移植腎間質(zhì)纖維化與抗纖維化研究進展

王昊天 王毅

腎移植已成為改善終末期腎病患者身體狀況和生活質(zhì)量的最佳選擇。近年來,移植腎的短期存活率已有了明顯提高,但長期存活率仍不理想。移植腎間質(zhì)纖維化是由于在各種損傷因素的刺激下,細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)產(chǎn)生和降解失衡所引起的進行性腎功能減退,最終造成移植腎失功[1]。在Banff分類中,將慢性移植物病變定義為腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis)、腎小管萎縮(renal tubular atrophy)、動脈纖維內(nèi)膜增厚、小動脈透明變性、系膜基質(zhì)增加和移植腎小球病[2,3]。由于腎小管間質(zhì)占腎臟體積的90%,而腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮往往又同時發(fā)生,故腎間質(zhì)纖維化/腎小管萎縮是CAD最突出的病理表現(xiàn),常作為一個因素進行評估。在移植術(shù)后3～6個月時,約40%的同種異體移植腎可檢測到腎間質(zhì)纖維化/腎小管萎縮,術(shù)后2年增加至約65%[4]。但是,到目前為止,筆者發(fā)現(xiàn)還沒有證據(jù)表明移植腎間質(zhì)纖維化的病理與一般腎疾病中觀察到的間質(zhì)纖維化病理存在顯著差異,因此,本文討論一般腎疾病間質(zhì)纖維化及抗纖維化過程,著重關(guān)注在移植腎領域的進展,綜述如下。

1 腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的主要機制

腎小球和腎小管損傷后的早期纖維化是有效恢復的表現(xiàn),但在疾病的中晚期,組織損傷嚴重或反復損傷超過周圍實質(zhì)細胞的再生能力,間質(zhì)纖維結(jié)締組織大量增生,正常組織修復失衡,此時纖維化則為病理性的[5-8]。移植腎間質(zhì)纖維化可由免疫和非免疫損傷引起。Mortensen等[9]研究分析確定了4種與間質(zhì)纖維化程度高度相關(guān)的蛋白,結(jié)果與細胞骨架構(gòu)建和免疫反應是移植腎間質(zhì)纖維化普遍過程的觀點相符。

1.1 參與腎間質(zhì)纖維化過程的細胞 不同細胞類型參與了間質(zhì)纖維化過程,有參與排斥反應的免疫細胞,有介導ECM沉積的腎小球系膜細胞、成纖維細胞、周細胞以及血管平滑肌細胞,介導血栓性微血管病變的內(nèi)皮細胞,還有參與免疫反應的B細胞,T細胞等,這些細胞直接或間接受到影響,發(fā)生一系列反應并介導損傷與修復。在纖維化的后期,幾乎所有的細胞參與其中[10]。

肌成纖維細胞表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),可以增加膠原纖維和ECM大分子的表達,并抑制ECM降解酶,是介導IF/TA發(fā)生的主要效應細胞之一[11]。其有多種細胞來源,如成纖維細胞、血管周細胞、腎小管上皮細胞等。Kuppe等[10]利用單細胞RNA測序分析了健康和纖維化腎臟中近端小管和非近端小管細胞的轉(zhuǎn)錄體,確定了周細胞和成纖維細胞的不同亞群是腎間質(zhì)纖維化過程中肌成纖維細胞的細胞來源。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymaltr ansition,EMT),內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothlial mesenchymal transition,EndoMT)均是肌成纖維細胞來源和誘導移植腎間質(zhì)纖維化的機制[12-14]。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超蛋白家族、炎性因子以及活性氧等幾種自分泌或旁分泌信號分子可誘導EndoMT發(fā)生,而血管內(nèi)皮生長因子-A和一些microRNA(如miR-155)則是EndoMT的負調(diào)控因子[15,16]。

巨噬細胞是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生過程中的關(guān)鍵細胞類型。Li等[17]研究表明巨噬細胞可通過p38信號通路激活使同種異體移植炎癥因子1的表達上調(diào),促進腎成纖維細胞活化為促纖維化表型。有兩種不同的巨噬細胞類型介導腎損傷和修復:促炎型(M1)和抗炎型(M2)。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn),在小鼠腎移植模型中,約一半的α-SMA+肌成纖維細胞來自于受者骨髓源巨噬細胞,并且骨髓源M2型巨噬細胞可通過Smad3依賴性機制促進巨噬細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變(macrophage to myofibroblast transition,MMT),有助于移植腎間質(zhì)纖維化形成。

γδ T細胞是一種效應性淋巴細胞,在間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮重要作用。Law等[19]在有間質(zhì)纖維化的人腎活檢組織中檢測到γδ T細胞數(shù)量顯著升高,聚集于腎小管間質(zhì);并首次發(fā)現(xiàn)γδ T細胞是促炎細胞因子IL-17A的來源。

1.2 參與腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的反應

1.2.1 炎癥和排斥反應:2017年和2019年Banff標準中依據(jù)慢性移植腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮區(qū)域內(nèi)炎癥細胞浸潤程度,對慢性活動性T細胞介導的排斥反應新增了嚴重程度的分級,表現(xiàn)出對隱匿、持續(xù)的排斥反應所致的IF/TA的重視,體現(xiàn)出間質(zhì)纖維化區(qū)域內(nèi)炎癥(inflammation in areas of fibrosis,i-IFTA)和腎小管萎縮區(qū)域內(nèi)炎癥與移植腎不良結(jié)局的相關(guān)性[3]。Matas等[20]在腎移植后90 d(n=598)的活檢中檢測了i-IFTA和萎縮區(qū)域的腎小管炎的影響,結(jié)果與這一結(jié)論相符。 i-IFTA是活性T細胞介導的同種免疫的組織學結(jié)果,代表炎癥和腎小管損傷與纖維化愈合之間的界限,不受控制的i-IFTA參與介導纖維化等不良結(jié)構(gòu)和功能改變過程[21,22]。此外,有學者研究了供者循環(huán)特異性抗HLA抗體(HLA-DSA)在移植腎間質(zhì)纖維化的作用,結(jié)果提示,移植后攜帶HLA-DSA的患者與未攜帶HLA-DSA的患者相比,移植后1年及以上的活檢顯示IF/TA進展明顯加快。循環(huán)HLA-DSA是早期和加速同種異體移植物纖維化的主要決定因素,并且獨立于傳統(tǒng)危險因素和抗體介導的排斥反應發(fā)揮作用[23]。

1.2.2 補體及凝血級聯(lián)反應:補體增強了同種異體反應性T細胞免疫過程,導致移植排斥,并且介導間質(zhì)纖維化形成。C3參與腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活和促進EMT,C5/C5aR的缺失(但不阻斷膜攻擊復合物形成)可以抑制腎臟間質(zhì)纖維化形成[24,25]。凝血系統(tǒng)的激活與移植物的病理狀況同樣相關(guān),可以通過與補體蛋白水解級聯(lián)反應的復雜相互作用,介導先天免疫系統(tǒng)的激活,并通過其對樹突狀細胞的影響,參與同種抗原特異性適應性反應的擴增。因此,凝血和補體系統(tǒng)可能被視為調(diào)節(jié)先天免疫和防止進行性移植物損傷的潛在治療靶點。靶向凝血和補體兩種蛋白水解系統(tǒng)共有的作用點可能減少腎移植中先天性免疫系統(tǒng)的激活,減少其對移植物結(jié)構(gòu)和功能的損害[26]。

1.2.3 缺血缺氧:腎移植過程中的缺血缺氧可引起移植物損傷,Heylen等[27]發(fā)現(xiàn)在經(jīng)歷缺血的所有同種異體移植物中DNA甲基化水平急劇增加,高甲基化可影響參與抑制腎損傷和纖維化的基因表達。而且,移植物植入前DNA高甲基化可預測移植后1年的慢性損傷,特別是間質(zhì)纖維化和腎小球硬化。缺血再灌注損傷可導致急性腎損傷和移植腎功能延遲恢復(delayed graft function,DGF),促進間質(zhì)纖維化發(fā)生。Heilman等[28]報道了供體來源的纖維化可能增加DGF的幾率,但DGF似乎不會加劇移植后第1年纖維化的進展。

1.3 介導腎間質(zhì)纖維化的信號通路 參與腎間質(zhì)纖維化的信號通路眾多,包括TGF-β1,Hedgehog信號通路、Wnt通路以及HIF-1和ROS等,已證實TGF-β1水平持續(xù)升高與促纖維化信號網(wǎng)絡的激活有因果關(guān)系,TGF-β1是腎間質(zhì)纖維化形成的主要驅(qū)動因素。TGF-β1可激活ALK5 I型受體以及非經(jīng)典(如src激酶、EGFR、JAK/STAT、p53)通路,共同驅(qū)動纖維化基因組程序。HIGGINS等報道了小鼠腎小管中p53基因的敲除可防止上皮細胞G2/M期阻滯,減少纖維化效應細胞的分泌,并減緩急性至慢性腎損傷的轉(zhuǎn)變[29]。Hong等[30]報道,損傷發(fā)生時,腎臟上皮和間質(zhì)Notch1信號活化,通過激活下游TGF-β1/Smad2/3信號轉(zhuǎn)導促進成纖維細胞向肌成纖維細胞分化,促進ECM沉積,介導間質(zhì)纖維化。

1.4 免疫抑制劑與移植腎間質(zhì)纖維化 免疫抑制劑在發(fā)揮免疫抑制效應的同時,其毒性損傷也是導致移植器官慢性失功的重要因素。經(jīng)典的免疫抑制劑包括鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、麥考酚酸等,它們都會增加移植腎間質(zhì)炎癥和纖維化[31]。Xia等[32]研究發(fā)現(xiàn)通過抑制NLRP3炎性小體介導的TGF-β/Smad通路,可以保護環(huán)孢素A誘導的腎毒性和腎間質(zhì)纖維化。Dao等[33]研究發(fā)現(xiàn)大麻素受體1(Cannabinoid receptor 1,CB1)在正常移植腎中低表達,但在CAD中高表達。在他克莫司誘導的腎小管間質(zhì)纖維化形成的體外模型中,他克莫司可顯著促進CB1的mRNA和蛋白表達。給予CB1拮抗劑利莫那班可減弱腎小管細胞合成膠原,減緩間質(zhì)纖維化進展。

2 抗間質(zhì)纖維化治療進展

由于CAD的影響因素眾多、機制復雜,對于CAD的治療,臨床上主要包括:調(diào)節(jié)飲食結(jié)構(gòu)、降低激素和免疫抑制藥物的劑量、應用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、調(diào)控血壓和降尿酸等,尚無統(tǒng)一的標準治療路徑。因此,深入研究有效并且實用的抗間質(zhì)纖維化防治策略是當前的重點難點。

2.1 細胞靶向 腎間質(zhì)纖維化過程復雜,靶向參與間質(zhì)纖維化形成過程中的細胞及其來源是研究抗纖維化治療的一種基本策略。白藜蘆醇通過靶向成纖維細胞活化和EMT,從而抑制單側(cè)輸尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction,UUO)所致纖維化模型中肌纖維母細胞表型和纖維化形成,并且抑制間質(zhì)和小管中上皮細胞增殖相關(guān)信號通路(MAPK、PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和JAK2/STAT3)的活性[15,34]。利拉魯肽是一種長效胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物,在UUO間質(zhì)纖維化模型中,利拉魯肽結(jié)合并激活GLP-1受體,抑制TGF-β1/Smad3和ERK1/2信號通路的激活,減少ECM分泌和沉積,阻止EMT發(fā)生,起到減輕間質(zhì)纖維化的作用[35]。

眾多研究表明,干細胞治療具有腎臟保護作用,Wang等[36]研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,AMSCs)誘導巨噬細胞表型從M1型轉(zhuǎn)變M2型,在UUO間質(zhì)纖維化動物模型中,AMSC治療可以通過抑制間質(zhì)炎癥減輕纖維化的進展。 Xing等[37]研究表明骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)輸注可抑制UUO誘導的肌成纖維細胞活化和增殖;此外,MSC減弱了UUO小鼠巨噬細胞的腎小管間質(zhì)浸潤,從而減輕間質(zhì)纖維化;因此,干細胞治療是一種有前景的抗間質(zhì)纖維化策略。

調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)可以在移植免疫反應的急性期減輕間質(zhì)炎癥,逆轉(zhuǎn)腎移植排斥反應,可能參與調(diào)節(jié)纖維化過程。Chandran等[38]對三名腎移植受者進行了一項自體Treg細胞治療的安全性和可行性試驗。結(jié)果表示在接受免疫抑制的腎移植患者中分離、擴增、輸注Tregs是可行的。但參與者數(shù)量有限,無法檢測移植物炎癥的改善情況,也無法得出移植腎纖維化與Tregs輸注之間的任何相關(guān)性。接下來,研究多克隆和供體同種抗原反應性Tregs治療療效以及Tregs有效性機制將是移植腎抗間質(zhì)纖維化新的熱點。

常規(guī)細胞治療由于給藥細胞的滯留較低,作用有限,效果欠佳。Oka等[39,40]最近報道了肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)轉(zhuǎn)基因間皮細胞片移植在大鼠腎纖維化模型中表現(xiàn)出較強的治療作用,轉(zhuǎn)基因細胞片移植可增加腎臟活化HGF受體的表達并且通過微血管阻止了腎間質(zhì)纖維化進展。因此,細胞片治療是一種新的和有希望的策略。

2.2 分子靶向 血管緊張素Ⅱ促進血管收縮和醛固酮釋放以升高血壓,有促氧化、促炎和促間質(zhì)纖維化作用。抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)可減輕間質(zhì)纖維化進展,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制提供的保護作用可降低移植物中的毛細血管稀疏、淋巴管生成和足細胞損傷,減輕腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[41]。Nafar等[42]發(fā)現(xiàn)氯沙坦治療可降低腎移植患者組織miR-21和TGF-β的表達,減輕組織間質(zhì)纖維化,對移植腎功能有保護作用。但RAS阻斷在腎移植受者中的益處仍有爭議,最近的一項薈萃分析指出需要有>10 000受試者進行臨床實驗,結(jié)果才具有統(tǒng)計學意義[43,44]。

吡非尼酮(Pirfenidone,PFD)是一種以TGF-β和腫瘤壞死因子-α為靶點的抗纖維化、抗氧化和抗炎藥物,已被批準用于特發(fā)性肺纖維化治療。研究發(fā)現(xiàn)PFD對CAD的腎損傷同樣具有保護作用,可以減輕移植腎間質(zhì)炎癥及纖維化程度[45]。然而,是否采用抗TGF-β治療目前來說仍具有爭議。

一方面,TGF-β是調(diào)節(jié)所有器官纖維化的關(guān)鍵介質(zhì),尤其是腎臟;另一方面,TGF-β調(diào)節(jié)多種生物學和病理學過程,阻斷TGF-β將產(chǎn)生各種副作用,包括帶狀皰疹、膿皰性皮疹、出血疾病等[46]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是大多數(shù)TGF-β信號通路中的共同輔助因子,β-catenin與T細胞因子(T cell factor,TCF)結(jié)合激活促纖維化基因,而與誘導的Tregs分化的轉(zhuǎn)錄因子Foxo結(jié)合,則促進細胞存活[47]。Qiao等[48]研究結(jié)果表明,抑制β-catenin /TCF介導的TGF-β促纖維化作用,同時增強β-catenin /Foxo介導的抗炎作用,可能是抗TGF-β治療的策略之一。

近年來,對移植腎間質(zhì)纖維化理解的一個重大轉(zhuǎn)變是:認識到表觀遺傳標記物(在不改變DNA序列的情況下控制基因表達的調(diào)節(jié)過程)整合了引發(fā)間質(zhì)纖維化的各種內(nèi)在和外在調(diào)節(jié)機制。表觀基因組代表遺傳學和環(huán)境之間的融合,在移植的情況下,環(huán)境從供體轉(zhuǎn)移到受體,從而提供表觀基因組的明顯改變,包括DNA甲基化模式、組蛋白修飾和非編碼RNA(ncRNA)的作用,其中MicroRNA(miRNA)最近研究較多,可通過影響mRNA的轉(zhuǎn)錄后降解和抑制蛋白質(zhì)的翻譯來引起靶基因的抑制。

Matz等[49]報道了血漿樣本中miR-21、miR-142-3p和miR-155的表達改變與同種異體腎移植功能障礙有關(guān),并可用于腎移植中的移植物功能監(jiān)測。有研究顯示,IF/TA患者移植腎中miR-378的水平顯著低于健康對照組,miR-378處理顯著降低了缺血再灌注損傷后1 d的細胞凋亡率和腎小管損傷評分,減少了白細胞浸潤,miR-378對移植腎IF/TA以及預防IRI具有潛在的保護作用[50]。

長非編碼RNA(lncRNA)和miRNAs之間存在相互作用,許多學者正在研究這些循環(huán)生物標志物之間的復雜關(guān)系。隨著大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組分析的發(fā)展,我們現(xiàn)在已經(jīng)認識到絕大多數(shù)基因組序列被轉(zhuǎn)錄成lncRNAs。在UUO間質(zhì)纖維化大鼠腎臟中,促間質(zhì)纖維化lncRNA HOTAIR顯著上調(diào),HOTAIR耗竭會上調(diào)miR-124以阻斷Notch1信號通路,從而改善EMT并減少纖維連接蛋白和α-SMA等纖維化蛋白的累積[51]。lncRNAs對腎間質(zhì)纖維化的調(diào)節(jié)作用是一個有前景的抗纖維化治療靶點,然而,關(guān)于它的研究仍不深入。低表達量、種間保守性較低、功能復雜以及難以改變lncRNA在核或細胞質(zhì)區(qū)室中的結(jié)構(gòu)和位置等因素都阻礙了lncRNA治療的發(fā)展。盡管如此,諸如CRISPR/Cas9編輯等新技術(shù)仍可能是未來腎臟疾病中調(diào)控lncRNA表達和功能的新方法[52,53]。

綜上所述,CAD仍然是造成移植腎遠期功能喪失的關(guān)鍵因素。到目前為止,已經(jīng)確定了許多潛在的抗纖維化途徑,但尚未有在移植腎臟中獲批的抗纖維化藥物。因為移植腎間質(zhì)纖維化途徑重疊并相互影響,其復雜性使抗間質(zhì)纖維化藥物研發(fā)較為困難;腎移植后表觀遺傳調(diào)節(jié)機制變化的發(fā)現(xiàn)對移植物結(jié)局的預測有重要意義。我們相信,在臨床、生物標志物和新生物技術(shù)的結(jié)合將提高CAD的診斷精度和治療效果,進而提高移植腎遠期存活率。