陳 靜，張利軍，王 娟，楊麗麗，蘭 坤

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，鄭州 450016）

培養(yǎng)基平板隨機染菌即在工業(yè)生產(chǎn)過程中所用物料、設(shè)備均合格情況下因人員操作、環(huán)境等因素影響有少量的菌落入培養(yǎng)基，導(dǎo)致極少數(shù)平板表面有菌落生長的現(xiàn)象。培養(yǎng)基平板作為鑒定、分離、純化菌種的重要工具，若工業(yè)生產(chǎn)過程受到雜菌污染，必然會造成人力、試劑的浪費，降低生產(chǎn)效率及收益；除此之外，終端使用可能會造成誤判、影響結(jié)果觀察等后果，因此，其生產(chǎn)過程中隨機染菌的控制至關(guān)重要。

1 培養(yǎng)基平板生產(chǎn)工藝簡介

培養(yǎng)基平板的生產(chǎn)工藝流程如圖1 所示，其生產(chǎn)過程除自動化設(shè)備之外仍需手工操作，例如培養(yǎng)皿的拆袋準(zhǔn)備、灌裝后的平板轉(zhuǎn)移等工作內(nèi)容均需要人工去完成，加之培養(yǎng)皿并非密封狀態(tài)，各工序的手工操作均會帶來染菌的風(fēng)險。因此，防止染菌、降低染菌率是發(fā)酵生產(chǎn)中一項長期、重要的工作。

圖1 培養(yǎng)基平板生產(chǎn)工藝簡圖

2 隨機染菌原因分析及控制措施

為了有效地控制染菌，就必須查找出造成染菌的真正原因，然后才能對癥下藥，針對性地防止和避免。造成發(fā)酵染菌的因素很多，根據(jù)自己在培養(yǎng)基平板多年的生產(chǎn)實踐與管理經(jīng)驗，認(rèn)為主要是以下4 個方面。

2.1 人員管理

首先，思想上要高度重視，操作上要一絲不茍。由于思想不重視，操作上產(chǎn)生染菌的因素也很多[1]。其次也要關(guān)注人員技能方面，每個人需要具備接受新知識、新事物的能力，并會舉一反三提升自己的無菌意識，只有這樣控制隨機染菌才能事半功倍。

從平板生產(chǎn)工藝流程圖中可以看出，培養(yǎng)基平板生產(chǎn)過程多個工序均需手工直接接觸平板，比如準(zhǔn)備無菌空平皿、轉(zhuǎn)移平板等操作需嚴(yán)格按照作業(yè)指導(dǎo)書執(zhí)行，否則就會增加產(chǎn)品的隨機污染。因此，針對人員控制方面可以參照表1。

表1 人員管理關(guān)鍵要點

平板的生產(chǎn)過程工序多，因此需要多人協(xié)作、共同完成，管理人員除了關(guān)注個人素質(zhì)，還需考慮不同員工的性格、特點、工作習(xí)慣等因素，綜合考慮人員搭配問題。

各崗位、各操作人員都要切實樹立無菌觀念，以一絲不茍的態(tài)度對待并執(zhí)行，方可對減少隨機染菌起到關(guān)鍵作用。

2.2 生產(chǎn)環(huán)境控制

《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診斷試劑現(xiàn)場檢查指導(dǎo)原則》（以下簡稱《檢查指導(dǎo)原則》）中規(guī)定應(yīng)當(dāng)根據(jù)體外診斷試劑的生產(chǎn)過程控制，確定相應(yīng)級別的潔凈室內(nèi)進(jìn)行生產(chǎn)的過程，避免生產(chǎn)中的污染。酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑、免疫熒光試劑、免疫發(fā)光試劑、聚合酶鏈反應(yīng)試劑、金標(biāo)試劑、干化學(xué)法試劑、細(xì)胞培養(yǎng)基、校準(zhǔn)品與質(zhì)控品的配制及分裝等產(chǎn)品的配液、包被、分裝等，生產(chǎn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)不低于100 000 級潔凈度級別。無菌物料等分裝處理操作，操作區(qū)域應(yīng)當(dāng)符合局部100 級潔凈度級別。

工業(yè)生產(chǎn)中培養(yǎng)基平板的生產(chǎn)過程是在10 000級潔凈廠房內(nèi)進(jìn)行的，同時使用超凈工作臺提供局部無塵無菌工作環(huán)境的單向流行空氣凈化設(shè)備，為無菌培養(yǎng)基的分裝過程提供了局部100 級的潔凈級別。這樣的環(huán)境級別為無菌產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)與保障。

盡管如此，人體與外界環(huán)境才是最大的污染源，尤其是在炎熱的夏季，外界環(huán)境的微生物含量更多，更容易隨著人員、物品進(jìn)入車間時被帶入潔凈區(qū)，污染潔凈區(qū)的環(huán)境，影響產(chǎn)品質(zhì)量。

因此，日常的環(huán)境監(jiān)測尤其重要，通過監(jiān)控車間環(huán)境變化，對環(huán)境數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，及時采取相應(yīng)的控制措施。主要監(jiān)控的項目有塵埃粒子數(shù)量、浮游菌、沉降菌和靜壓差等，其中潔凈室空氣潔凈度級別應(yīng)當(dāng)符合相應(yīng)規(guī)定，具體見表2。

結(jié)合潔凈車間內(nèi)日常環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)，并連續(xù)跟蹤3 個月（12 周）的培養(yǎng)基平板每周染菌率（圖2），發(fā)現(xiàn)潔凈車間的環(huán)境較差時培養(yǎng)基平板染菌率會有所升高，結(jié)合培養(yǎng)基平板生產(chǎn)工藝及生產(chǎn)過程的操作進(jìn)行分析，當(dāng)平板生產(chǎn)環(huán)境潔凈度級別較低時，環(huán)境中的微生物容易附著在平板邊緣位置，進(jìn)而進(jìn)入平板內(nèi)部污染培養(yǎng)基，因此控制平板生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度級別對于平板的染菌率來說至關(guān)重要。

圖2 每周環(huán)境指標(biāo)與其染菌率

潔凈車間的空氣是經(jīng)過高效過濾器過濾后進(jìn)入的，并且《檢查指導(dǎo)原則》要求空氣潔凈級別不同的潔凈區(qū)之間的靜壓差應(yīng)當(dāng)大于5 Pa，潔凈區(qū)與室外大氣的靜壓差應(yīng)大于10 Pa，并應(yīng)當(dāng)有指示壓差的裝置。因此可以保證送入潔凈區(qū)的空氣是經(jīng)過過濾的，并因壓差梯度的存在，外界空氣無法自然進(jìn)入潔凈區(qū)，所以潔凈區(qū)的環(huán)境遭受污染必然是通過人員、物流通道將外界空氣、污染物帶入潔凈區(qū)的。

第一，潔凈車間的設(shè)計應(yīng)當(dāng)合理、不會影響潔凈區(qū)內(nèi)的潔凈度，人流通道、物流通道應(yīng)分開，并設(shè)置緩沖間，避免非潔凈區(qū)與潔凈區(qū)之間的交叉污染。

第二，日常微生物檢驗工作的無菌環(huán)境可包括無菌室、超凈工作臺、生物安全柜和火焰周圍。標(biāo)準(zhǔn)的無菌室要求設(shè)有緩沖室、空氣過濾、墻面、墻角、相關(guān)操作設(shè)備和紫外燈等[2]。同樣的，工業(yè)生產(chǎn)過程中物品進(jìn)入潔凈廠房也需要一系列的處理。

第三，對于人員進(jìn)出潔凈車間：首先員工需注意個人儀表、注意清潔個人衛(wèi)生，進(jìn)入車間前先按照標(biāo)準(zhǔn)六步洗手法洗手，隨后遵循遮掩口鼻、完全包裹頭發(fā)、領(lǐng)口袖口扎緊等原則穿戴潔凈服及工作帽，徹底手部消毒后方可進(jìn)入潔凈廠房。

第四，對于物品、物料進(jìn)入潔凈區(qū)，需要保證物品已經(jīng)過輻照或其他消毒方式處理，如有外包/外箱包裹的，在物流入口的緩沖間需去掉外包/外箱，然后轉(zhuǎn)移至物流入口房間內(nèi)，隨后由潔凈區(qū)內(nèi)人員進(jìn)入房間并取走。

工業(yè)生產(chǎn)過程中所需要的物品可以分為兩大類，分別是無菌物品和非無菌物品。①無菌物品，例如塑料培養(yǎng)皿等物料、容器具、清潔毛巾等，均要提前經(jīng)過輻照、高溫高壓蒸汽滅菌處理，然后將滅菌后的物品轉(zhuǎn)移至物品通道，拆除外包裝后將無菌物品轉(zhuǎn)移至緩沖間，才可進(jìn)入潔凈廠房；②非無菌物品，例如紙質(zhì)記錄及文件、因臨時需要傳入車間的工具等，可在潔凈車間外使用移動式臭氧消毒柜先熏蒸30 min 后進(jìn)入物品通道緩沖間，再經(jīng)過風(fēng)淋60 s 后才可進(jìn)入潔凈車間使用。

其中，對于無菌物品需明確規(guī)定其使用有效期，需要在規(guī)定的效期內(nèi)使用，并設(shè)置專一存放無菌物品的區(qū)域，避免其他人員或物品污染。

第五，潔凈廠房日常維護。日常工作過程中需要保持車間整潔，暫存的垃圾需及時清除，避免細(xì)菌滋生；潔凈廠房需定期清潔消毒，可采用空氣消毒和表面消毒相結(jié)合的方式，空氣消毒常用紫外照射法、臭氧熏蒸法、環(huán)氧乙熏蒸等，表面消毒包括桌面、地面、墻面等表面，可使用規(guī)定濃度的84 消毒液、百毒殺消毒液、新潔爾滅消毒液等搭配毛巾進(jìn)行表面擦拭消毒。紫外線與臭氧對環(huán)境消毒效果好，且使用靈活簡便，對人體的傷害較小。夏季、高溫高濕的環(huán)境下污染率較高，要求培養(yǎng)室的相對濕度應(yīng)控制在70%以下[3]。

第六，潔凈車間在正常運行的情況下，潔凈區(qū)內(nèi)環(huán)境變差，肯定是人流、物流2 個通道引入了微生物，因此對于人員、物品進(jìn)出潔凈區(qū)進(jìn)行控制時，除了規(guī)定人員、物品本身的防護、消毒控制措施，還應(yīng)關(guān)注人流通道與物流通道的清潔消毒，因為人員、物品通過對應(yīng)的通道進(jìn)入潔凈區(qū)的過程必定會將外界微生物引入，因此為了避免人員、物品通過對應(yīng)的通道進(jìn)入潔凈區(qū)的時候帶來污染，應(yīng)當(dāng)對人流、物流通道增加清潔消毒，可以實行每天下班前或上班前使用消毒液拖地、表面消毒，這樣就可以保證人流、物流通道的持續(xù)性潔凈。

綜上，想要控制潔凈區(qū)的潔凈環(huán)境，則需要從人員進(jìn)出、物料傳入、日常監(jiān)控與維護3 個方面做一些工作，對潔凈區(qū)的環(huán)境加以防范與預(yù)防。

2.3 生產(chǎn)工藝過程控制

上述生產(chǎn)環(huán)境控制中提到培養(yǎng)基平板的灌裝在局部無塵無菌的環(huán)境下進(jìn)行，但是在實際工業(yè)生產(chǎn)中只有將培養(yǎng)基灌入培養(yǎng)皿內(nèi)的過程是在局部100 級環(huán)境下進(jìn)行的，其他過程，例如培養(yǎng)皿的拆袋準(zhǔn)備、設(shè)備到桌面的轉(zhuǎn)移等工序仍需要人工去完成。因此需要制定較為詳細(xì)、具體的生產(chǎn)工藝要求。生產(chǎn)無菌制品，無菌操作技術(shù)至關(guān)重要。

生產(chǎn)操作過程中，拿取無菌物品，手部必須經(jīng)過消毒。未經(jīng)消毒的手、臂均不可直接接觸無菌物品或者超過無菌區(qū)取物。關(guān)于無菌物品的管理，必須保存在無菌物品區(qū)域，不可交叉。

如圖3 所示，在某一年的8 月曾出現(xiàn)多批次平板隨機染菌，菌落位置多數(shù)在培養(yǎng)基表面邊緣，經(jīng)過排查設(shè)備、生產(chǎn)過程、人員操作，發(fā)現(xiàn)平板的生產(chǎn)過程存在操作不當(dāng)問題，具體表現(xiàn)為操作人員轉(zhuǎn)移平板期間操作不當(dāng)導(dǎo)致培養(yǎng)皿的蓋、底分開，造成培養(yǎng)基邊緣有菌落生長，因此在制定各項操作工藝時需要結(jié)合實際情況，并加大工藝管理、監(jiān)督力度，提前發(fā)現(xiàn)風(fēng)險、識別風(fēng)險并加以改進(jìn)。同時要持續(xù)跟產(chǎn)并考察操作人員。

圖3 月度產(chǎn)品染菌率

2.4 設(shè)備管理

培養(yǎng)基平板工業(yè)生產(chǎn)過程中也需依靠自動化設(shè)備完成，因此設(shè)備的運行狀況是影響培養(yǎng)基平板隨機染菌的主要因素之一。前期對于設(shè)備的選型、設(shè)計都至關(guān)重要，需要避開清潔死角等問題。在工業(yè)生產(chǎn)中，需要識別設(shè)備清潔死角，針對性地制定清潔工藝；培養(yǎng)基平板的灌裝過程會在層流罩中進(jìn)行，也需要檢查軌道的密封性，保證局部100 級的潔凈環(huán)境。

在工藝過程管理中，要制定管理標(biāo)準(zhǔn)，加強對設(shè)備等的定期檢查力度，每月進(jìn)行檢查、維修，發(fā)現(xiàn)問題及時解決；制訂崗位培訓(xùn)計劃，對員工定期進(jìn)行各項規(guī)章制度、崗位操作規(guī)程及相關(guān)文件的培訓(xùn)，并嚴(yán)格遵照執(zhí)行[4]。

除此之外生產(chǎn)設(shè)備的變化需要重點關(guān)注，如圖4所示，在某年4 月份產(chǎn)品月度染菌率異常升高，究其原因發(fā)現(xiàn)因產(chǎn)能擴大，生產(chǎn)部投入一臺新的平板灌裝設(shè)備，新設(shè)備投入使用期間存在磨合期，設(shè)備卡頓、故障頻發(fā)，此時操作人員人為干預(yù)設(shè)備運行，增加了平板隨機污染的風(fēng)險。經(jīng)過磨合及設(shè)備維修人員調(diào)試，新設(shè)備趨于穩(wěn)定，隨即產(chǎn)品的月度染菌率逐步下降。

圖4 產(chǎn)品月度染菌率與設(shè)備故障率

設(shè)備異常期間的處理應(yīng)滿足：①不可裸手接觸潔凈設(shè)備，處理異常前手部需使用75%酒精表面消毒。②人體不可接觸潔凈設(shè)備內(nèi)部。③取出殘次品后需再次使用75%酒精對潔凈設(shè)備的內(nèi)部進(jìn)行表面消毒。④在設(shè)備發(fā)生異常前后產(chǎn)生的產(chǎn)品需單獨放置、加嚴(yán)質(zhì)控，評價其無菌性。

3 結(jié)束語

控制培養(yǎng)基平板生產(chǎn)過程中，首要任務(wù)是人員培訓(xùn)，只有人重視才能保證產(chǎn)品質(zhì)量；其次需要配備相應(yīng)的硬件、軟件設(shè)施，例如所需的無菌物品、運行順暢且易于清潔的消毒設(shè)備、相應(yīng)的操作規(guī)范與指導(dǎo)規(guī)范。要以預(yù)防為主，采取得力措施，發(fā)動全員參與，才能有效控制培養(yǎng)基平板生產(chǎn)過程隨機污染。