劉明亮, 楊森林, 馬 超

(河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院急診科, 河北 滄州 061001)

急性腦梗塞(Acute cerebral infarction,ACI)是腦部因血液供應(yīng)不足導(dǎo)致局部缺血缺氧引起腦組織出現(xiàn)壞死和軟化的癥狀,多發(fā)病于老年人,數(shù)據(jù)顯示,ACI患者年齡有年輕化趨勢(shì),嚴(yán)重威脅人們的身體健康[1]。阿替普酶是一種血栓溶解藥物,能夠直接激活纖維酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶來降解纖維蛋白,在治療心肌梗死上具有顯著效果[2]。于海燕等[3]發(fā)現(xiàn)阿替普酶可促進(jìn)腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。然而,溶栓治療的時(shí)間窗口很窄,并與腦出血等致命性并發(fā)癥有關(guān)[4]。紅花提取物來自菊科植物紅花(Carthamus tinctorius L.),現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明紅花提取物可影響血小板的聚集,能夠延長(zhǎng)凝血時(shí)間,抑制血栓形成,對(duì)于大鼠急性心肌缺血有很好的保護(hù)作用[5]。但關(guān)于紅花提取物聯(lián)合阿替普酶是否能夠起到聯(lián)合療效,并獲得更有益作用的研究尚未見報(bào)道。TLR4-NLRP3通路被認(rèn)為參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等的重要信號(hào)通路[6]。楊波等[6]發(fā)現(xiàn)原花青素可通過抑制TLR4-NLRP3通路對(duì)腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。本研究對(duì)阿替普酶聯(lián)合紅花提取物可通過調(diào)節(jié)TLR4-NLRP3通路改善ACI損傷進(jìn)行了探索,以期為ACI的治療提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)SD大鼠30只(雌雄各半),體質(zhì)量220～250g,由河北醫(yī)科大學(xué)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公共服務(wù)平臺(tái))提供,使用許可證號(hào):SYXK(冀)2020-002,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(冀)2020-001,大鼠飼養(yǎng)于恒溫(22～25)℃、恒濕的SPF層流罩中。

1.2藥物與試劑:阿替普酶(CAS:105857-23-6,純度≥98%)購自LGM Pharma(北京);紅花提取物(批號(hào):20130326)購自遠(yuǎn)方藥業(yè)有限公司;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,批號(hào):C428BA0042)購自上海生物工程股份有限公司;EB染料(批號(hào):71016588)購自上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司;Trizol試劑(批號(hào):15596018)購自美國(guó)Invitgen;PrimeScriptTM RT試劑盒(批號(hào):RR047A)購自日本Takara;相關(guān)一抗MMP-2(貨號(hào):ab92536)、MMP-9(貨號(hào):ab283575)、Bax(貨號(hào):ab32503)、Bcl-2(貨號(hào):ab182858)、TLR4(貨號(hào):ab13556)、NF-κB p65(貨號(hào):ab288751)、p-NF-κB p65(貨號(hào):ab239882)、NLRP3(貨號(hào):ab263899)、caspase1(貨號(hào):ab207802)、pro-IL-1β(貨號(hào):ab216995)及二抗(貨號(hào):ab6721)購自英國(guó)Abcam;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào):P0009)購自Beyotime;ECL發(fā)光試劑盒(貨號(hào):KF001)購自Affinity。

1.3主要儀器:SpectraMAX Plus384酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器有限公司生產(chǎn);BA210Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡購自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;JY200C電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.4急性腦梗塞大鼠模型制備:大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,進(jìn)行ACI模型建立[7]:首先用1.5%戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉大鼠,仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái),充分暴露其頸部皮膚,75%酒精消毒,通過頸正中切口分離大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和頸外動(dòng)脈(ECA)。將直徑0.26mm的圓形尖端單絲尼龍縫線引入ECA管腔,然后輕輕推進(jìn)到ICA,以阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA)的起始點(diǎn)。假手術(shù)組大鼠將尼龍線插入ECA管腔,但不向頸內(nèi)動(dòng)脈推進(jìn)。阻斷2h后,拔除尼龍線,縫合傷口,75%乙醇消毒。模型制備完成以后,給予大鼠抗感染護(hù)理,大鼠蘇醒后,進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定,得分大于3,則視為ACI造模成功。

1.5分組及給藥方法:將建模成功的大鼠隨機(jī)分模型組、阿替普酶組(尾靜脈注射阿替普酶5mg/kg)、紅花提取物組(尾靜脈注射4g/kg)、阿替普酶聯(lián)合紅花提取物組,每組6只,假手術(shù)組6只。阿替普酶組大鼠按5mg/kg劑量尾靜脈注射阿替普酶;紅花提取物組大鼠尾靜脈注射紅花提取物4g/kg;阿替普酶聯(lián)合紅花提取物組尾靜脈注射阿替普酶(5mg/kg)+紅花提取物(4g/kg);假手術(shù)組和模型組大鼠注射等體積的無菌0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)治療7d。

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分:根據(jù)Zea Longa等的五級(jí)分級(jí)系統(tǒng)評(píng)價(jià)神經(jīng)功能:0分為無缺陷;1分為不能伸展對(duì)側(cè)前爪;2分為縱向旋轉(zhuǎn);3分為跌向?qū)?cè);4分為不能自發(fā)行走。

1.6.2TTC染色評(píng)價(jià)梗死面積:最后一次給藥4h后,處死大鼠,取出腦組織,在-20℃下冷凍15min,切成1mm厚的冠狀切片,用2%的TTC在37℃孵育15min,梗死區(qū)組織呈白色,正常組織呈紅色。采用ImageJ軟件測(cè)量切片面積。

1.6.3HE染色觀察組織病理變化:取腦組織制作石蠟切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察腦組織的病理形態(tài)。光鏡下觀察腦組織病理變化。

1.6.4伊文思藍(lán)(Evans blue)含量測(cè)定:分別取各組2只大鼠,在最后一次給藥后3h經(jīng)股靜脈注射3%EB染料(20μL/10g體重)。大鼠注射EB后1h,灌流生理鹽水100mL 1h后,取腦組織,兩個(gè)大腦半球沿矢狀縫分開,取缺血側(cè)大腦半球稱重,在60℃的3mL甲酰胺中孵育24h,3000r/min離心20min,上清液在632nm波長(zhǎng)處用測(cè)定吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腦組織中EB的含量為ng/g。

1.6.5TUNEL法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡:將腦組織切片切成4～6m厚,腦切片在37℃下與末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TDT)孵育1h,用PBS洗滌3次,然后在室溫下與IgG孵育30min。以0.02% H2O2為酶底物,以四氯化二氨基聯(lián)胺(DAB)為顯色劑,顯色。計(jì)數(shù)來自每個(gè)切片的5個(gè)不同區(qū)域的細(xì)胞。

1.6.6qRT-PCR檢測(cè)TLR4、NF-κB p65、NLRP3表達(dá):使用Trizol試劑提取腦組織總RNA,然后使用PrimeScriptTM RT試劑盒將RNA反向轉(zhuǎn)錄為cDNA,作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的模板。使用SYBR PreMix Ex TaqTM Ⅱ定量基因表達(dá)水平,使用的基因特異性引物如下:TLR4:正向:5'-ATC GGTGGTCAGTGTGCTTGTGGTAG-3',反向:5'-TTCCTGGATGATGTTGGCAGCAATGG-3';NF-κB p65:正向:5'-GCCAGCACCAAGACCGAAGCAATT-3',反向:5'-TACCGCCAGCAGCATCTTCAC ATCTC-3';NLRP3:正向:5'-ACCACCACCTCCAAGACCACCACGG-3',反向:5'-GCCATCAGCAGCCAA GGAGCAGAGA-3';GAPDH:正向:5'-TGAAGAACAGGGAAGCAGCAA-3',反向:5'- ATCCAGTCCATT TTCCACCACA-3'。以GAPDH作為內(nèi)參。qRT-PCR反應(yīng)條件:95℃初始變性10min,隨后95℃變性10s,60℃退火10s,72℃延伸10s,45個(gè)循環(huán),記錄CT值,采用2-△△CT分析相對(duì)表達(dá)水平。

1.6.7Western blotting分析腦組織MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、caspase1、pro-IL-1β蛋白表達(dá):收集的腦組織在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解。冰上孵育離心后,收集上清液,用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度,并通過SDS-PAGE電泳法進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶中室溫封閉2h后,以β-actin為內(nèi)參,分別與MMP-2(1∶500)、MMP-9(1∶500)、Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、TLR4(1∶500)、NF-κB p65(1∶500)、p-NF-κB p65(1∶500)、NLRP3(1∶500)、caspase1(1∶500)、pro-IL-1β(1∶500)和β-actin (1∶1000)抗體在4℃孵育過夜。用TBST沖洗膜3次,用與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二級(jí)抗體(1∶500)37℃孵育1h,用ECL試劑顯帶。采用ImageJ軟件計(jì)算灰度值。

2 結(jié) 果

2.1阿替普酶聯(lián)合紅花提取物對(duì)急性腦梗大鼠腦組織損傷的影響:與假手術(shù)組相比,模型組Zea Longa評(píng)分顯著升高,梗死面積顯著增加(P<0.01),腦組織大量錐體細(xì)胞壞死。與模型組相比,紅花提取物組、阿替普酶聯(lián)合紅花提取物組Zea Longa評(píng)分顯著降低,梗死面積顯著減小(P<0.05),腦組織局部區(qū)域大量錐體細(xì)胞壞死,細(xì)胞形態(tài)較為清晰,且阿替普酶聯(lián)合紅花提取物組改善效果更為明顯。與阿替普酶組相比,阿替普酶聯(lián)合紅花提取物組梗死面積顯著下調(diào)(P<0.05),腦組織輕微受損。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織損傷比較

2.2阿替普酶聯(lián)合紅花提取物對(duì)急性腦梗大鼠血腦屏障破壞的影響:與假手術(shù)組相比,模型組EB含量及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01);與模型組相比,阿替普酶組、紅花提取物組、阿替普酶聯(lián)合紅花提取物組EB含量及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05);與阿替普酶組相比,阿替普酶聯(lián)合紅花提取物組EB含量及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠血腦屏障破壞比較

2.3阿替普酶聯(lián)合紅花提取物對(duì)急性腦梗大鼠組織細(xì)胞凋亡的影響:與假手術(shù)組相比,模型組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著增加,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與模型組相比,阿替普酶組、紅花提取物組、阿替普酶聯(lián)合紅花提取物組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與阿替普酶組比較,阿替普酶聯(lián)合紅花提取物組Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠細(xì)胞凋亡比較

2.4阿替普酶聯(lián)合紅花提取物對(duì)急性腦梗大鼠TLR4/NLRP3通路的影響:與假手術(shù)組相比,模型組TLR4、NF-κB p65、NLRP3 mRNA表達(dá)及TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05);與模型組相比,阿替普酶聯(lián)合紅花提取物組TLR4、NF-κB p65、NLRP3 mRNA表達(dá)及TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05);與阿替普酶組相比,阿替普酶聯(lián)合紅花提取物組NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠TLR4/NLRP3通路因子表達(dá)水平比較

3 討 論

近年來,ACI發(fā)病率呈上升態(tài)勢(shì),2016年我國(guó)缺血性腦卒中患病率達(dá)到1762.77/10萬,改善ACI損傷已顯得十分重要[1]。本研究探討了阿替普酶聯(lián)合紅花提取物對(duì)ACI的影響。研究報(bào)道,神經(jīng)功能缺失評(píng)分、腦梗塞面積、腦組織病理損傷和腦組織水腫是評(píng)價(jià)腦損傷的常用指標(biāo),大腦中動(dòng)脈閉塞可導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙[7]。本研究通過線栓法建立大鼠ACI模型后,首先觀察到模型大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分、腦梗塞面積顯著高于假手術(shù)組,且腦組織受損較為明顯。阿替普酶聯(lián)合紅花提取物干預(yù)可顯著改善神經(jīng)功能缺失評(píng)分,減輕腦梗塞面積,改善腦組織病理損傷。提示阿替普酶聯(lián)合紅花提取物對(duì)ACI具有神經(jīng)保護(hù)作用。

據(jù)報(bào)道,Bcl-2家族蛋白可調(diào)節(jié)線粒體凋亡信號(hào)的激活,其機(jī)制與調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性有關(guān)[8]。Bcl-2具有抗細(xì)胞凋亡和延長(zhǎng)細(xì)胞壽命作用,ACI后Bax的高表達(dá)拮抗Bcl-2作用,研究發(fā)現(xiàn)通過在腦缺血損傷后的不同時(shí)間增加Bax/Bcl-2比率,可使細(xì)胞易發(fā)生細(xì)胞凋亡[9]。本研究結(jié)果顯示,ACI大鼠Bcl-2的表達(dá)顯著降低,Bax的表達(dá)顯著升高,表明ACI誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。經(jīng)阿替普酶聯(lián)合紅花提取物治療后,Bcl-2的表達(dá)顯著上調(diào),Bax的表達(dá)顯著下調(diào),暗示阿替普酶聯(lián)合紅花提取物抑制ACI細(xì)胞凋亡。此外,TUNEL細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,ACI細(xì)胞凋亡率顯著升高,阿替普酶聯(lián)合紅花提取物可顯著降低細(xì)胞凋亡率。表明阿替普酶聯(lián)合紅花提取物對(duì)ACI的保護(hù)作用可能與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

TLRs是一種模式識(shí)別受體,可與病原體相關(guān)分子模式結(jié)合,在先天免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用,TLR4是TLRs家族的成員之一,研究發(fā)現(xiàn)TLR4在腦缺血再灌注損傷模型中被顯著激活[10]。此外,炎性小體在不同疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用,包括缺血性腦損傷、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病[11]。NLRP3炎癥體是由NLRP3連接到caspase1上形成的大分子復(fù)合體,可被ATP、mtDNA、細(xì)菌和病毒成分等刺激激活。研究顯示NLRP3炎癥體可以被大腦中動(dòng)脈阻塞激活,過度激活的NLRP3炎癥體可以將失活的pro-caspase1轉(zhuǎn)化為活性的caspase1,從而誘導(dǎo)IL-1β和IL-18促炎細(xì)胞因子的分泌[12]。TLR4可活化NF-κB,活化的NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中,從而促進(jìn)NLRP3的釋放[13]。研究報(bào)道金合歡素可通過調(diào)節(jié)TLR4/NLRP3信號(hào)通路,實(shí)現(xiàn)對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護(hù)作用[14]。本研究得出類似結(jié)果,在本研究中,ACI大鼠中TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β的表達(dá)顯著增加,而阿替普酶聯(lián)合紅花提取物使TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β的表達(dá)顯著降低。提示阿替普酶聯(lián)合紅花提取物可能通過抑制TLR4-NLRP3信號(hào)通路進(jìn)而起到對(duì)ACI的保護(hù)作用。

綜上所述,ACI會(huì)誘發(fā)大腦中的細(xì)胞凋亡,損害神經(jīng)功能,阿替普酶聯(lián)合紅花提取物可通過抑制TLR4-NLRP3信號(hào)通路及減少細(xì)胞凋亡,從而改善ACI受損的神經(jīng)功能。揭示了阿替普酶聯(lián)合紅花提取物對(duì)ACI的神經(jīng)保護(hù)功能的潛在機(jī)制,并暗示阿替普酶聯(lián)合紅花提取物可能是ACI的一種潛在治療方法。