宿偉鵬 趙化榮 李晨曦 劉攀 張洋 龔忠誠(chéng)

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.腫瘤中心;2.頜面腫瘤外科,新疆 烏魯木齊 830011)

口腔癌是一種總生存率較低的惡性腫瘤,50歲以上人群的發(fā)病率較高且近年來(lái)趨于年輕化[1]。口腔癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,治療選擇包括手術(shù)、放療和化療,但晚期患者進(jìn)行手術(shù)切除可能需要重建部分口腔或面部特征,而放療和化療通常會(huì)引起一系列嚴(yán)重不良反應(yīng)[2-3]。微小RNA(miRNA)是包含19-24個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA,可以通過(guò)與3′-非翻譯區(qū)堿基配對(duì),與匹配的靶基因mRNA特異性結(jié)合,介導(dǎo)靶基因特異位點(diǎn)的切割或抑制翻譯,從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平[4]。miRNA在癌癥中的生物學(xué)作用及其與臨床相關(guān)性方面的研究取得了顯著進(jìn)展,從而為癌癥診療開辟了新途徑。miR-217在多種癌癥中表達(dá)下調(diào),如肺癌、結(jié)腸癌、胃癌和胰腺癌,并作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用[5-8]。但關(guān)于miR-217在口腔癌中的表達(dá)以及對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程的影響尚未明確。本研究通過(guò)檢測(cè)幾種口腔癌細(xì)胞系中miR-217表達(dá)變化,探究其對(duì)口腔癌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響,旨在闡明miR-217調(diào)節(jié)口腔癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人口腔癌細(xì)胞系HSC3、SAS、SCC15、FaDu和人正?？谇唤琴|(zhì)形成細(xì)胞系HNOK購(gòu)于美國(guó)ATCC。4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)購(gòu)于北京康瑞納生物公司,胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、DMEM培養(yǎng)液及牛血清白蛋白購(gòu)于美國(guó)Gibco公司,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司,miRNA反轉(zhuǎn)錄與定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊生物公司,基因反轉(zhuǎn)錄與定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本Takara公司,Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于沈陽(yáng)萬(wàn)類生物公司,Hoechst 33342染液和DAPI染液購(gòu)于北京索萊寶生物公司,Triton X-100裂解液、RIPA裂解液、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、ECL發(fā)光液以及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物研究所,抗體LC3、LC3I、LC3II、Beclin-1、GRP78、CHOP、Caspase-12、GAPDH、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR) Trizol法提取細(xì)胞總RNA,Nano Drop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品純度、濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒,分別合成miRNA與基因?qū)?yīng)的cDNA,保存于-20 ℃下備用。以cDNA為模板,通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)miRNA和各基因的表達(dá)變化,參照試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系,在Bio-CFX96定量檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增,以U6作為miR-217內(nèi)參基因,以GAPDH作為其余各基因內(nèi)參基因。擴(kuò)增結(jié)束后,根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值,以2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.2.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 在SAS細(xì)胞中加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),常規(guī)消化傳代。待處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,將細(xì)胞以1×105/孔的密度植入6孔板過(guò)夜培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組及處理如下:①對(duì)照組,細(xì)胞正常培養(yǎng)。②miR-NC組,將miR-NC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。③miR-217 mimic組,將miR-217 mimic轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。④miR-217 mimic+4-PBA組,將miR-217 mimic轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,加入含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA(100 nmol/L)處理24 h。采用Lipofectamine 2000試劑盒按照脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染,嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書操作,并通過(guò)RT-qPCR測(cè)定轉(zhuǎn)染效果。處理結(jié)束后,收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù) 將4組SAS細(xì)胞常規(guī)消化離心,加入PBS清洗,并加入適量1×binding buffer重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL,吸取100 μL懸液加入干凈的流式檢測(cè)管中,并依次加入5 μL Annexin V-FITC和10 μLPI,震蕩混勻,立即通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡水平。

1.2.4 Hoechst 33342染色 收集4組SAS細(xì)胞,經(jīng)4%多聚甲醛固定后,滴加0.3%Triton X-100透化處理15 min,PBS洗滌細(xì)胞,滴加終濃度5 mg/L Hoechst 33342染色,充分覆蓋樣品,室溫避光孵育30 min,吸除染色液,PBS再次洗滌細(xì)胞,脫水處理,封片并干燥,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況,Hoechst33342能透過(guò)細(xì)胞胞膜,嵌入胞核DNA內(nèi),使凋亡細(xì)胞發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光染色 用PBS清洗收集的4組SAS細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,滴加0.3 %Triton X-100透化液處理10 min,采用5%牛血清白蛋白室溫封閉30 min。加入兔抗LC3多克隆抗體,以1∶100稀釋,4 ℃孵育過(guò)夜。吸除一抗,PBS清洗,加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG,以1∶200稀釋,37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育1 h,吸除二抗,PBS再次清洗。采用DAPI避光復(fù)染,室溫染色10 min。結(jié)束后再次清洗,抗熒光淬滅劑封片,晾干,在激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況并拍攝圖片,Image J軟件分析蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度。

1.2.6 Western Blot 在細(xì)胞中添加含PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法定量蛋白。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液,100 ℃水浴中煮沸5 min,使蛋白變性。配置10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,取等量變性蛋白上樣,恒壓電泳分離,電轉(zhuǎn)至PVDF膜。再以5%山羊血清封閉1 h,將印跡與一抗LC3I、LC3II、Beclin-1、GRP78、CHOP、Caspase-12抗體4 ℃共孵育過(guò)夜,均以1∶1000稀釋。TBST清洗,加入對(duì)應(yīng)二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG,以1∶5000稀釋,室溫孵育1 h,TBST再次清洗。采用ECL避光顯影,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,內(nèi)參蛋白為GAPDH,蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比來(lái)表示。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 通過(guò)Starbase在線工具預(yù)測(cè)miR-217與HGMA2之間是否存在靶向互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果,為了進(jìn)一步確定HGMA2是否是miR-217的直接靶標(biāo),設(shè)計(jì)HGMA2的野生型(HMGA2 3′-UTR WT)及突變型(HMGA2 3′-UTR MUT)序列,并克隆到熒光素酶質(zhì)粒中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SAS細(xì)胞植入6孔板,按照脂質(zhì)體法將構(gòu)建的報(bào)告基因質(zhì)粒分別與miR-NC或miR-217 mimic轉(zhuǎn)染至SAS細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)染48 h后,利用雙熒光素酶試劑盒對(duì)兩組細(xì)胞中熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)分析。

2 結(jié)果

2.1 口腔癌細(xì)胞中miR-217與HMGA2表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與人正?？谇唤琴|(zhì)形成細(xì)胞系HNOK比較,人口腔癌細(xì)胞系HSC3、SAS、SCC15、FaDu中miR-217相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05),而HMGA2相對(duì)表達(dá)量則顯著上調(diào)(P<0.05),見圖1。

圖1 人正常口腔角質(zhì)形成細(xì)胞與口腔癌細(xì)胞中miR-217與HMGA2表達(dá)比較

2.2 miR-217對(duì)口腔癌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,miR-217 mimic組SAS細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),miR-NC組細(xì)胞凋亡率則未發(fā)生顯著變化(P>0.05);與miR-217 mimic組比較,miR-217 mimic+4-PBA組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05),見圖2。Hoechst 33342染色結(jié)果顯示,對(duì)照組和miR-NC組細(xì)胞胞核外圍輪廓清晰,染色均勻,多數(shù)為暗藍(lán)色低熒光,偶見呈亮藍(lán)色高熒光的核濃縮細(xì)胞,說(shuō)明凋亡細(xì)胞較少; miR-217 mimic組細(xì)胞染色不均勻,有大量呈亮藍(lán)色高熒光,說(shuō)明凋亡細(xì)胞較多;而相較于miR-217 mimic組,miR-217 mimic+4-PBA組細(xì)胞染色恢復(fù)均勻,亮藍(lán)色高熒光細(xì)胞明顯減少,說(shuō)明凋亡細(xì)胞減少。見圖3。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組SAS細(xì)胞凋亡率

圖3 Hoechst 33342染色觀察各組SAS凋亡情況(100×)

2.3 miR-217對(duì)口腔癌細(xì)胞自噬的影響 細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,miR-217 mimic組SAS細(xì)胞中LC3熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.05),而miR-NC組與對(duì)照組的LC3熒光強(qiáng)度之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與miR-217 mimic組比較,miR-217 mimic+4-PBA組SAS細(xì)胞中LC3熒光強(qiáng)度則又顯著下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 細(xì)胞免疫熒光染色觀察各組SAS細(xì)胞中LC3表達(dá)(200×)

2.4 miR-217對(duì)口腔癌細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,miR-217 mimic組SAS細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05),miR-NC組各蛋白表達(dá)未發(fā)生顯著變化(P>0.05);與miR-217 mimic組比較,miR-217 mimic+4-PBA組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ比值與Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05),見圖5。

圖5 Western Blot檢測(cè)各組SAS細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5 miR-217對(duì)口腔癌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)的影響 RT-qPCR和Western Blot測(cè)定結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,miR-217 mimic組SAS細(xì)胞中GRP78、CHOP、Caspase-12的mRNA相對(duì)表達(dá)量與蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05), miR-NC組則未發(fā)生顯著變化(P>0.05);與miR-217 mimic組比較,miR-217 mimic+4-PBA組細(xì)胞中GRP78、CHOP及Caspase-12的mRNA相對(duì)表達(dá)量與蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05),見圖6。

圖6 各組SAS細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)

2.6 miR-217與HMGA2的靶向關(guān)系檢測(cè)與驗(yàn)證 經(jīng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)HMGA2與miR-217在特定區(qū)域存在堿基互補(bǔ)現(xiàn)象,見圖7A。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,與miR-NC與HMGA2 3′-UTR WT共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比較,miR-217 mimic和HMGA2 3′-UTR WT共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見圖7B。此外,Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與miR-NC組比較,miR-217 mimic組細(xì)胞中HMGA2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05),見圖7C。

圖7 miR-217與HMGA2靶向關(guān)系

3 討論

口腔癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種因素,并伴有遺傳和表觀遺傳的不穩(wěn)定性。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,越來(lái)越多的研究表明,一些miRNA在口腔癌中存在差異表達(dá),這些差異表達(dá)的miRNA可能有助于區(qū)分口腔癌患者和健康受試者。此外,一些miRNA的表達(dá)譜已證明與臨床分期、轉(zhuǎn)移和患者存活率呈正相關(guān),表明這些miRNA可被視為口腔癌的預(yù)后指標(biāo)[9-10]。已知miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)水平,參與腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程。因此,調(diào)控癌癥中miRNA的表達(dá)作為一種新型治療策略受到了越來(lái)越多的關(guān)注。miR-24-3p、miR-155-5p和miRNA-10a促進(jìn)口腔癌細(xì)胞的增殖[11-13],沉默這些miRNA的表達(dá)可能會(huì)阻止口腔癌的進(jìn)展。相反,許多miRNA具有抗癌功能,例如miR-6887-5p與miR-34a-5p能夠抑制口腔癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[14-15],過(guò)表達(dá)這些miRNA能夠發(fā)揮抗癌作用。

本研究經(jīng)檢測(cè)人正常口腔角質(zhì)形成細(xì)胞系HNOK與人口腔癌細(xì)胞系HSC3、SAS、SCC15、FaDu中miR-217表達(dá)水平,結(jié)果顯示其在口腔癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào),提示miR-217低表達(dá)可能與口腔癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Jiang等[5]研究表明miR-217可通過(guò)調(diào)節(jié)靶向調(diào)節(jié) sirtuin 1進(jìn)而調(diào)控P53/KAI1軸抑制非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,阻止非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移過(guò)程。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-217在 40例胃癌患者的腫瘤組織及腫瘤轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)下降,并通過(guò)靶向PTPN14抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。miR-217在宮頸癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)下降,提高其表達(dá)水平能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。由此可見,miR-217可能在抑制包括口腔癌在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。

自噬是一個(gè)高度調(diào)節(jié)的過(guò)程,涉及細(xì)胞溶質(zhì)成分、長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)或受損細(xì)胞器的更新。作為一種假定的適應(yīng)性分解代謝過(guò)程,自噬在營(yíng)養(yǎng)剝奪期間被激活,以促進(jìn)細(xì)胞存活。然而,越來(lái)越多的證據(jù)表明,在某些情況下過(guò)度的自噬水平對(duì)細(xì)胞凋亡至關(guān)重要,在細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時(shí),常也伴隨著自噬,兩者之間存在一定的相互作用關(guān)系[17]。本研究在口腔癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-217 mimic后,經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-217 mimic的細(xì)胞凋亡增加,細(xì)胞中自噬標(biāo)志物L(fēng)C3蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與Beclin-1蛋白表達(dá)水平均升高,由此推斷,miR-217能夠促進(jìn)口腔癌細(xì)胞的自噬與凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種不可或缺的真核細(xì)胞器,控制蛋白質(zhì)的生物合成和運(yùn)輸,并維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。許多因素包括蛋白質(zhì)降解、鈣失衡、缺氧和細(xì)胞氧化還原調(diào)節(jié),都會(huì)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)并觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)的保護(hù)機(jī)制,該機(jī)制旨在維持細(xì)胞存活并幫助重建穩(wěn)態(tài)。然而,但當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)承受壓力過(guò)強(qiáng)或外界刺激持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),出發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路變?yōu)榧?xì)胞凋亡通路,誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[18]。GRP78是參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白,其提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活時(shí)間延長(zhǎng)時(shí),通過(guò)促進(jìn)CHOP和Caspase-12的表達(dá)引發(fā)細(xì)胞凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-217 mimic的口腔癌細(xì)胞內(nèi)GRP78、CHOP、Caspase-12的mRNA與蛋白表達(dá)水平均升高,而轉(zhuǎn)染miR-217 mimic同時(shí)采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA處理的口腔癌細(xì)胞中不僅GRP78、CHOP、Caspase-12表達(dá)下降,LC3蛋白熒光強(qiáng)度、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白表達(dá)也均下降,且細(xì)胞凋亡減少,這一結(jié)果表明miR-217可能通過(guò)觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑促進(jìn)口腔癌細(xì)胞的自噬與凋亡。

為了進(jìn)一步研究miR-217抑制口腔癌的分子機(jī)制,本研究通過(guò)生物信息學(xué)在線工具進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)HMGA2與miR-217在特定區(qū)域存在堿基互補(bǔ)現(xiàn)象。而進(jìn)一步雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Western Blot驗(yàn)證了兩者的靶向關(guān)系,揭示了miR-217負(fù)調(diào)控HGMA2表達(dá)。HGMA2在胚胎發(fā)育過(guò)程中參與細(xì)胞增殖和分化,此外,還有多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)HMGA2在惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá),這可能在腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,并與患者的預(yù)后不良密切相關(guān),而下調(diào)其表達(dá)能抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展[20-22],因此可作為一個(gè)潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。

4 結(jié)論

miR-217可通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑,進(jìn)一步誘導(dǎo)自噬與凋亡通路,從而誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞凋亡,且miR-217的該作用可能與其靶向調(diào)控HGMA2表達(dá)相關(guān)。然而,本研究針對(duì)口腔癌中miR-217的機(jī)制進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)初探,其詳細(xì)功能機(jī)制仍有待于進(jìn)一步挖掘。