檢測特異度高于利福平，差異具備統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對異煙肼耐藥性的檢測靈敏度低于利福平，準確度高于利福平，但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。分析原因可能為：在MTBC對異煙肼的耐藥性檢測中，可覆蓋接近90%的異煙肼耐藥性菌株，要多于利福平，與郭紅革等[13]研究結論相符。

綜上所述，經熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能較高，可應用于快速發(fā)現耐藥基因位點突變，篩查耐多藥肺結核，并在治療中進行動態(tài)監(jiān)測，進而可指導臨床調整治療方案。但本研究未對敏感結核分枝桿菌菌株進行檢測，且未明確有無外源性再感染情況發(fā)生，還需進行多中心的深入研究。

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（收稿日期：2023-03-11）