郜道玉，崔華威，周源，龔萍，陳潔，萬平民，邵志勇，華娟，李鵬，金爾光*

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢430208；2.長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢430070）

中國是世界上最大的抗生素生產(chǎn)國和消費(fèi)國，每年畜牧業(yè)抗生素使用量占全球用量的一半左右[1]。然而進(jìn)入畜禽體內(nèi)的抗生素僅有少部分被吸收利用，絕大部分以原藥或代謝產(chǎn)物形式隨糞尿排出體外[2-3]?？股氐倪x擇壓力會(huì)誘導(dǎo)腸道微生物和環(huán)境微生物產(chǎn)生抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）和耐藥菌（Antibiotic resistant bacteria，ARB），導(dǎo)致畜禽糞污中殘存大量的ARGs 和ARB。糞污中的ARGs 和ARB 可隨空氣逸散、地表徑流、土壤滲濾及還田利用等進(jìn)入生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而進(jìn)入食物鏈對(duì)人類和動(dòng)物健康構(gòu)成潛在危害。

異位發(fā)酵床是以微生物好氧發(fā)酵為基礎(chǔ)，結(jié)合原位發(fā)酵床和好氧堆肥形成的一種新型糞污處理技術(shù)，其以鋸末、秸稈和礱糠等為墊料，通過接種復(fù)合微生物菌劑以及連續(xù)添加糞污，實(shí)現(xiàn)異地高效同步處理糞污[4-5]。翻堆是異位發(fā)酵床動(dòng)態(tài)堆肥的保障，通過翻堆補(bǔ)充糞污、增加通氣量，為微生物增殖提供養(yǎng)分和氧氣，調(diào)節(jié)溫度的變化及微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)物料的分解，提高ARGs 等污染物的消減效果。研究表明，堆肥過程中產(chǎn)生的高溫可殺滅不耐熱的ARGs 宿主菌、調(diào)整微生物群落結(jié)構(gòu)，顯著降低畜禽糞便中ARGs 和可移動(dòng)遺傳因子（MGEs）的多樣性和豐度[6-7]。錢勛[8]指出，不充分堆肥、普通高溫堆肥、連續(xù)高溫堆肥均可降低奶牛糞便中大部分ARGs 的豐度，其中連續(xù)高溫堆肥效果最佳。由此可見，堆肥是去除糞污中ARGs的有效途徑之一。

近年來，異位發(fā)酵床堆肥技術(shù)的研究主要集中在不同墊料對(duì)微生物菌落多樣性和纖維素降解的影響方面[4，9]，關(guān)于不同翻堆頻次對(duì)異位發(fā)酵床中ARGs 和整合子基因（intI1）的相對(duì)豐度的變化與微生物菌落豐度變化關(guān)系的報(bào)道較少，僅見張錦[10]報(bào)道實(shí)驗(yàn)室堆肥2 d 翻堆1 次可顯著降低豬糞中ermB、ermC、tetQ、tetW、qnrS、qnrD的相對(duì)豐度。本研究以谷殼、鋸末和礱糠等為墊料，輔以接種復(fù)合微生物菌劑，探討翻堆頻次對(duì)異位發(fā)酵床堆肥過程中ARGs、intI1和細(xì)菌群落變化的影響，分析ARGs 相對(duì)豐度變化與微生物菌落和intI1之間的關(guān)系，為闡明糞污異位發(fā)酵床堆肥過程中ARGs變化的主要影響因素提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

堆肥材料包括奶牛糞污（糞便、尿液及生產(chǎn)污水，含水量約90%）和異位發(fā)酵床墊料（谷殼、鋸末、礱糠），其均來自湖北某奶牛場。復(fù)合微生物菌劑（含芽孢桿菌、糞球菌、乳酸菌和酵母菌等，總菌量≥1×1010CFU·g-1）由武漢旭潤環(huán)?？萍加邢薰咎峁?。

土壤基因組DNA 提取試劑盒（Fast DNA Spin kit for soil）購自TIANGEN公司；TaqDNA聚合酶購自大連寶生物公司（TAKARA），Agarose 瓊脂糖（每瓶100 g）購自北京索萊寶科技有限公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix購自上海根生生物科技有限公司；抗生素抗性基因引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)奶牛場異位發(fā)酵床生產(chǎn)方式，于2020年7月29 日至9 月27 日采用無蓋塑料盒在奶牛場雨棚內(nèi)開展試驗(yàn)。塑料盒總?cè)莘e0.7 m3（高765 mm、上外徑1 060 mm、下外徑950 mm），底部留有12 個(gè)直徑1 cm小孔。墊料總體積0.5 m3，谷殼、鋸末、礱糠按體積比2∶1∶1 添加，根據(jù)各自質(zhì)量和含水量計(jì)算出墊料總質(zhì)量為60 kg，含水量12%。然后添加60 kg 糞污、150 g菌劑和1 500 g 尿素，調(diào)整物料C/N 為30∶1，含水率為60%左右，充分混合均勻后裝入塑料盒。試驗(yàn)期間，第1 天添加糞污30 kg，第2～47 天根據(jù)含水量變化調(diào)整糞污添加量（約4～8 kg·d-1）。

按翻堆頻次分為兩組，T1組：1 d翻堆1次；T2組：2 d翻堆1次。

試驗(yàn)期間含水量控制在60%左右。采用微波爐加熱法監(jiān)測含水量，并根據(jù)含水量變化調(diào)整糞污添加量，糞污添加量（kg）=（60%-發(fā)酵床含水量）×60÷90%。

用實(shí)時(shí)數(shù)顯溫度儀垂直插入物料中心20～30 cm處監(jiān)測溫度，每天9：00 記錄實(shí)時(shí)數(shù)顯溫度儀溫度及空氣溫濕度測定器的溫度和濕度。

用四分法取5 g 樣品，加45 mL 無菌水，室溫下振蕩器振蕩30 min，然后靜置30 min，用pH 計(jì)測定上清液pH，每份樣品3個(gè)重復(fù)。

1.3 樣品采集

分別于堆肥第0、5、12、33、47、61天（T1組記為T1-0、T1-5、T1-12、T1-33、T1-47、T1-61，T2組記為T2-0、T2-5、T2-12、T2-33、T2-47、T2-61）收集樣品。采用五點(diǎn)采樣法從每個(gè)處理的上、中、下層（距離表面10、20、30 cm）采樣，樣品充分混合均勻，用四分法收集約500 g，然后分成兩等份，密封于自封袋，其中一份儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中用于理化性質(zhì)分析，另一份冷凍干燥后，研磨成1 mm，儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱，用于后續(xù)生物分析。

1.4 DNA提取

根據(jù)TIANGEN 土壤基因組DNA 提取試劑盒操作手冊(cè)，分別提取上述樣品DNA，使用分光光度計(jì)（NANoDROP ONEC，Thermo Fisher Scientific，美國）檢測DNA 純度和濃度，所有提取的DNA 樣品在測序之前，均密封在-80 ℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 定量PCR檢測

根據(jù)課題組的前期研究，選擇包括四環(huán)素類抗性基因（tetG、tetW）、磺胺類抗性基因（sul1、sul2）、b-內(nèi)酰胺類抗性基因（blaTEM-1）、大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因（ermQ）和整合子基因（intI1）7 種目標(biāo)基因在ABI ViiA 7 Real Time PCR System 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行熒光定量PCR 檢測。目標(biāo)基因的引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[11] ，引物序列、片段大小及退火溫度見表1。反應(yīng)體系為基因組DNA 1 μL，iTaq Universal SYBR Green Supermix（2x）10μL，10μmol·L-1的上下游引物各0.25μL，雙蒸水8.5 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃3 min；95 ℃5 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)；65 ℃延伸5 s。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。運(yùn)行過程中，通過溶解曲線來檢查非特異擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)≥0.99計(jì)算ARGs拷貝數(shù)。

表1 PCR和qPCR引物序列、片段大小及退火溫度Table 1 PCR and qPCR primer sequence，fragment size and annealing temperature

1.6 16S rRNA高通量測序

使用上海派森諾生物科技有限公司Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行16S rRNA 基因測序，確定堆肥樣品中的細(xì)菌群落。使用PCR 通用引物806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）和338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）擴(kuò)增V3～V4 區(qū)域。按照DADA2 方法進(jìn)行去引物、質(zhì)量過濾、拼接和去嵌合體等步驟。使用Vsearch（v2.13.4_linux_x8_64）對(duì)97%相似度水平高質(zhì)量序列進(jìn)行聚類，輸出代表序列和OTU 表。采用RDP分類器對(duì)OTU的代表性序列進(jìn)行分類。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS Statistics（25.0 版）對(duì)各處理樣品之間的顯著差異進(jìn)行相關(guān)分析。使用Graphpadprism 8.0.2 軟件對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行分析和繪圖。使用派森諾基因云中的熱圖，繪制Top35 細(xì)菌群落的熱圖。采用CANOCO（5.1版）進(jìn)行冗余分析，探究影響ARGs豐度變化的主要因素。基于ARGs、MGEs 和細(xì)胞菌屬之間的Pearson 相關(guān)關(guān)系（P＜0.05，R＞0.6），使用Gephi 0.9.2進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 糞污降解過程中溫度和pH的變化

堆肥過程中的溫度影響微生物的活動(dòng)和有機(jī)質(zhì)的降解速率，低分子物質(zhì)（有機(jī)物、蛋白質(zhì)和糖類等）被微生物利用產(chǎn)生大量的熱量，進(jìn)而可升高堆肥的溫度。本研究根據(jù)溫度的變化趨勢將堆肥過程分為4個(gè)階段，即升溫期、高溫期、降溫期及腐熟期，堆肥過程中兩處理組的溫度整體呈先上升后下降的變化趨勢（圖1A）。從圖1A 可看出，T1、T2 組堆肥前期溫度快速上升，分別在第5 天和第12 天達(dá)到最高溫度（59.9 ℃、64.5 ℃），第2 天至第40 天均保持在50 ℃以上，第40 天后逐步降低，堆肥結(jié)束時(shí)接近環(huán)境溫度。《畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范》（GB/T 36195—2018）要求堆肥溫度≥50 ℃的時(shí)間不少于7 d，本研究中50 ℃以上溫度超過7 d，滿足糞污無害化處理要求。Chang 等[12]的研究表明，堆肥過程中添加功能性菌劑、調(diào)理劑、翻堆等有利于增強(qiáng)微生物活性，促進(jìn)微生物繁殖，提高堆肥溫度，延長高溫持續(xù)時(shí)間。本研究T1 和T2 組50 ℃以上溫度維持了39 d，可能與發(fā)酵床墊料、添加復(fù)合微生物菌劑、動(dòng)態(tài)補(bǔ)充糞漿等有利于促進(jìn)微生物活動(dòng)有關(guān)；40 d 后溫度逐步降低，可能與可利用養(yǎng)分減少、微生物活動(dòng)減弱等有關(guān)。高溫期T2 組溫度高于T1 組，可能與2 d 翻堆1 次有利于減少熱量散失等因素有關(guān)?？梢?，2 d 翻堆1 次更有利于提高堆肥溫度和延長高溫期。

圖1 糞污降解過程中溫度和pH的變化Figure 1 Variation of temperature and pH during degradation of manure and sewage

T1、T2 組pH 值變化趨勢見圖1B。從圖1B 可以看出，第0天時(shí)pH值最大（9.16），隨后逐步降低，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)T1、T2 組pH 值分別降至6.69 和6.48。堆肥過程中pH 值的變化對(duì)微生物活動(dòng)有較大的影響，當(dāng)pH值為6.7～9.0 時(shí)，微生物更加活躍，有利于其生長及最大限度地分解堆肥物料[13]。本研究堆肥初始物料pH值為9.16，與上述報(bào)道中pH 值范圍接近，可為微生物的快速增殖和堆肥物料的分解提供良好生境。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)堆肥產(chǎn)物中pH 值較初始物料明顯降低（6.69和6.48），這可能與堆肥過程中的氨揮發(fā)、微生物代謝產(chǎn)生有機(jī)酸及其硝化作用產(chǎn)生無機(jī)酸的積累等有關(guān)[14-15] 。

2.2 糞污降解過程中ARGs和intI1的相對(duì)豐度變化

2.2.1 目標(biāo)基因總相對(duì)豐度變化

采 用qPCR 技 術(shù) 檢 測 了6 種ARGs（sul1、sul2、tetG、tetW、blaTEM-1、ermQ）和intI1的相對(duì)豐度。T1 和T2 組目標(biāo)基因總相對(duì)豐度整體上呈現(xiàn)先降低后升高再降低的變化趨勢（圖2）。從圖2可看出，T1和T2組總相對(duì)豐度在0～33 d逐步降低，33～47 d小幅度增加，47～61 d 逐步降低，其中第33 天較第0 天分別降低了74.05%、78.35%，相對(duì)而言T2 組高溫期的效果較好。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)T1、T2 組目標(biāo)基因總相對(duì)豐度較第0 天分別降低82.33%、80.46%。研究表明，堆肥過程中保持相對(duì)較高的溫度可殺滅/去除ARGs 宿主菌、降解ARGs，從而降低目標(biāo)基因豐度[8]。Wang 等[16]報(bào)道，堆肥高溫期可明顯降低ARGs 的豐度；Lin 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，高溫（50～60 ℃）堆肥可有效降低豬糞中ARGs 的總相對(duì)豐度。本研究高溫階段目標(biāo)基因的豐度變化與上述報(bào)道一致，說明堆肥過程中持續(xù)保持較高溫度可能有利于降低ARGs 的豐度。Qian 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，牛糞好氧堆肥初期到高溫期物料中部分目標(biāo)ARGs豐度逐漸降低，而高溫期到腐熟期升高。本研究第47 天也出現(xiàn)類似情況，這可能與物料逐步腐熟，溫度逐漸下降，高溫環(huán)境下被抑制的微生物恢復(fù)活性及后續(xù)添加糞漿帶入ARGs等有關(guān)[19]。

圖2 糞污降解過程中T1和T2組目標(biāo)基因總相對(duì)豐度變化Figure 2 Changes of the total relative abundance of target genes in group T1 and T2 during degradation of manure and sewage

2.2.2 目標(biāo)基因相對(duì)豐度變化

從圖3 可以看出，T1 和T2 組tetG、tetW、sul1、blaTEM-1、ermQ的豐度整體上逐步降低，堆肥結(jié)束時(shí)較第0 天 分 別 降 低 了16.70%（P＞0.05）、87.88%（P＜0.01）、54.60%（P＜0.05）、＞99.99%（P＜0.01）、97.80%（P＜0.01）和61.33%（P＜0.01）、99.46%（P＜0.01）、50.91%（P＞0.05）、99.29%（P＜0.01）、82.23%（P＜0.01）；而T1組sul2豐度先降低后逐步升高，T2 組呈降低-升高-降低的波動(dòng)性變化，堆肥結(jié)束時(shí)T1 組增加了32.62%（P＞0.05）、T2 組降低了30.90%（P＞0.05）。相對(duì)而言，T2 組對(duì)6 種目標(biāo)基因有較好的消除效果。堆肥后兩處理組tetW、blaTEM-1和ermQ的相對(duì)豐度顯著降低，與Li 等[11]報(bào)道的豬糞鋸末共堆肥可降低tetW、blaTEM、ermQ的相對(duì)豐度的結(jié)果一致，說明異位發(fā)酵床堆肥可有效去除tetW、blaTEM、ermQ。本研究中，T1 組tetG、sul1和T2 組tetG、sul1、sul2的相對(duì)豐度較第0 天有不同程度降低，與武晉萍等[20]和Selvam 等[21]的報(bào)道類似，T1 組sul2富集與Chang 等[12]的結(jié)果一致。Chen等[22]報(bào)道豬糞鋸末共堆肥產(chǎn)物中殘留的主要是tetG、sul1、sul2，本研究結(jié)果與其一致，可能與這些抗性基因?qū)Ω邷赜休^強(qiáng)耐受性，或攜帶這些基因的宿主菌耐高溫難以被除去[23]，不同條件下相同抗性基因的變化也不一樣[24]等有關(guān)。盡管兩處理均可較好地降低tetG、tetW、sul1、sul2、blaTEM-1、ermQ的相對(duì)豐度，但并不能有效去除tetG、sul1、sul2，這些ARGs 仍然可能有擴(kuò)散傳播的風(fēng)險(xiǎn)，因此堆肥過程中高效去除tetG、sul1、sul2的技術(shù)還有待于進(jìn)一步研究。

圖3 糞污降解過程中T1和T2組ARGs相對(duì)豐度的變化Figure 3 Changes of the relative abundance of ARGs in group T1 and T2 during degradation of manure and sewage

2.2.3intI1相對(duì)豐度變化

堆肥過程中intI1的相對(duì)豐度整體上呈下降趨勢（圖4）。從圖4 可知，堆肥結(jié)束時(shí)T1、T2 組intI1相對(duì)豐度較第0 天分別降低了59.33%（P＜0.05）、99.91%（P＜0.01）。intI1是ARGs 水平轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要MGEs，ARGs 可通過MGEs 在不同的微生物之間傳播，降低intI1的豐度可抑制ARGs 的擴(kuò)散和傳播[25]。Duan等[26]報(bào)道指出，添加復(fù)合微生物菌劑可降低牛糞堆肥產(chǎn)物中intI1的相對(duì)豐度，抑制ARGs 的傳播。Fan等[27]發(fā)現(xiàn)堆肥可有效降低奶牛糞便中intI1的豐度。本研究結(jié)果與上述報(bào)道類似，說明兩處理均可較好去除intI1，其中T2 組的效果優(yōu)于T1 組。堆肥后intI1相對(duì)豐度降低可能是由于intI1不耐高溫、或高溫條件下某些不耐熱宿主菌被去除[28]，T1 和T2 組間的差別可能與連續(xù)添加糞污中的intI1含量、翻堆次數(shù)、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)等有關(guān)。

圖4 糞污降解過程中T1和T2組intI1相對(duì)豐度的變化Figure 4 Changes of the relative abundance of intI1 in group T1 and T2 during degradation of manure and sewage

2.3 糞污降解過程中細(xì)菌群落的變化

取第0、5、12、33、47、61 天樣品，每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)，計(jì)36 個(gè)樣品，經(jīng)組裝、質(zhì)量控制和過濾后，共獲得2 247 318 條序列，鑒定出3 441 個(gè)相似度≥97%的OTUs?；诩訖?quán)Weight-UniFace 距離的主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示，PCoA1 和PCoA2 解釋了細(xì)菌群落變化的57.5%（圖5）。同一時(shí)間點(diǎn)3 份重復(fù)樣品聚集在一起，說明各重復(fù)樣品間差異較小，實(shí)驗(yàn)精確度高，取樣方法合理。第0 天樣品與堆肥其他時(shí)期樣品明顯分開，按照堆肥不同時(shí)期聚集在一起，表明堆肥過程對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化有重要影響。

圖5 基于發(fā)酵床堆肥過程中的加權(quán)快速UniFrace的主坐標(biāo)分析（PCoA）Figure 5 Principal coordinate analysis（PCoA）based on weighted fast UniFrace during composting in a fermented bed

選取相對(duì)豐度Top10 的物種構(gòu)建柱狀堆疊圖（圖6A）。本研究第0天的樣品中門水平的優(yōu)勢菌群依次是厚壁菌門（Firmicutes，79.57%～84.36%）、變形菌門（Proteobacteria，5.66%～7.94%）、放線菌門（Actinobacteria，5.84%～6.98%）和 擬 桿 菌 門（Bacteroidetes，0.94%～1.21%），這與Zhang 等[29]報(bào)道的奶牛糞便中微生物群落優(yōu)勢菌門的結(jié)果基本一致。堆肥不同時(shí)期，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，F(xiàn)irmicutes 在0～12 d是最主要優(yōu)勢菌門，相對(duì)豐度占比為79.58%～87.57%，主要是由于屬于Firmicutes 的大部分菌屬耐高溫[30]。第33 天和第47 天，F(xiàn)irmicutes 的豐度占比下降 到 5.58%～15.16%，而 Bacteroidetes（13.09%～26.18%）、Proteobacteria（23.93%～30.81%）、綠灣菌門（Chloroflexi， 8.70%～21.20%） 和 Actinobacteria（14.25%～20.00%）的豐度逐漸增加，取代Firmicutes成為優(yōu)勢菌門。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與第0 天相比，F(xiàn)irmicutes 和Actinobacteria 的豐度T1 組分別降低了40.13%和2.68%，T2 組分別降低了43.71%和3.02%，Bacteroidetes 和Chloroflexi 的豐度T1 組分別增加了40.15%和1.94%，T2 組分別增加了41.69%和3.05%。Li 等[11]報(bào)道指出，豬糞鋸末共堆肥腐熟期Firmicutes的相對(duì)豐度降低，而Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria 相對(duì)豐度增加，本研究堆肥后Firmicutes相對(duì)豐度降低，Bacteroidetes 相對(duì)豐度增加與上述報(bào)道一致，Actinobacteria 相對(duì)豐度降低及Chloroflexi 相對(duì)豐度增加與上述報(bào)道不一致，這可能與堆肥物料和工藝、添加微生物菌劑、連續(xù)添加糞污、降溫腐熟期某些細(xì)菌增殖等有關(guān)[12，31]。

圖6 糞污降解過程中細(xì)菌群落Top10門和Top35屬水平相對(duì)豐度Figure 6 Relative abundance of bacterial community top10 phylum and top35 genus levels during manure degradation

本研究選取相對(duì)豐度Top35 的菌屬為細(xì)菌群落的代表作熱圖，進(jìn)行進(jìn)一步分析。根據(jù)堆肥過程中菌屬水平豐度變化，將其分為兩大類（H、G）。如圖6B所示，Top35 菌屬主要分布在Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria 和Bacteroidetes 門中。G 類除Aquabacterium和Shigella外，其余菌屬均屬于Firmicutes，這些菌屬在堆肥初期和高溫期豐度最大，第12 天后逐漸降低。Clostridium、Mogibacterium、Turicibacter和Bacillaceae_Bacillus等菌屬屬于Firmicutes，堆肥初期和高溫階段豐度較高主要是由于這些菌屬耐高溫，這與Chang 等[12]的研究結(jié)果一致。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)除Succiniclasticum的豐度明顯增加外，Ruminococcus、Coprococcus、Butyrivibrio的豐度變化不明顯，其他菌屬豐度均下降至最低。Shigella和Turicibacter為人類致病菌[32]，堆肥結(jié)束時(shí)Shigella豐度由0.65%～1.05%下降到0.15%～0.16%，Turicibacter豐度由4.70%～4.90%下降為0.11%～0.17%，可見兩處理均能有效降低其豐度。H 類 分 別 屬 于Proteobacteria、Actinobacteria 和Bacteroidetes，這類菌屬相對(duì)豐度隨著堆肥進(jìn)行逐漸升高，高溫期相對(duì)豐度最高，然后逐漸降低，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)除屬于Proteobacteria 的Steroidobacter和Dyella、Actinobacteria 的Demequina和Acinetobacter、Bacteroidetes 的Ruminofilibacter和Prevotella菌屬相對(duì)豐度較第0 天有不同程度增加外，其他菌屬豐度均不同程度降低。Zhou 等[33]指出Corynebacterium是人類致病菌，初始物料中的豐度占比為1.04%～1.39%，堆肥結(jié)束時(shí)被完全去除?？梢?，堆肥過程可明顯影響細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)，尤其是對(duì)人類致病菌具有較好的抑制作用。

2.4 ARGs變化的影響因素分析

冗余分析（RDA）用于研究細(xì)菌群落、環(huán)境因子和MGEs 與ARGs 之間的關(guān)系，本研究對(duì)堆肥溫度、pH、細(xì)菌群落（基于門的分類）及intI1進(jìn)行冗余分析。由圖7 可知，RDA 解釋了ARGs 豐度變化的99.27%，其中RDA1 解釋了69.38%、RDA2 解釋了29.89%。選擇變量中，細(xì)菌群落可解釋ARGs 變化的70.07%、intI1解釋25.10%、溫度和pH 解釋4.10%，表明堆肥過程中細(xì)菌群落、intI1的豐度、溫度及pH 均可影響ARGs 的豐度變化。Wang 等[34]和胡婷[35]研究發(fā)現(xiàn)ARGs 與細(xì)菌群落之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性。如表2 所示，本研究中Firmicutes 與intI1（P＜0.01）、tetW（P＜0.01）、tetG、blaTEM-1、ermQ呈正相關(guān)，堆肥后Firmicutes相對(duì)豐度降低可解釋intI1、tetW、tetG、blaTEM-1、ermQ豐度的減少。Bacteroidetes、Chloroflexi 與sul1、sul2呈正相關(guān)，堆肥結(jié)束時(shí)Bacteroidetes、Chloroflexi 的豐度較第0 天顯著增加，可解釋sul1、sul2削減效果較差?？梢?，細(xì)菌群落是影響堆肥過程中ARGs 豐度變化的主要因素[36]。Zhang 等[37]的研究表明，堆肥過程中可通過降低intI1的豐度抑制其介導(dǎo)的水平基因轉(zhuǎn)移，從而影響堆肥中ARGs 豐度的變化。本研究中，intI1與tetW（P＜0.01）、blaTEM-1（P＜0.05）、ermQ（P＜0.05）呈顯著正相關(guān)，堆肥后T1 和T2 組intI1相對(duì)豐度分別降低59.33% 和99.91%，說明異位發(fā)酵床堆肥可能是通過降低intI1的豐度抑制水平基因轉(zhuǎn)移進(jìn)而降低ARGs的豐度。

圖7 ARGs、細(xì)菌群落、intI1、溫度和pH的冗余分析Figure 7 Redundancy analysis ARGs，bacterial communities，intI1，temperature and pH

表2 基于相對(duì)豐度的ARGs、MGEs和細(xì)菌菌門之間的Pearson′s相關(guān)系數(shù)Table 2 Pearson′s correlation coefficients between ARGs，MGEs and bacteriophages based on their relative abundance

2.5 異位發(fā)酵床降解過程中ARGs和intI1的潛在宿主菌分析

為進(jìn)一步探討ARGs變化的影響因素，基于Pearson相關(guān)系數(shù)，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。從圖8 可以看出，網(wǎng)絡(luò)中42 個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括6 種ARG、intI1和35 個(gè)細(xì)菌屬）間存在顯著相關(guān)性（P＜0.05）。Facklamia、Clostridiaceae_Clostridium和Turicibacter是tetW、ermQ、blaTEM-1的共同潛在宿主菌，Li 等[38]和Zhou 等[33]研究發(fā)現(xiàn)Facklamia、Clostridiaceae_Clostridium和Turicibacter是tetW、ermQ、blaTEM-1的潛在宿主菌，與本研究結(jié)果一致，堆肥后這些菌屬相對(duì)豐度顯著降低可解釋tetW、ermQ和blaTEM-1相對(duì)豐度降低。Epulopiscium、Aquabacterium和Clostridum等菌屬分別為intI1和sul1、tetG、tetW、blaTEM-1、ermQ共同潛在宿主菌，這與Wang 等[39]報(bào)道的ARG 和intI1可同時(shí)共存在同一細(xì)菌中的結(jié)果一致，說明intI1和ARGs 可能同時(shí)存在于同一細(xì)菌中，并可通過同一個(gè)細(xì)菌傳播。Prevotella是tetG和sul2的潛在宿主菌，Dyella是tetG、sul1、sul2的潛在宿主菌，Hyphomicrobium、Ruminofilibacter和Steroidobacter是sul1和sul2獨(dú)有的潛在宿主菌，這與張鑫[40]報(bào)道的Ruminofilibacter是sul1和sul2獨(dú)有的潛在宿主菌的結(jié)果一致，堆肥后這些菌屬的豐度增加，可解釋tetG、sul1和sul2消除效果不理想。Clostridium、Clostridiaceae_Clostridium、Shigella是tetG、tetW和intI1的潛在宿主菌，堆肥結(jié)束時(shí)T1 和T2 組中這3 種菌屬相對(duì)豐度較第0 天分別降低了11.05%、3.00%、0.64%和11.35%、3.23%、1.03%，可解釋T2組tetG、tetW和intI1相對(duì)豐度降幅更大。本研究中intI1的潛在宿主菌達(dá)22 個(gè)，且與多個(gè)目標(biāo)基因有共同潛在宿主菌，如Aquabaterium是sul1、tetG、tetW、blaTEM-1、ermQ和intI1的共同潛在宿主菌，Butyrivbrio是sul2、tetG、tetW、ermQ和intI1的共同潛在宿主菌，說明ARGs 可能通過intI1介導(dǎo)的水平基因轉(zhuǎn)移在不同宿主菌間轉(zhuǎn)移和傳播[41]。綜上，糞污異位發(fā)酵床降解過程中可能主要是通過降低ARGs 潛在宿主菌豐度及抑制intI1介導(dǎo)的ARGs 水平基因轉(zhuǎn)移，從而降低多數(shù)ARGs的豐度。

3 結(jié)論

（1）異位發(fā)酵床堆肥過程中翻堆有利于提高堆肥的溫度，延長其高溫期，改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，顯著降低intI1和ARGs的相對(duì)豐度。

（2）細(xì)菌群落和intI1的變化是影響ARGs 豐度變化的主要因素。此外，堆肥還能徹底清除或顯著降低人類致病菌的豐度。

（3）奶牛糞污異位發(fā)酵床降解過程中2 d 翻堆1次可有效去除大部分ARGs，降低環(huán)境中ARGs 的傳播風(fēng)險(xiǎn)。