楊宗維 龐偉興 羅麗萍 楊亞娟 秦國(guó)海

（桂林力源糧油食品集團(tuán)有限公司技術(shù)中心，廣西桂林 541000）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種偶蹄動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸性傳染病?？梢鹭i牛羊等多種偶蹄家畜和野生動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重疾病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的傳染病之一，被我國(guó)列為一類(lèi)動(dòng)物疫病[1]?？谔阋卟《靖鶕?jù)血清學(xué)試驗(yàn)可以分為7 種血清型，分別為O 型、A 型、C 型、亞洲1型（Asia1）、南非1 型（SAT1）、南非2 型（SAT2）和南非3 型（SAT3）[2]。根據(jù)7 個(gè)血清型的同源性又將其分為2 個(gè)群即O、A、C 型和亞洲1 型為一群，SAT1、SAT2、SAT3 為一群，2 個(gè)群之間的血清型同源性?xún)H為25%～40%，群內(nèi)同源性可達(dá)60%～70%，但血清型之間無(wú)交叉和交叉免疫現(xiàn)象[3]。亞洲流行O 型口蹄疫，偶有點(diǎn)發(fā)A 型口蹄疫[4]。為了全面保護(hù)生豬養(yǎng)殖，多價(jià)口蹄疫苗產(chǎn)品成為了市場(chǎng)主流[5]。依據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第2 635 號(hào)，我國(guó)亞洲1 型口蹄疫已達(dá)到全國(guó)免疫無(wú)疫標(biāo)準(zhǔn)。按口蹄疫流行的血清型分析，以O(shè) 型和A 型2 個(gè)血清型為主，其中O 型以Mya-98 和PanAsia 為主，A 型以Sea-97 株為主[6]。疫苗接種依然是特異性預(yù)防口蹄疫的有效手段，而口蹄疫滅活疫苗由完整病毒經(jīng)過(guò)滅活后制成，在預(yù)防和控制口蹄疫的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7]。根據(jù)口蹄疫的特點(diǎn)，選擇優(yōu)質(zhì)高效口蹄疫疫苗，也是構(gòu)建規(guī)?；i場(chǎng)生物安全體系的重要內(nèi)容[8]。綜上所述，本試驗(yàn)旨在為養(yǎng)殖企業(yè)快速長(zhǎng)效地提高豬群抗口蹄疫免疫力，篩選出高純度、高效價(jià)的豬用口蹄疫OA二價(jià)疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在桂林力源糧油食品集團(tuán)某養(yǎng)殖基地，選取52 日齡同批次仔豬1 341 頭，豬群健康狀況良好。

1.2 試驗(yàn)疫苗

試驗(yàn)疫苗采購(gòu)自市場(chǎng)常見(jiàn)6 個(gè)國(guó)內(nèi)品牌，均為豬用OA 二價(jià)滅活疫苗，廠(chǎng)家標(biāo)記為A、B、C、D、E、F。

1.3 試驗(yàn)試劑

2 種O 型、A 型抗體檢測(cè)試劑盒，S1 購(gòu)自北京金諾百特科技有限公司，S2 購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 疫苗146S 含量測(cè)定

試驗(yàn)疫苗進(jìn)行盲標(biāo)后，送中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所、中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠(chǎng)、中農(nóng)威特生物科技股份有限公司、申聯(lián)生物醫(yī)藥（上海） 有限公司進(jìn)行各疫苗146S含量檢測(cè)，146S 測(cè)定方法為蔗糖密度梯度離心法。

1.4.2 動(dòng)物試驗(yàn)

⑴疫苗免疫及分組：將1 341 頭52 日齡仔豬隨機(jī)分為1 至6 組，各組仔豬實(shí)際頭數(shù)分別為219 頭、251 頭、203 頭、216 頭、236 頭、216 頭。依次于52 日齡、85 日齡免疫A、B、C、D、E、F 等6 種口蹄疫疫苗，每次免疫1 頭份。除口蹄疫苗外的其他疫苗免疫程序、飼養(yǎng)方式、保健方案等均保持一致。

⑵監(jiān)測(cè)時(shí)間：分別于一免后26 d（78 日齡）、二免后30 d（115 日齡）、出欄前（170 日齡）3 次從每組隨機(jī)挑選25 頭豬進(jìn)行頸靜脈采血，檢測(cè)免疫后抗體。

⑶抗體結(jié)果判定與計(jì)算：S1 試劑盒O 型抗體、A型抗體判定標(biāo)準(zhǔn)：S/N≤0.5 為陽(yáng)性，S/N＞0.5 為陰性。S2 試劑盒抗體合格率計(jì)算模型：O 型抗體、A 型抗體效價(jià)≥1∶128 為合格，效價(jià)＜1∶128 為不合格，分別計(jì)算每種疫苗免疫后的O 型抗體合格率和A 型抗體合格率，并以O(shè) 型抗體合格率與A 型抗體合格率的平均值計(jì)算為疫苗的抗體合格率。S2 試劑盒平均抗體效價(jià)計(jì)算模型：計(jì)算每種疫苗免疫后的O 型抗體平均效價(jià)與A 型抗體平均效價(jià)，因?yàn)槟壳皣?guó)內(nèi)主要流行的是O 型口蹄疫，因此O 型和A 型按7∶3 的權(quán)重計(jì)算每種疫苗免疫后的加權(quán)平均抗體效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 146S 含量

4 家檢測(cè)單位測(cè)定146S 含量見(jiàn)表1、圖1，6 個(gè)疫苗的146S 含量差異明顯。雖然同一廠(chǎng)家同一批次的疫苗在不同檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)結(jié)果各不相同，但通過(guò)圖1 折線(xiàn)圖可以看出，各檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)的結(jié)果在趨勢(shì)上相同。為降低實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)誤差，最終以4 家機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果的平均值進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，所有廠(chǎng)家疫苗的146S抗原含量均超過(guò)10 μg/頭份，其中疫苗A、E 的抗原含量超過(guò)30 μg/ 頭份，疫苗D、F 的抗原含量在20～30 μg/頭份之間，疫苗B、C 的抗原含低于20 μg/頭份。

圖1 每毫升疫苗146S 含量

表1 疫苗中的146S 含量（μg/mL）

2.2 抗體水平

2.2.1 一免后抗體水平

通過(guò)表2 結(jié)果可看出，豬群第1 次免疫后，A、C、D 和E 等4 種疫苗的O 型和A 型抗體陽(yáng)性率均達(dá)到100%，疫苗B 和F 的抗體陽(yáng)性率略低，最低為88%。所有疫苗免疫1 次后的O 型和A 型抗體陽(yáng)性率均超過(guò)70%，符合國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫指導(dǎo)意見(jiàn)。

表2 一免后S1 試劑盒檢測(cè)結(jié)果

S2 試劑盒既可判斷抗體合格率又可測(cè)定抗體效價(jià)，本試驗(yàn)對(duì)所有血清進(jìn)行了效價(jià)測(cè)定，并計(jì)算了所有疫苗首免后抗體平均效價(jià)和抗體合格率，抗體結(jié)果列于表3。從表3 可以看出，疫苗B、C 和E 廠(chǎng)家的O 型抗體合格率超過(guò)70%，其余3 個(gè)疫苗均低于70%。所有疫苗的A型抗體合格率普遍高于對(duì)應(yīng)的O 型抗體合格率，只有疫苗F 的抗體合格率低于70%。根據(jù)首免抗體的合格率來(lái)看，不是所有疫苗均能達(dá)到國(guó)家對(duì)口蹄疫抗體合格率不低于70%的要求。比較O 型和A 型的平均抗體合格率，疫苗在一免后的排名順序?yàn)椋篊＞E＞B＞A＞D＞F。

2.2.2 二免后抗體水平

二免血清用S1 試劑盒檢測(cè)的抗體結(jié)果列于表4，通過(guò)表4 可看出，豬群第2 次免疫6 種疫苗后，除免疫疫苗F 的O 型抗體陽(yáng)性率為92%，免疫其他5 種疫苗O 型抗體陽(yáng)性率都能達(dá)到100%。且免疫疫苗C 和E 的A 型抗體陽(yáng)性率也達(dá)到100%，疫苗A、B、D 的A 型抗體陽(yáng)性率在90%以上，疫苗F 的A 型抗體陽(yáng)性率最低，為88%。

表4 二免后S1 試劑盒檢測(cè)結(jié)果

二免血清用S2 試劑盒的抗體檢測(cè)結(jié)果以及平均抗體效價(jià)和抗體合格率同列于表5，從表5 看出，6 種疫苗加強(qiáng)免疫后，O 型的抗體合格率均超過(guò)70%，其中疫苗B、C、E 高達(dá)100%，疫苗F 最低，僅為72%。對(duì)于高度烈性傳染病來(lái)說(shuō)，加強(qiáng)免疫后1 個(gè)月的抗體合格率僅為72%，顯然太低，在疫苗篩選時(shí)應(yīng)該直接剔除。在A 型抗體方面，6 個(gè)疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)和平均抗體效價(jià)均較好，遠(yuǎn)超70%的最低要求。綜合S2 試劑盒檢測(cè)的平均抗體合格率和平均抗體效價(jià)，疫苗在二免后的排名順序?yàn)椋篍＞C＞A≈B＞D＞F。

2.2.3 出欄前抗體水平

通過(guò)表6 可看出，豬群出欄前抗體水平，除免疫F疫苗的抗體陽(yáng)性率為96%外，免疫其他5 種疫苗O 型抗體陽(yáng)性率都能達(dá)到100%。且免疫疫苗B、C、D 和E的A 型抗體陽(yáng)性率也達(dá)到100%，免疫疫苗A 和F 的A型抗體陽(yáng)性率在90%以上。

由表7 可看出，所有疫苗的O 型和A 型的抗體合格率均高于70%，其中疫苗C 和疫苗E 的O 型和A 型的抗體合格率均高達(dá)100%，且平均抗體效價(jià)也最高，均超過(guò)400。疫苗A 和疫苗B 的抗體合格率和平均抗體效價(jià)都相近，無(wú)顯著差異。疫苗F 的出欄前平均抗體效價(jià)也較高，但樣本間的抗體效價(jià)差異很大，尤其是O 型抗體，有24%的＜128、44%為128～256、12%為256～512、12%為512～1024、有8%的≥1 024，如此懸殊的差異說(shuō)明免疫抗體的產(chǎn)生可能與豬只個(gè)體存在很大的關(guān)系。綜合O 型和A 型抗體合格率和平均抗體效價(jià)，疫苗在出欄前抗體的排名順序?yàn)椋篍≈C＞B≈A＞D＞F。

表7 出欄前S2 試劑盒檢測(cè)結(jié)果

3 討論

口蹄疫疫苗的質(zhì)量與抗原含量存在直接的關(guān)系，具體抗原含量達(dá)到多高才算合格，國(guó)際上沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)僅檢測(cè)了各疫苗的146S 抗原含量，排名順序?yàn)椋篍＞A＞F＞D＞B＞C。其中疫苗E 和A 的每頭份抗原含量超過(guò)30 μg、疫苗D 和F 的抗原含量在20～30 μg、疫苗B 和C 的抗原含量在20 μg 以下。

根據(jù)S1 試劑盒檢測(cè)結(jié)果，首免后抗體陽(yáng)性率最低的F 疫苗也達(dá)到了88%，說(shuō)明6 種疫苗免疫后都可以在1 個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生有效的抗體應(yīng)答。不同抗體檢測(cè)方法對(duì)豬口蹄疫疫苗臨床免疫評(píng)價(jià)的陽(yáng)性率差異不明顯[9]，S1 試劑盒只能進(jìn)行定性檢測(cè)，難以評(píng)價(jià)每種疫苗的免疫質(zhì)量差異。液相阻斷ELISA 與病毒中和試驗(yàn)高度相關(guān)[10]，為此，本文用S2 試劑盒再次測(cè)定了O 型和A 型的抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，疫苗C 的首免O 型和A 型抗體合格率均達(dá)到100%，平均效價(jià)超過(guò)256，為所有疫苗中最好，可是疫苗C 的146S 抗原含量在6 個(gè)評(píng)估疫苗中最低，特別是遠(yuǎn)低于疫苗E 和疫苗A。146S 粒子易受環(huán)境影響分解[11]，說(shuō)明疫苗抗原含量評(píng)價(jià)口蹄疫疫苗質(zhì)量有不確定性?？谔阋咭呙缡且环N油佐劑滅活疫苗，其起保護(hù)作用的主要因素是免疫抗體。因此，對(duì)于豬場(chǎng)來(lái)說(shuō)更應(yīng)該把免疫抗體作為篩選疫苗和免疫質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要因素。本研究中依據(jù)S2 試劑盒的檢測(cè)結(jié)果綜合考慮O 型和A型疫苗的免疫抗體，各疫苗的首免抗體排名為：C＞E＞B＞A＞D＞F。綜合來(lái)看，疫苗C 和E 能夠在一免后為豬群防控口蹄疫O 型和A 型感染提供更快速有效的保護(hù)。

加強(qiáng)免疫后，通過(guò)S1 試劑盒檢測(cè)結(jié)果，疫苗C 和E 的保護(hù)率優(yōu)于其他疫苗。結(jié)合S2 試劑盒的檢測(cè)結(jié)果，二免后豬群抗體合格率都有一定程度提升，但A 型平均抗體效價(jià)有升有降。綜合來(lái)看，疫苗C 和E 在二免后能夠全面產(chǎn)生口蹄疫O 型和A 型抗體，且疫苗E 的抗體效價(jià)相對(duì)更高。同時(shí)疫苗B 和D 在分別針對(duì)O 型和A型口蹄疫方面表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)。

口蹄疫疫苗的免疫持續(xù)期為6 個(gè)月，但由于流行毒株和疫苗毒株在抗原性上存在一定的差異，疫苗誘導(dǎo)的針對(duì)流行毒株的免疫保護(hù)期可能會(huì)縮短，抗原差異越大免疫保護(hù)期就越短[12]。出欄前S1 試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，各組抗體水平有了進(jìn)一步升高，說(shuō)明6 種疫苗保護(hù)期可滿(mǎn)足出欄（170 日齡）需求。結(jié)合S2 試劑盒檢測(cè)結(jié)果，此時(shí)各組之間抗體水平差距縮小，且都有強(qiáng)陽(yáng)性的結(jié)果，出欄前6 種疫苗O 型抗體合格率排序?yàn)镃≈E＞B≈A＞D＞F。綜合來(lái)看，免疫疫苗C 和E 的豬群的抗體效價(jià)更高、長(zhǎng)效保護(hù)率更好。

對(duì)比首免、二免和出欄前的抗體排名情況，首免抗體較好的疫苗C 和疫苗E，在加強(qiáng)免疫后1 個(gè)月和出欄前的抗體水平也一直最好，在6 種疫苗中始終保持靠前水平。疫苗D 和疫苗F 的首免抗體較差，在二免后和出欄前的抗體水平也最差。因此，本文認(rèn)為僅用首免后1個(gè)月的抗體結(jié)果完全可以作為篩選疫苗和進(jìn)行疫苗免疫質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)。由于不同品牌的試劑盒，檢測(cè)結(jié)果有差異[13]，建議結(jié)合目的篩選合適的試劑盒作為評(píng)價(jià)的工具。

在本研究中，疫苗A、D 和F 首免1 個(gè)月的O 型抗體合格率均低于國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫指導(dǎo)意見(jiàn)對(duì)口蹄疫疫苗免疫抗體不低于70%的要求，在3 次抗體檢測(cè)排名中，這3 種疫苗均排名靠后，因此，建議對(duì)于首免1個(gè)月的S2 試劑盒O 型抗體合格率低于70%的疫苗可以直接淘汰。

有文獻(xiàn)報(bào)道，口蹄疫疫苗免疫效果與抗原含量呈正相關(guān)[14]。本試驗(yàn)根據(jù)146S 的檢測(cè)結(jié)果，在6 種疫苗中，疫苗A 和E 的抗原含量最高，均超過(guò)30 μg，但二者的3 次抗體檢測(cè)結(jié)果均存在巨大差異，說(shuō)明相同抗原含量的疫苗不一定能誘導(dǎo)產(chǎn)生同樣的免疫抗體反應(yīng)。同樣，疫苗C 的抗原含量?jī)H為13.4 μg，約為疫苗E 的1/3，但二者免疫后的抗體結(jié)果非常接近，均達(dá)到較高水平，在3 次抗體檢測(cè)結(jié)果中均排名前2 位，說(shuō)明抗原含量并不是越高越好，疫苗的免疫效果除了與抗原含量有關(guān)外，還與疫苗種毒的免疫原性、佐劑等也有關(guān)系。有文獻(xiàn)指出，如果疫苗中存在高濃度的非抗原蛋白會(huì)抑制口蹄疫146S 抗原的免疫效果[15]。

4 結(jié)論

146S 抗原含量是影響口蹄疫疫苗質(zhì)量的重要因素之一，本次試驗(yàn)認(rèn)為單純的通過(guò)146S 含量無(wú)法評(píng)估一款口蹄疫疫苗的保護(hù)效果，還需要結(jié)合更多的產(chǎn)品數(shù)據(jù)及動(dòng)物試驗(yàn)。本試驗(yàn)建立了口蹄疫OA 疫苗S2 試劑盒的平均抗體合格率和加權(quán)平均抗體效價(jià)的計(jì)算模型，并評(píng)價(jià)了6 個(gè)廠(chǎng)家疫苗的質(zhì)量差異，為后續(xù)開(kāi)展口蹄疫疫苗質(zhì)量評(píng)估提供了依據(jù)。