李挺云 周治彥 周邦奮 王聲興 梁培育

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科,海南 海口 570102)

膀胱癌(Bladder carcinoma,BCa)是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其全球發(fā)病率不斷上升,每年約有43萬例新診斷病例[1-2]。盡管目前手術(shù)、放化療等的BCa治療方法不斷優(yōu)化,但患者的5年生存率仍不理想[3]。Bca發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機制尚未明確,因此,迫切需要深入研究其分子機制,以便探索早期診斷標志物和開發(fā)基于靶標治療的新策略。P300/CBP相關(guān)因子(P300/CBP-associated factor,PCAF)是一種具有內(nèi)在組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的轉(zhuǎn)錄共激活因子,屬于GCN5相關(guān)的N末端乙酰轉(zhuǎn)移酶超家族成員,通過乙?；M蛋白和非組蛋白途徑參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,進而影響細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生及DNA損傷修復(fù)等生理病理過程[4-5]。目前,已發(fā)現(xiàn)PCAF與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在聯(lián)系,如肺癌、乳腺癌、神經(jīng)母細胞瘤及白血病等[6-8]。然而,關(guān)于其與膀胱癌細胞DNA損傷修復(fù)以及腫瘤干細胞干性維持的作用關(guān)系報道鮮少。因此,本研究通過使用順鉑處理構(gòu)建人膀胱癌細胞系5637 DNA損傷模型,經(jīng)過病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)PCAF的表達,以研究其在膀胱癌細胞DNA損傷修復(fù)過程中的作用,以及對腫瘤干細胞干性的影響,為膀胱癌相關(guān)分子的診療研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人膀胱癌細胞系5637購自中國上海中科院細胞庫,順鉑(cisplatin,DDP)購自齊魯制藥,胰島素、人堿性成纖維生長因子(Human alkaline fibroblast growth factor,bFGF)及表皮細胞生長因子(Epidermal growth factor,EGF)購自美國Simga公司,B27購自美國Invitrogen Corp公司,胎牛血清、青霉素、鏈霉素及RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,MTS試劑盒和彗星實驗檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司,二辛可寧酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白檢測試劑盒、ECL發(fā)光液和溴化乙錠購自上海碧云天生物研究所,聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司,免疫磁珠分選材料購自美國Miltenyi公司,抗體PCAF、γ-H2AX、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、人 67kDa層粘連蛋白受體(Human 67kDa laminin receptor,67LR)、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子2(Octamer-binding transcription factor 4,OCT4)、Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein 1,YAP1)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔及羊抗兔熒光二抗購自英國Abcam公司,Ad-PCAF RNAi及陰性對照Ad-GFP腺病毒由上海吉凱基因有限公司構(gòu)建(Ad-PCAF RNAi正義鏈:UCGCCGUGAAGAAAGCGCA,反義鏈:UGCGCUUUCUUCACGGCGA;Ad-GFP正義鏈:UUCUCCGAACGUGUCACGU,反義鏈:ACGUGACACGUUCGGAGAA)。

1.2 細胞培養(yǎng)與病毒感染 人膀胱癌細胞系5637復(fù)蘇后,添加含有10%胎牛血清、1%青霉素與鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待融合度達80%時消化,常規(guī)傳代培養(yǎng)。實驗分組為對照組(細胞正常培養(yǎng))、Ad-GFP組(以陰性對照Ad-GFP腺病毒轉(zhuǎn)染細胞)、Ad-PCAFi組(以Ad-PCAF RNAi腺病毒轉(zhuǎn)染細胞)。將對數(shù)生長期的5637細胞以1×105個/孔的密度接種于六孔板中,置于細胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),棄去培養(yǎng)液,PBS清洗細胞,在細胞孔內(nèi)加入病毒液,感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為50,轉(zhuǎn)染細胞4 h后,棄去含病毒的培養(yǎng)液,換用10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 Western blot 收集各組5637細胞,加入預(yù)冷的RIPA裂解液,置于冰上充分裂解,以12 000 r/min離心5 min,棄沉淀留取上清,BCA法測定蛋白濃度,制備10% 聚丙烯酰胺凝膠,等量蛋白上樣后通過電泳分離,將分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,TBST洗膜,將膜在5%山羊血清中封閉2 h,洗滌后加入一抗,4 ℃孵育過夜。次日,TBST洗膜,加入二抗,室溫孵育2 h,洗膜后滴加ECL顯影液,以GAPDH為內(nèi)參,QuantityOne軟件統(tǒng)計蛋白條帶灰度值,計算蛋白表達水平。

1.4 順鉑誘導(dǎo)細胞DNA損傷 將各組5637細胞以每孔5×103個的密度鋪到96孔板上,5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,分別使用不同劑量(0、20、40、60、80、100 nmol/L)的順鉑刺激細胞4 h,MTS法檢測細胞存活情況。按照每孔150 μL培養(yǎng)基添加30 μL MTS試劑的比例添加試劑,放回細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3 h,取出96孔板拿出,酶標儀檢測各孔細胞490 nm處的吸光度值,繪制各組細胞生長曲線。

1.5 免疫熒光染色實驗 將各組5637細胞鋪到含蓋玻片的24孔板上,密度為每孔1×104個,用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定15 min,其掉固定液,PBS洗滌細胞,使用含0.1% Triton X-100的PBS封閉液室溫封閉30 min,洗凈封閉液后,滴加一抗,使處于蓋玻片的細胞浸入一抗液中,4 ℃過夜孵育。次日,PBS洗滌后,加入山羊抗兔的熒光二抗于蓋破片的細胞面,室溫避光孵育1 h,PBS洗滌,取4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)滴加于玻片上,處理10 min后,封片,晾干,通過熒光顯微鏡觀察各組細胞內(nèi)PCAF與γ-H2AX焦點的形成情況。

1.6 彗星實驗 收集各組5637細胞,胰酶消化,PBS洗滌后,調(diào)整細胞密度為1×105個/mL,配制低熔點瓊脂糖(40 ℃)鋪在磨砂載玻片上,蓋玻片將膠壓平待其凝固。取500 μl細胞懸液與1.5 mL低熔點瓊脂糖混勻,鋪在載玻片上,待其凝固,放在新鮮的裂解液中,室溫裂解2 h,電泳液洗滌,4 ℃過夜。次日,經(jīng)過電泳20 min(電壓25 V,電流300 mA),結(jié)束后無菌水洗滌,加1 mg/mL溴化乙錠染色,無菌水洗滌,通過熒光顯微鏡觀察細胞,CASP 1.2.3軟件分析各組細胞拖尾現(xiàn)象。

1.7 膀胱癌干細胞分離 以CD44作為腫瘤干細胞標記物進行干細胞分離[9-10]。取培養(yǎng)的5637細胞,PBS洗滌,調(diào)整細胞密度為1×108個/mL,取300 μL細胞懸液,加入標記CD44抗體的磁珠和Fc受體,4 ℃避光孵育30 min,PBS洗滌,離心后以PBS重懸細胞,潤洗分離柱,加入細胞懸液使其完全通過分離柱,移出分離柱后添加PBS潤洗,收集洗脫細胞,通過流式細胞儀分選CD44+細胞,陰性對照組添加同型對照抗體,添加無血清培養(yǎng)基(4 mg/mL胰島素、1∶50的B27、10 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF),擴大培養(yǎng),用病毒液感染分選的膀胱癌干細胞。

1.8 細胞成球?qū)嶒?收集各組膀胱癌干細胞,加入含各生長因子(4 mg/mL胰島素、1∶50的B27、10 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF)的無血清培養(yǎng)基,吹打分散為單細胞懸浮液,以每孔1×103個的密度鋪到96孔板上,置于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),1周后,通過倒置顯微鏡觀察視野下的細胞球形成情況,以大于50 μm作為一個細胞球,隨機選擇5個視野計數(shù)細胞成球個數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 病毒感染效率測定 5637細胞在轉(zhuǎn)染48 h后,通過熒光顯微鏡觀察拍照可見Ad-GFP組和Ad-PCAFi組細胞均有明顯的綠色熒光表達,且兩組細胞的轉(zhuǎn)染效率均在90%以上,見圖1A。Western Blot法檢測轉(zhuǎn)染后5637細胞中PCAF蛋白表達水平,Ad-PCAFi組細胞中PCAF蛋白表達上調(diào),較對照組和Ad-GFP組均顯著升高(P<0.05),見圖1B。以上結(jié)果均說明細胞轉(zhuǎn)染成功。

圖1 5637細胞轉(zhuǎn)染效率

2.2 P300/CBP相關(guān)因子影響膀胱癌細胞對順鉑的敏感性 5637細胞轉(zhuǎn)染后再經(jīng)不同濃度順鉑(0、20、40、60、80、100 nmol/L)處理,通過MTS檢測細胞活性發(fā)現(xiàn),各濃度下的Ad-PCAFi組細胞活性均顯著低于對照組和Ad-GFP組的細胞活性(P<0.05),見圖2。說明下調(diào)PCAF提高了5637細胞對順鉑的敏感性。結(jié)合實驗結(jié)果,后續(xù)選擇100 nmol/L順鉑進行研究。

圖2 MTS檢測各組5637細胞活性

2.3 P300/CBP相關(guān)因子影響膀胱癌細胞γ-H2AX焦點形成 通過免疫熒光染色觀察各組5637細胞中PCAF和γ-H2AX焦點,可見PCAF和γ-H2AX在細胞核內(nèi)共定位,對照組和Ad-GFP組細胞內(nèi)染色較淺,γ-H2AX焦點形成少,而Ad-PCAFi組細胞內(nèi)染色深,γ-H2AX焦點形成明顯增加,見圖3。

圖3 免疫熒光染色檢測各組5637細胞中PCAF和γ-H2AX焦點形成(比例尺:10 μm)

2.4 P300/CBP相關(guān)因子影響膀胱癌細胞DNA損傷 彗星圖像結(jié)果中DNA損傷越多,產(chǎn)生的碎片就越多,彗星尾矩越長。本研究結(jié)果顯示出對照組和Ad-GFP組的5637細胞呈圓形亮斑,兩組細胞拖尾現(xiàn)象均不明顯;Ad-PCAFi組細胞呈彗星狀,細胞拖尾較長,經(jīng)統(tǒng)計顯示拖尾細胞數(shù)目比例和尾距較對照組和Ad-GFP組均顯著增加(P<0.05)。見圖4。

圖4 彗星實驗檢測各組5637細胞DNA損傷(比例尺:50 μm)

2.5 P300/CBP相關(guān)因子影響膀胱癌干細胞干性維持 流式細胞術(shù)檢測分選前后膀胱癌干細胞的比例,分選前CD44+標記的細胞比例為23%,經(jīng)過分選后達到93%,CD44+細胞亞群比例明顯增多,說明分選獲得了較高純度的膀胱癌干細胞,見圖5A;Western Blot法檢測分選前后膀胱癌干細胞標記物67LR、OCT4及YAP1蛋白表達情況,檢測結(jié)果顯示分選后細胞內(nèi)67LR、OCT4及YAP1蛋白水平均明顯升高,見圖5B。通過細胞成球?qū)嶒灆z測膀胱癌干細胞成球情況,可見對照組和Ad-GFP組腫瘤干細胞形成的球體體積大,成球個數(shù)多;相較于對照組和Ad-GFP組,Ad-PCAFi組腫瘤干細胞的球體體積變小,成球個數(shù)也顯著減少(P<0.05),見圖6。

圖5 膀胱癌干細胞鑒定

圖6 細胞成球?qū)嶒灆z測各組膀胱癌干細胞成球能力(比例尺:100 μm)

3 討論

BCa的典型特點是容易復(fù)發(fā),因此術(shù)后需要及時復(fù)查,適當(dāng)灌注化療,以降低復(fù)發(fā)的概率。BCa分為非肌肉浸潤性膀胱癌(Non muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)和肌肉浸潤性膀胱癌(Muscle-invasive bladder cancer,MIBC)兩種,NMIBC是最常見的BCa類型,通?？赏ㄟ^開放性的膀胱部分切除術(shù)或經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切除進行治療。盡管多種治療方法已得到改善,但具有廣泛浸潤和轉(zhuǎn)移的MIBC的預(yù)后仍然很差,治愈率不理想,對于T3期肌肉浸潤性膀胱癌,患者的5年生存率僅為40%左右,BCa 細胞通過經(jīng)歷一系列選擇性步驟,包括轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲、血管化、循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)運輸,能夠在不同器官中的定植[3,11]。BCa仍是臨床上的一大難題,探索其潛在治療靶點和生物標志物對于探索BCa的有效診療策略來說十分關(guān)鍵。

以往研究表明,PCAF通過組蛋白或組蛋白的乙?；{(diào)節(jié)多種基因和蛋白質(zhì)的活性,參與許多腫瘤細胞生物學(xué)行為過程。Jia等[12]發(fā)現(xiàn) PCAF 在肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)組織中表達下調(diào),在HCC細胞中過表達PCAF可促進細胞自噬并誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生死亡。Du等[13]研究表明結(jié)直腸癌組織中PCAF高表達的患者生存率較低,5-氟尿嘧啶能夠通過促進PCAF的降解來增強其在結(jié)直腸癌細胞中的細胞毒性。 Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)PCAF在5個胃癌細胞系SGC-7901、MKN45、MGC-803、BGC-823和KATO III中均高表達,HAT抑制劑C646通過使p300和CBP失活來抑制組蛋白H3的乙?；?從而產(chǎn)生抗腫瘤作用。由此可見,PCAF在不同腫瘤類型中可能存在的異常低表達或高表達現(xiàn)象,并發(fā)揮促腫瘤發(fā)生和抗腫瘤的特性。尿路上皮癌作為最常見的膀胱癌類型,已知p300和CBP在尿路上皮癌中經(jīng)常發(fā)生突變,PCAF在尿路上皮癌細胞系中表達上調(diào)[15],由此推測PCAF可能與膀胱癌的發(fā)生相關(guān)。本研究通病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌5637細胞以抑制PCAF表達,來探究其對順鉑誘導(dǎo)細胞DNA損傷修復(fù)及該腫瘤干細胞干性的影響。

在每次細胞分裂過程中要進行DNA復(fù)制,使染色體均勻地分布在子細胞上,而未能保持DNA完整性可能導(dǎo)致細胞過早衰老或者死亡。細胞中的DNA會不斷遭受由內(nèi)源性和外源性過程引起的損傷,其中內(nèi)源性來源主要包括自發(fā)脫氨、活性氧、S-腺苷甲硫氨酸、醛和活性酶等,外源性來源主要包括紫外線輻射、γ-輻射、煙草煙霧致癌物、酒精和致DNA損傷化學(xué)劑[16-17]。腫瘤細胞的 DNA 損傷反應(yīng)是抗癌治療的主要目標,許多化學(xué)治療劑都是通過破壞DNA或阻止DNA損傷修復(fù)來發(fā)揮作用的[18]。因此,揭示參與DNA修復(fù)的各種基因與蛋白,以靶向抑制腫瘤細胞DNA損傷修復(fù)過程,對于推動腫瘤臨床治療具有重要意義。γ-H2AX為組蛋白 H2A 家族的成員H2AX的磷酸化形式,是DNA損傷反應(yīng)的核心參與者,可作為DNA雙鏈斷裂修復(fù)的生物標志物,其焦點形成可反應(yīng)DNA雙鏈斷裂情況以判斷細胞DNA損傷修復(fù)功能[19]。本研究結(jié)果顯示,下調(diào)PCAF表達提高了5637細胞對順鉑的敏感性,加劇了細胞DNA損傷,同時細胞內(nèi)γ-H2AX焦點形成增加,由此說明,下調(diào)PCAF表達能夠抑制5637細胞DNA損傷修復(fù),從而促進該腫瘤細胞發(fā)生凋亡。

近年來,具有干細胞樣特性的未分化細胞群的腫瘤干細胞被視為膀胱癌高復(fù)發(fā)的罪魁禍首,也是膀胱癌臨床特征和生物學(xué)行為復(fù)雜的原因之一。腫瘤干細胞對常規(guī)治療如化學(xué)療法、放射療法和免疫療法等具有抗性,其誘導(dǎo)對腫瘤群體的選擇壓力,導(dǎo)致抗性細胞的選擇性生長[20-21]。因此,靶向膀胱癌中腫瘤干細胞可能是該疾病治療的關(guān)鍵步驟。然而,影響膀胱癌腫瘤干細胞化學(xué)抗性和干性維持的分子機制仍未完全明確。本研究在下調(diào)膀胱癌干細胞中PCAF表達后發(fā)現(xiàn),細胞的成球能力受到了明顯抑制,說明PCAF可能參與了膀胱癌干細胞的干性維持。進入21世紀以來,包括膀胱癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤預(yù)后極差,而腫瘤干細胞為抗癌治療提供了新的視角。確定特異性膀胱癌干細胞標志物,分離和鑒定具有自我更新和分化能力的不同類別膀胱癌干細胞的作用,這將為更好地了解與研究膀胱癌分類、預(yù)后、治療以及改善臨床結(jié)果提供有用信息。

4 結(jié)論

本研究揭示了PCAF在順鉑誘導(dǎo)的膀胱癌細胞DNA損傷修復(fù)及腫瘤干細胞干性維持中的作用,即下調(diào)PCAF可阻止膀胱癌細胞DNA損傷修復(fù)過程,增強腫瘤細胞對順鉑的敏感性,并且對腫瘤細胞干性具有抑制作用。但是,具有一種或多種特異性標志物的腫瘤干細胞并不等于整個腫瘤塊,因此,實體瘤內(nèi)干細胞的研究和臨床應(yīng)用都需要考慮細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的相互作用,這個過程是十分復(fù)雜的,需要強有力的科學(xué)探索,以期在腫瘤治療中發(fā)揮更好的作用效果。