粒徑均一納米囊泡結(jié)構(gòu)的制備及性能研究

楊凱,翟燕

(太原工業(yè)學(xué)院 材料工程系,山西 太原 030008)

通過兩親性分子自組裝制備的納米結(jié)構(gòu)材料在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及生物材料領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛能[1-2]。兩親性分子中的親水性和疏水性結(jié)構(gòu)單元與介質(zhì)環(huán)境相互作用,使得兩親性分子能夠在選擇性溶劑中發(fā)生自組裝形成不同形貌的納米結(jié)構(gòu),常見的納米結(jié)構(gòu)有球形膠束、納米管和納米囊泡等[3]。在生物體中,各種生物大分子,如蛋白質(zhì)和磷脂,通過分子間或分子內(nèi)的相互作用,可以自發(fā)組裝成囊泡或囊泡類結(jié)構(gòu)[4-6]。生物體內(nèi)的這些囊泡類結(jié)構(gòu)在細(xì)胞之間的信號(hào)傳輸及能量物質(zhì)傳遞方面扮演著重要的角色,例如血液中的胰島素就是以囊泡包裹的形式穿過細(xì)胞膜進(jìn)入組織細(xì)胞中并發(fā)揮效用[7]。因此,可以將納米囊泡結(jié)構(gòu)被用作藥物或者基因載體,在藥物輸送及基因工程領(lǐng)域充分發(fā)揮生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值[8-9]。

兩親性聚合物自組裝制備的囊泡結(jié)構(gòu)由于在生理?xiàng)l件下能夠更穩(wěn)定存在,可以被用作藥物載體用于藥物輸送。同濟(jì)大學(xué)李永勇教授課題組,將三嵌段共聚物PzLL-SS-PEG-SS-PzLL在水溶液中自組裝制備的囊泡結(jié)構(gòu)用于鹽酸阿霉素(DOX·HCl)的負(fù)載運(yùn)輸[10];蘇州大學(xué)孟鳳華教授課題組,將三嵌段共聚物PEG-PAA-PDEA組裝制備的囊泡用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)傳遞,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[11]。能夠?qū)ν獠看碳ぷ龀鲰憫?yīng),進(jìn)而發(fā)生形貌改變的納米囊泡載體可以實(shí)現(xiàn)負(fù)載藥物的可控釋放,提高治療效率,進(jìn)一步拓寬了其在病毒殺死和疾病治療等領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。浙江大學(xué)俞豪杰教授課題組,將硝基氧自由基引入到兩親性聚合物HLT中,組裝制備囊泡結(jié)構(gòu)后將其用于氟美松(DEX)的輸送,負(fù)載藥物后的囊泡結(jié)構(gòu)在抗壞血酸存在的條件下能夠自發(fā)解散并釋放藥物,展現(xiàn)出良好的還原刺激響應(yīng)特性[12]。蘇州大學(xué)鐘志遠(yuǎn)教授課題組,利用所合成的兩親性共聚物PEG-PTMBPTC組裝制備了對(duì)環(huán)境pH值能夠做出刺激響應(yīng)的囊泡結(jié)構(gòu),并將其用于紫杉醇(PTX)的包覆運(yùn)輸,由于聚合物分子鏈中存在的環(huán)芐基縮醛基團(tuán)在弱酸性pH值下能發(fā)生快速水解,導(dǎo)致囊泡聚集體的膨脹和散解,從而實(shí)現(xiàn)負(fù)載藥物的可控釋放[13]。除此之外,能夠?qū)ζ渌獠凯h(huán)境,如光、氧化還原、溫度等刺激做出響應(yīng)的藥物運(yùn)載體的研究也被持續(xù)報(bào)道[14]。納米囊泡的藥物負(fù)載量與粒徑分布存在密切關(guān)系,粒徑分布越窄,藥物負(fù)載量越高。同時(shí),囊泡結(jié)構(gòu)的尺寸大小也會(huì)影響藥物載體的輸送效率,例如粒徑尺寸在200 nm左右的囊泡結(jié)構(gòu)能夠選擇性地穿透腫瘤部位的毛細(xì)血管壁到達(dá)病灶[15]。目前,粒徑大小可控、分布均一,同時(shí)在水溶液中能夠穩(wěn)定分散的納米囊泡結(jié)構(gòu)的制備還存在諸多挑戰(zhàn)[16-17]。同時(shí),現(xiàn)有報(bào)道中用于藥物輸送的納米囊泡結(jié)構(gòu)多是通過嵌段共聚物在水溶液中自組裝制備。嵌段共聚物的合成路線冗長(zhǎng)、步驟繁瑣,往往涉及不同嵌段的順序共聚及接枝、取代、水解和“點(diǎn)擊”反應(yīng)等步驟[18-19]。相對(duì)于嵌段共聚物,無(wú)規(guī)共聚物的制備過程簡(jiǎn)單,通常是通過兩種或多種不同單體一步共聚制備合成。因此,利用無(wú)規(guī)共聚物自組裝制備能夠穩(wěn)定在水溶液中分散、粒徑大小分布均一的納米囊泡結(jié)構(gòu)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域更具實(shí)際意義。

采用ATRP反應(yīng)僅一步成功制備了無(wú)規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA),通過無(wú)規(guī)共聚物在水中自組裝制備了能夠穩(wěn)定在水溶液中分散、粒徑大小分布均一、對(duì)pH值具有刺激響應(yīng)的囊泡結(jié)構(gòu)。通過核磁共振氫譜(1H NMR)和傅里葉紅外光譜(FT-IR)對(duì)聚合物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,通過凝膠滲透色譜(GPC)對(duì)聚合物的分子量大小及分布進(jìn)行了表征,通過透射電鏡(TEM)和動(dòng)態(tài)光散射光譜(DLS)對(duì)囊泡結(jié)構(gòu)的形貌、粒徑大小及分布進(jìn)行了表征,并對(duì)所制備囊泡結(jié)構(gòu)的pH值刺激響應(yīng)特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,無(wú)規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)成功制備,分子量大小為10 600,分子量分布指數(shù)(Mw/Mn)為1.20;在水中自組裝后的形貌為囊泡結(jié)構(gòu),囊泡的粒徑大小為(220±10)nm、大小分布均一、分散性穩(wěn)定性良好;囊泡結(jié)構(gòu)表面的zeta電位值為(32.6±0.8)mV。這些優(yōu)異的特性使得所制備的新型納米囊泡結(jié)構(gòu)可以被用作藥物或者基因載體,在藥物輸送、靶向釋放及基因工程領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

聚乙二醇單甲醚(mPEG,平均分子量5 000,aladdin),2-溴異丁酰溴(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%,aladdin),甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEAEMA,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%,aladdin),甲基丙烯酸2,2,3,4,4,4-六氟丁酯(HFBMA,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%,aladdin),五甲基二乙烯三胺(PMDETA,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%,aladdin),溴化亞銅(CuBr,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%,aladdin),三氯甲烷(分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠)。

1.2 測(cè)試儀器

傅立葉變換紅外光譜(VERTEX 70,德國(guó)布魯克公司),400 M核磁共振波譜儀(AVANCE III HD,德國(guó)布魯克公司),馬爾文激光粒度儀(Mastersizer 3000,英國(guó)馬爾文儀器有限公司),凝膠滲透色譜儀(Waters 1515,美國(guó)沃特世有限公司),透射電子顯微鏡(JEM-2100F,日本電子株式會(huì)社)。

1.3 大分子引發(fā)劑mPEG-Br的合成

參照參考文獻(xiàn)報(bào)道的合成方法來(lái)合成大分子引發(fā)劑mPEG-Br[20-23]。首先,將三乙胺和二氯甲烷干燥。將mPEG(Mn=5 000 g/mol,22.0 g,4.4 mmol)和三乙胺(1.5 mL,10.8 mmol)溶解在200 mL二氯甲烷中。將混合溶液在冰浴中冷卻,向混合溶液中滴加溶解在15 mL二氯甲烷中的2-溴異丁酰溴(1.5 mL,14.3 mmol),并在2 h內(nèi)滴加完畢。隨后升溫25 ℃,攪拌12 h。反應(yīng)完畢后,過濾除去反應(yīng)生成的鹽。所得濾液依次用1 mol/L HCl,1 mol/L NaOH和去離子水洗滌。用硫酸鎂干燥后,將濾液滴加到過量的冰冷乙醚中沉出,室溫下真空干燥12 h,得到白色固體mPEG-Br。

1.4 無(wú)規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的合成

將大分子引發(fā)劑mPEG-Br(1.00 g,0.2 mmol),DEAEMA(0.56 g,3.0 mmol),HFBMA(0.18 g,0.72 mmol)和三氯甲烷(5 mL)的混合溶液加入到裝有磁力攪拌棒的25 mL Schlenk燒瓶中,并通過三次冷凍抽氣-解凍循環(huán)。反應(yīng)混合物在液氮中保持冷凍的狀態(tài)下依次將PMDETA(0.35 g,0.2 mmol)和CuBr(0.29 g,0.2 mmol)快速加入燒瓶中,隨后立即將燒瓶中充入氬氣。燒瓶密封后,進(jìn)行三次抽脫氣循環(huán)。然后將燒瓶浸入60 ℃的水浴,4 h后將反應(yīng)物通入空氣并加入THF終止反應(yīng)。旋蒸除去大量溶劑,將所得藍(lán)色粗產(chǎn)物通過硅膠層析柱進(jìn)行純化,其中二氯甲烷作為淋洗液。將所得產(chǎn)物溶液濃縮并在正己烷中沉淀析出,將粗產(chǎn)物在真空干燥箱中干燥24 h。

1.5 無(wú)規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的自組裝

將25.0 mg無(wú)規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)溶于1 mL 四氫呋喃溶液中,充分?jǐn)嚢杌旌?.5 h。隨后將混合溶液裝入透析袋(7 000 Da)在去離子水溶液中透析6 h,通過各嵌段親疏水作用引導(dǎo)無(wú)規(guī)共聚物進(jìn)行自組裝。然后,將所得溶液在5 000 r/min下離心5 min,收集上層溶液后并重新分散在5 mL去離子水中。

2 結(jié)果與討論

2.1 mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)分子結(jié)構(gòu)表征

圖1(a)是無(wú)規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的完整合成路線。圖1(b)和圖1(c)分別是無(wú)規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的FT-IR和1H NMR譜圖。如圖1(b)所示,波數(shù)在2 987 cm-1處的吸收帶是共聚物結(jié)構(gòu)中-CH3的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰;波數(shù)在1 747,1 481(1 454),1 406(1 380),1 188 cm-1和1 107 cm-1處的吸收帶分別是聚合物鏈段P(DEAEMA-r-HFBMA)結(jié)構(gòu)中C=O的伸縮振動(dòng)峰、-C(F)3的兩個(gè)特征振動(dòng)吸收峰、-C(F)2-的兩個(gè)特征振動(dòng)吸收峰、-C-F的特征振動(dòng)吸收峰和-C-N振動(dòng)吸收峰;波數(shù)在1 287 cm-1處的吸收帶是聚合物鏈段mPEG結(jié)構(gòu)中-C-O-C-的伸縮振動(dòng)吸收峰。如圖1(c)所示,化學(xué)位移在4.8～5.1和4.02處是聚合物鏈段P(DEAEMA-r-HFBMA)結(jié)構(gòu)中-CHF-和C-CH2N-的質(zhì)子峰;化學(xué)位移在3.66處是聚合物鏈段mPEG結(jié)構(gòu)中骨架-CH2CH2O-的質(zhì)子峰;其他化學(xué)位移質(zhì)子峰的歸屬均在圖1(c)中標(biāo)出。

圖1 (a)無(wú)規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的合成路線;無(wú)規(guī)共聚物(b)FT-IR譜圖和(c)1H NMR譜圖

無(wú)規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的分子量及分子量分布信息詳細(xì)羅列在表1中。無(wú)規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的Mn大小為10 600 g/mol;Mw/Mn的大小為1.20,說明無(wú)規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的分子量分布均一。

表1 無(wú)規(guī)共聚物GPC分子量信息

2.2 mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)在水中自組裝后的形貌及分散性表征

通過TEM對(duì)共聚物自組裝后的形貌和粒徑大小進(jìn)行了表征,無(wú)規(guī)共聚物自組裝形成粒徑大小均勻的囊泡結(jié)構(gòu),囊泡的粒徑大小為(220±10) nm,如圖2(a)所示。圖2(b)是自組裝后分散在緩沖溶液中的DLS結(jié)果,在緩沖溶液中分散的囊泡結(jié)構(gòu)水力直徑Dh,DLS=(231±8) nm,多分散性指數(shù)PDI=0.12,說明自組裝形成的囊泡結(jié)構(gòu)分散性良好。TEM和DLS粒徑結(jié)果差異是因?yàn)闇y(cè)試條件的不同引起的,TEM測(cè)試時(shí)囊泡結(jié)構(gòu)處于干燥狀態(tài),而DLS測(cè)試時(shí)囊泡結(jié)構(gòu)分散在水溶液中,導(dǎo)致DLS所測(cè)得的粒徑略微比TEM測(cè)得的粒徑偏大。同時(shí),通過zeta電位測(cè)試對(duì)囊泡結(jié)構(gòu)表面的帶電性和膠體穩(wěn)定性進(jìn)行了表征,囊泡溶液的zeta電位值為(32.6±0.8)mV,說明囊泡結(jié)構(gòu)在溶液中膠體穩(wěn)定性良好,能夠穩(wěn)定分散。

圖2 無(wú)規(guī)共聚物自組裝后的(a)TEM圖(右上是從TEM圖中所統(tǒng)計(jì)的囊泡結(jié)構(gòu)粒徑大小分布)和(b)組裝后溶液的DLS圖

3 結(jié)論

(1)采用ATRP反應(yīng)僅一步制備了無(wú)規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA),FT-IR和1H NMR結(jié)果表明無(wú)規(guī)共聚物的成功制備;

(2)GPC結(jié)果表明所制備的無(wú)規(guī)共聚物的分子量大小Mn=10 600 g/mol,分子量分布均窄,因此其自組裝后的相貌及分布比較理想;

(3)通過將所制備無(wú)規(guī)共聚物在水性溶液中自組裝制備了分散穩(wěn)定性良好、粒徑大小分布均一的單分散納米囊泡結(jié)構(gòu)。囊泡的粒徑大小為(220±10)nm;囊泡結(jié)構(gòu)表面的zeta電位值為(32.6±0.8)mV,分散性和膠體穩(wěn)定性良好;

(4)綜合以上優(yōu)異的特性,所制備的納米囊泡結(jié)構(gòu)能夠被用來(lái)用作藥物載體,為實(shí)現(xiàn)抗癌藥物高負(fù)載輸送并在腫瘤細(xì)胞等癌變部位的靶向釋放提供了無(wú)限可能。