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      瀕危植物粗莖紫金牛莖段愈傷組織再生體系的建立

      2023-09-20 11:23:02周艷李冬梅吳坤林寧祖林
      熱帶作物學(xué)報(bào) 2023年8期
      關(guān)鍵詞:愈傷組織

      周艷 李冬梅 吳坤林 寧祖林

      關(guān)鍵詞:瀕危植物;粗莖紫金牛;愈傷組織;再生體系

      粗莖紫金牛(ArdisiagigantifoliaStapf)為報(bào)春花科(Primulaceae)紫金牛屬常綠灌木,高50~70cm,株型緊湊優(yōu)美,莖粗壯不分枝,葉通常聚生于莖頂端,葉片肥大似扇子,上面深綠色,背面紫紅色,花紫紅色或淡粉色,花量大而密集,花期長(zhǎng),果熟時(shí)鮮紅或紫粉色,耐蔭性強(qiáng),觀賞價(jià)值高,可作為室內(nèi)盆花或園林花境素材,極具市場(chǎng)開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[1]。粗莖紫金牛自然分布范圍狹窄,僅分布于我國(guó)云南河口,生于海拔100~400m的溝谷常綠闊葉林下[2],筆者在野外調(diào)查過(guò)程中僅在河口南溪鎮(zhèn)和古林箐鎮(zhèn)兩地溝谷林下發(fā)現(xiàn)個(gè)體數(shù)量極少的野生居群。因粗莖紫金牛野生資源稀少,被列為《中國(guó)生物多樣性紅色名錄-高等植物卷》極危(CR)物種[3],具有重要的保護(hù)價(jià)值和研究意義。

      遷地保護(hù)于華南植物園的粗莖紫金牛生長(zhǎng)良好,每年開(kāi)花,但難以結(jié)實(shí),存在繁殖障礙問(wèn)題。劉華等[4]已申報(bào)了粗莖紫金牛扦插、壓條繁殖專(zhuān)利技術(shù),但受季節(jié)和繁殖材料的限制,繁殖效率不高。李冬梅等[5]申報(bào)了利用粗莖紫金牛嫩葉為外植體的組織培養(yǎng)專(zhuān)利技術(shù),公開(kāi)了其繼代增殖系數(shù)最高為4.0。孫英坤等[6]研究認(rèn)為T(mén)DZ能有效促進(jìn)堇葉紫金牛(A.violacea)不定芽分化。符運(yùn)柳等[7]對(duì)走馬胎(A.kteniophylla)離體培養(yǎng)及植株再生生根壯苗階段添加了10%的CW,但未起到壯苗增高效果。迄今為止,紫金牛屬植物組培快繁技術(shù)研究主要以莖段和嫩葉為外植體,研究集中在外植體的消毒方式、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)腋芽誘導(dǎo)、增殖與生根的影響、不同基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響[8-10]等方面。目前尚無(wú)粗莖紫金牛愈傷組織再生體系建立方面的研究。鑒于此,本研究利用粗莖紫金牛莖段為外植體進(jìn)行愈傷組織再生體系的建立,探究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和有機(jī)物對(duì)其組織培養(yǎng)的影響,以期建立高效的粗莖紫金牛離體再生體系,為該物種的保育和種苗的規(guī)?;a(chǎn)提供技術(shù)支撐。

      1材料與方法

      1.1材料

      供試材料為粗莖紫金牛(A.gigantifoliaStapf)無(wú)菌苗,保存于華南植物園瀕危植物繁育中心。

      1.2方法

      1.2.1TDZ和NAA對(duì)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響將粗莖紫金牛無(wú)菌苗切成長(zhǎng)約2.0cm帶1個(gè)莖節(jié)的切段,接種到培養(yǎng)基WPM+NAA0.10mg/L+TDZ(0.10、0.25、0.50、0.80、1.00、1.50mg/L)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為對(duì)照,每個(gè)濃度梯度處理10瓶,每瓶接種2個(gè)外植體,重復(fù)3次。培養(yǎng)45d后觀察記錄各處理培養(yǎng)結(jié)果,并統(tǒng)計(jì)其愈傷組織誘導(dǎo)率、不定芽誘導(dǎo)率和莖段存活率。

      愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

      不定芽誘導(dǎo)率=產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

      莖段存活率=外植體成活數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

      1.2.2TDZ對(duì)愈傷組織增殖的影響將誘導(dǎo)獲得的愈傷組織分切成重約0.10g的團(tuán)粒,接種到培養(yǎng)基WPM+TDZ(0.30、0.50、0.80、1.00mg/L)進(jìn)行愈傷組織的增殖培養(yǎng),以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為對(duì)照,每個(gè)濃度梯度處理10瓶,每瓶接種2團(tuán),重復(fù)3次。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織存活率和愈傷組織增殖系數(shù)。

      愈傷組織存活率=成活的愈傷組織團(tuán)粒數(shù)/接種愈傷組織粒總數(shù)×100%

      愈傷組織增殖系數(shù)=增殖培養(yǎng)后愈傷組織鮮重/接種愈傷組織鮮重

      1.2.36-BA和NAA對(duì)愈傷組織不定芽誘導(dǎo)的影響將增殖培養(yǎng)的愈傷組織分切成重約0.10g的團(tuán)粒,接種到培養(yǎng)基WPM+0.20mg/LNAA+6-BA(1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mg/L)進(jìn)行不定芽誘導(dǎo),以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為對(duì)照,每個(gè)濃度梯度處理10瓶,每瓶接種2團(tuán),重復(fù)3次。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率。

      不定芽誘導(dǎo)率=產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

      1.2.46-BA對(duì)不定芽增殖的影響將誘導(dǎo)出的叢生芽分切,以雙芽為單位接種到培養(yǎng)基WPM+6-BA(2.00、4.00、6.00、8.00mg/L)上進(jìn)行不定芽的增殖培養(yǎng),以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為對(duì)照,每個(gè)處理10瓶,每瓶接種2個(gè)單位,重復(fù)3次。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)不定芽增殖系數(shù)。

      不定芽增殖系數(shù)=新增不定芽數(shù)/接種不定芽數(shù)

      1.2.5NAA和CW對(duì)生根壯苗的影響將生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的高2~3cm不定芽接種至WPM+NAA0.20mg/L+CW(5%、10%、15%、20%、25%體積分?jǐn)?shù))的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根壯苗實(shí)驗(yàn),以不添加CW為對(duì)照,每個(gè)濃度梯度處理10瓶,每瓶接種2個(gè)不定芽,重復(fù)3次。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)生根率、株高、根數(shù)、根長(zhǎng)、鮮重增量。

      生根率=生根不定芽數(shù)/接種的不定芽總數(shù)×100%

      鮮重增量(g)=培養(yǎng)后組培苗的鮮重-初始不定芽的鮮重

      1.2.6移栽基質(zhì)對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響當(dāng)粗莖紫金牛生根瓶苗高度達(dá)4~5cm、葉片數(shù)達(dá)4片時(shí),于遮光率為60%的溫室中煉苗2~3d,接著開(kāi)蓋煉苗2~3d,將煉苗后的瓶苗取出,小心洗去附著于根部的瓊脂,移栽到準(zhǔn)備好的基質(zhì)穴盤(pán)中,每個(gè)穴孔種植1株。以珍珠巖∶泥炭土按體積比為0∶1、1∶3、1∶6、1∶8和1∶10等5種比例混合基質(zhì)作為移栽基質(zhì),采用54cm×28cm的32孔育苗篩,用稀釋1000倍的多菌靈溶液浸泡2h后,濾干備用。每種比例混合基質(zhì)處理20株,重復(fù)3次,期間保持濕度90%以上,遮陰度60%左右。60d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

      移栽成活率=成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)×100%

      1.3數(shù)據(jù)處理

      所有數(shù)據(jù)均采用Excel2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析和Duncans多重比較。

      2結(jié)果與分析

      2.1TDZ和NAA對(duì)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

      從圖1可看出,莖段外植體在培養(yǎng)基WPM中添加0.10mg/LNAA和不同濃度的TDZ可成功誘導(dǎo)出愈傷組織和不定芽。TDZ與0.10mg/LNAA結(jié)合使用時(shí),不同濃度的TDZ對(duì)莖段存活、愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用。由表1可知,在不添加任何TDZ和NAA的培養(yǎng)基上,莖段存活率為100.00%,但均無(wú)愈傷組織和不定芽形成。當(dāng)TDZ濃度為0.10~0.50mg/L時(shí),TDZ對(duì)莖段存活率和愈傷組織誘導(dǎo)的影響差異不顯著,愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)率隨TDZ增加而逐漸遞增;TDZ在0.5mg/L時(shí),愈傷組織誘導(dǎo)率最高達(dá)96.67%,且愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)良好,呈黃綠色或淺綠色(圖1C)。TDZ濃度為0.50~1.50mg/L時(shí),莖短成活率、愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)率隨TDZ濃度增加而逐漸降低,但TDZ濃度在0.50~0.80mg/L范圍內(nèi),TDZ對(duì)愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)率差異不顯著。當(dāng)TDZ濃度為1.50mg/L時(shí),成活率降至80.00%,愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)最低值54.17%,不定芽誘導(dǎo)率低至23.33%,此時(shí)愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)差,且呈黃綠色(圖1D)。

      2.2TDZ對(duì)愈傷組織增殖的影響

      由表2可知,以WPM培養(yǎng)基添加不同濃度TDZ對(duì)愈傷組織增殖具有顯著影響。隨著TDZ濃度增高,愈傷組織存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),TDZ濃度為0.50mg/L時(shí),存活率達(dá)到最高93.33%。在不添加TDZ的培養(yǎng)基上,愈傷組織鮮重增殖系數(shù)為1.62,愈傷組織呈淺綠色,僅有少數(shù)芽點(diǎn)。當(dāng)添加TDZ濃度為0.30mg/L時(shí),其增殖系數(shù)下降為0.26,愈傷組織呈淺黃綠色顆粒狀,結(jié)果表現(xiàn)為低濃度TDZ對(duì)愈傷組織鮮重增殖有明顯的抑制作用。當(dāng)TDZ濃度為0.50mg/L,增殖系數(shù)為4.42,達(dá)到最大值,愈傷組織呈淺綠或黃綠色;而TDZ濃度在0.80~1.00mg/L時(shí)增殖系數(shù)從1.26下降至0.31,愈傷組織由黃綠色、顆粒狀逐漸呈現(xiàn)褐黃色,且多數(shù)死亡。綜合分析,WPM+0.50mg/LTDZ為愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基。

      2.36-BA和NAA對(duì)愈傷組織不定芽誘導(dǎo)的影響

      由表3可知,當(dāng)NAA濃度保持在0.20mg/L時(shí),隨著6-BA濃度的增加,不定芽的誘導(dǎo)率呈先增加后減少的趨勢(shì);當(dāng)6-BA濃度低于2.00mg/L時(shí),每團(tuán)愈傷誘導(dǎo)出的不定芽較少,呈黃綠色或綠色(圖2C);當(dāng)6-BA濃度為2.00mg/L時(shí),不定芽的誘導(dǎo)率達(dá)到最高,為100.00%,每團(tuán)愈傷誘導(dǎo)出大量不定芽,芽體為綠色,生長(zhǎng)狀況較好(圖2A,圖2B);當(dāng)6-BA濃度高于2.00mg/L時(shí),不定芽誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度的增加而下降;當(dāng)6-BA濃度為3.00mg/L時(shí),不定芽誘導(dǎo)率最低為56.67%,芽體為黃綠色至黃色(圖2C)。綜合考慮,WPM+2.00mg/L6-BA+0.20mg/LNAA為粗莖紫金牛愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基。

      2.46-BA對(duì)不定芽增殖的影響

      由表4可知,在WPM培養(yǎng)基上添加不同濃度的6-BA對(duì)不定芽的增殖具有顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn),單獨(dú)使用6-BA對(duì)粗莖紫金牛不定芽的增殖有顯著影響,隨著6-BA濃度的增加,不定芽的增殖系數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),當(dāng)6-BA濃度為4.00mg/L時(shí),誘導(dǎo)出的不定芽生長(zhǎng)正常,芽體為淺綠色或綠色,小葉狹窄且未展開(kāi)(圖2D),增值系數(shù)達(dá)到最大值為3.90;當(dāng)6-BA濃度高于6.00mg/L時(shí),增殖系數(shù)顯著下降;當(dāng)6-BA濃度為8.00mg/L時(shí),增殖系數(shù)降至最低0.97??梢?jiàn),WPM+4.00mg/L6-BA為對(duì)不定芽的增殖有較好的促進(jìn)作用,最適濃度因植物種類(lèi)不同有所差異。

      2.5NAA和CW對(duì)生根壯苗的影響

      將無(wú)根苗轉(zhuǎn)接到WPM+0.20mg/LNAA+CW上進(jìn)行生根壯苗,15d左右開(kāi)始生根,生根率達(dá)100%,CW能誘導(dǎo)根系生長(zhǎng),但對(duì)株高生長(zhǎng)有抑制作用。由表5可知,NAA濃度固定為0.20mg/L時(shí),在不添加CW的培養(yǎng)基中,植株平均高度為4.25cm,在培養(yǎng)基中添加不同濃度CW,其平均株高均低于不添加CW的處理,當(dāng)CW濃度在0~10%范圍時(shí),對(duì)株高的影響差異不顯著,而當(dāng)CW濃度高于10%時(shí),隨著CW濃度增加,植株平均高度降低,且達(dá)到顯著性差異。

      CW濃度在0~10%范圍時(shí),CW濃度對(duì)植株的根條數(shù)、根長(zhǎng)和鮮重增量的影響均無(wú)顯著差異。當(dāng)CW濃度為10%時(shí),根長(zhǎng)和鮮重增量達(dá)到最大值,分別為4.36cm和1.48g,生長(zhǎng)狀態(tài)最佳(圖3)。當(dāng)CW濃度高于10%時(shí),隨著CW濃度的增加,根條數(shù)、根長(zhǎng)和鮮重均逐漸減少,且達(dá)到顯著差異。當(dāng)CW濃度達(dá)到20%以上時(shí),根部出現(xiàn)褐化現(xiàn)象(圖3白色箭頭所示)。

      2.6移栽基質(zhì)對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

      由表6可知,移栽基質(zhì)對(duì)粗莖紫金牛組培苗移栽成活率有明顯差異。在泥炭土基質(zhì)中,培養(yǎng)60d,成活率為82.78%,生長(zhǎng)狀態(tài)較差,植株弱小,葉片質(zhì)地較薄且?。徽渲閹r∶泥炭土以體積比1∶3~1∶10混合范圍時(shí),培養(yǎng)60d,成活率無(wú)顯著差異,其中珍珠巖∶泥炭土以體積比1∶3混合時(shí),成活率最高達(dá)96.67%,此時(shí)植株生長(zhǎng)健壯,葉片質(zhì)地較厚,有光澤且葉片較大(圖4)。

      3討論

      植物組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)是植物資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用的一種有效手段,可在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗[11]。彭光天[12]對(duì)9種紫金牛屬(Ardisia)植物進(jìn)行組織培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同外植體誘導(dǎo)愈傷的能力存在差異,在MS+1.0mg/LNAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)5種紫金牛幼苗生根的效果不太理想,其中百兩金(A.crispa)、虎舌紅(A.mamillata)、紫金牛(A.japonica)的莖段愈傷組織分化僅形成一些不定根,血黨(A.punctata)和蓮座紫金牛(A.primulifolia)未能形成根。符運(yùn)柳等[7]對(duì)走馬胎(A.kteniophylla)進(jìn)行離體培養(yǎng)及植株再生,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MS(改良)+0.50mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+10%CW壯苗培養(yǎng)時(shí),能夠誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng),但不能高頻誘導(dǎo)不定芽增高。在本研究中,通過(guò)在WPM培養(yǎng)基上添加0.20mg/LNAA和CW對(duì)粗莖紫金牛幼苗生根誘導(dǎo)效果良好,生根率達(dá)100%,當(dāng)添加10%CW時(shí),不定根發(fā)達(dá),植株生長(zhǎng)健壯。推測(cè)低濃度的NAA可促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)生根,同時(shí)椰汁也促進(jìn)了愈傷組織誘導(dǎo)生根和根長(zhǎng)生長(zhǎng),使鮮重增加,植株生長(zhǎng)健壯。

      TDZ作為一種新型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,已有文獻(xiàn)報(bào)道其不但具有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性,能誘導(dǎo)愈傷組織形成不定芽[13-14],而且具有生長(zhǎng)素的脫分化作用,能有效誘導(dǎo)愈傷組織形成[15]。本研究通過(guò)TDZ和NAA的組合不僅能使粗莖紫金牛莖段誘導(dǎo)出愈傷組織和增殖,同時(shí)產(chǎn)生不定芽,與前人的研究結(jié)果一致[16-17]。TDZ促進(jìn)愈傷組織形成,也促進(jìn)不定芽形成,這可能與TDZ能有效促進(jìn)外植體直接誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生有關(guān)[18-19]。此外,本研究利用TDZ具有細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的雙重作用,對(duì)粗莖紫金牛愈傷組織進(jìn)行增殖且效果良好,這與劉守贊等[10]研究發(fā)現(xiàn)TDZ對(duì)堇葉紫金牛莖段增殖作用效果顯著優(yōu)于6-BA和KT,且當(dāng)TDZ濃度為0.50mg/L時(shí),增殖倍率最高達(dá)3.14的研究結(jié)果類(lèi)似。

      6-BA是常用的細(xì)胞分裂素,促進(jìn)植物細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)和分化。本研究使用6-BA搭配N(xiāo)AA誘導(dǎo)愈傷組織分化不定芽,結(jié)果表明細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值對(duì)粗莖紫金牛愈傷組織不定芽分化具有顯著影響,當(dāng)6-BA/NAA=10時(shí),不定芽分化率高達(dá)100%;比例大于10時(shí)不定芽分化率卻呈下降趨勢(shì)。符運(yùn)柳等[7]對(duì)紫金牛屬走馬胎進(jìn)行離體培養(yǎng)研究,結(jié)果也發(fā)現(xiàn),2.00mg/L6-BA+0.10mg/LNAA的組合最利于愈傷組織分化不定芽,分化率為88.9%,而當(dāng)6-BA濃度為3.0mg/L時(shí),不定芽分化率明顯下降,因此合適的細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值對(duì)于紫金牛愈傷組織分化不定芽最重要。

      有機(jī)物的添加有利于蘭科植物組培生根壯苗培養(yǎng)[20-21],但在紫金牛的組織培養(yǎng)中還未見(jiàn)CW對(duì)其生根壯苗培養(yǎng)影響的報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),將2~3cm高的粗莖紫金牛無(wú)根苗接種在不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中也能生根,但根量少且纖細(xì);使用0.20mg/L濃度的NAA能有效促進(jìn)粗莖紫金牛無(wú)根苗生根,平均根條數(shù)為3.37,根長(zhǎng)為3.91cm,單株鮮重為1.41g;將NAA濃度固定為0.20mg/L,當(dāng)添加濃度10%的CW時(shí),會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)無(wú)根苗的生長(zhǎng),平均根條數(shù)達(dá)3.80,根長(zhǎng)達(dá)4.36cm,單株鮮重達(dá)1.48g,試管苗生長(zhǎng)狀況較好;但高濃度椰汁會(huì)使根部出現(xiàn)褐化現(xiàn)象,抑制根部生長(zhǎng),因此低濃度的CW有促進(jìn)粗莖紫金牛生根壯苗作用。

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