主成分分析結(jié)合馬氏距離法剔除深靜脈血栓紅外光譜異常樣品

陳紹璞,杜宇,鄭麗娜,王志浩,劉琪

(中國(guó)刑事警察學(xué)院 法醫(yī)病理教研室,遼寧 沈陽 110854)

肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism,PTE),指來自靜脈系統(tǒng)或右心血栓脫落后阻塞肺動(dòng)脈或其分支所導(dǎo)致的疾病。深靜脈血栓(Deep venous thrombosis,DVT)是引起PTE的重要血栓來源,多達(dá)95%為下肢深靜脈血栓[1]。因PTE臨床表現(xiàn)非特異[2],起病急,死亡突然,患者家屬常不能理解和接受,極易引發(fā)糾紛,故PTE導(dǎo)致猝死的案例是法醫(yī)實(shí)際檢案的“?？汀?約占同期尸體檢驗(yàn)案例總數(shù)的1%～5%[3]。推斷DVT形成時(shí)間對(duì)于PTE血栓的溯源,認(rèn)定PTE猝死案件中的主體責(zé)任,具有重要意義。目前對(duì)于DVT形成時(shí)間推斷的研究多是基于常規(guī)組織病理學(xué)技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)等進(jìn)行的,其結(jié)果直觀明顯,容易分析,但其用于推斷DVT形成時(shí)間存在主觀性,有一定差異,缺乏客觀的度量標(biāo)準(zhǔn),需要尋找一種盡可能減小主觀因素影響的DVT形成時(shí)間推斷方法[3]。

近年來,傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared,FTIR)以其非侵入性、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。FTIR分析作為一種客觀的化學(xué)分析方法,能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)基團(tuán)振動(dòng)水平變化,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、脂質(zhì)、核酸等受損時(shí),其紅外光譜也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化[4]?；谶@一特性,FTIR在法醫(yī)學(xué)疾病診斷[5-6]、損傷鑒定[7-9]、死亡時(shí)間和損傷時(shí)間的推斷[10-11]等方面有較為深入的研究和應(yīng)用,同時(shí)也為DVT形成時(shí)間的客觀推斷提供了新的思路。以往研究已對(duì)骨[12-13]、皮膚[14]、心臟[15]、肝臟[16]等多種生物組織進(jìn)行了紅外光譜分析,但不同組織的預(yù)處理方式各不相同,特征波段也有所差異。同時(shí)尚未見到對(duì)血栓組織進(jìn)行紅外光譜分析相關(guān)的研究。故對(duì)于血栓組織的FTIR檢測(cè)與分析條件的研究具有重要意義。

在實(shí)際FTIR檢測(cè)過程中,常因樣品自身因素、實(shí)驗(yàn)操作以及環(huán)境因素等導(dǎo)致出現(xiàn)異常樣品,在樣品集中引入這些異常樣品會(huì)導(dǎo)致紅外光譜的建模穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)精度有所下降[17]。而生物組織成分復(fù)雜,變異度大,對(duì)生物組織進(jìn)行FTIR分析時(shí),先對(duì)異常樣品進(jìn)行篩選和剔除,有利于提高建模效果[18]。

馬氏距離D2是廣義平方距離的一種,以多元正態(tài)分布理論為基礎(chǔ),有效地考慮了均值、方差、協(xié)方差三個(gè)參數(shù),是一個(gè)能夠全面描述總體多元結(jié)構(gòu)的綜合指標(biāo)[19]。馬氏距離通過計(jì)算不同樣本數(shù)據(jù)到樣本集中心值的距離來體現(xiàn)樣本間的區(qū)別。主成分分析法(Principal Component Analysis,PCA)是數(shù)學(xué)上用來降維的一種方法,通過正交變換將一組多個(gè)變量重新組合為一組新的互相無關(guān)的綜合變量,以減少變量的數(shù)量,并通過選取貢獻(xiàn)率占累計(jì)貢獻(xiàn)率較大的主成分(PCs)表示原變量的信息[20]。將PCA與馬氏距離相結(jié)合,即使用主成分得分代替原數(shù)據(jù)計(jì)算馬氏距離不僅能反映全部數(shù)據(jù)信息,而且也能壓縮參加計(jì)算馬氏距離的變量數(shù),并能保證 M 矩陣不存在共線問題[21]。

本研究以大鼠DVT為研究對(duì)象,進(jìn)行FTIR檢測(cè),采用偏最小二乘回歸(Partial least squares regression,PLSR)建立光譜分析模型建模,采用PCA結(jié)合馬氏距離法篩選血栓光譜異常值,探究該方法對(duì)血栓紅外光譜分析建模能力的提升效能,以期為利用FTIR技術(shù)分析DVT,推斷DVT形成時(shí)間方面研究提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 深靜脈血栓樣品來源

采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲取深靜脈血栓樣品,選擇健康成年(7～8周齡)雄性SD大鼠90只,體重250～300 g。采用下腔靜脈狹窄法[22-23]建立大鼠DVT模型,手術(shù)具體操作為:于左腎靜脈水平下方2～3 mm范圍內(nèi)設(shè)置狹窄點(diǎn),用絲線結(jié)扎下腔靜脈,致管腔約90%狹窄。分別于造模后1,3,5,7,14,21 d(每組15只大鼠)采用過量乙醚方式對(duì)大鼠行安樂死,剪取狹窄點(diǎn)至左右髂總靜脈分叉之間的全段下腔靜脈(含血栓)進(jìn)行檢驗(yàn)。本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合相應(yīng)倫理要求。

1.2 血栓紅外光譜檢測(cè)

剝離下腔靜脈壁取出全部血栓組織,置于1 mL離心管中用眼科剪充分剪碎混勻后取0.01 g均勻鋪于清潔載玻片上,置于恒溫干燥箱中25 ℃干燥2 h,刮取少量組織采用溴化鉀壓片法進(jìn)行FTIR檢測(cè)。傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 5700,賽默飛世爾科技公司)設(shè)置掃描范圍4 000～400 cm-1,分辨率4 cm-1,重復(fù)掃描32次。

1.3 光譜數(shù)據(jù)處理

采用The Unscrambler X10.4軟件處理和分析光譜數(shù)據(jù)。預(yù)處理方法選擇基線校正(Baseline)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)、多元散射校正(MSC)、矢量標(biāo)準(zhǔn)化(Unit vector normalization)、平滑(Smoothing),采用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)計(jì)算主成分得分,分析主成分貢獻(xiàn)率。采用偏最小二乘回歸(Partial least squares regression,PLSR)對(duì)血栓紅外光譜進(jìn)行建模分析,每組按照10∶3比例隨機(jī)分成校正集和預(yù)測(cè)集,模型內(nèi)部采用交叉驗(yàn)證法(Cross validation)進(jìn)行驗(yàn)證。模型性能及預(yù)測(cè)效果通過決定系數(shù)R2、交叉驗(yàn)證均方根誤差(Root mean square error of cross validation,RMSECV)、預(yù)測(cè)均方根誤差(Root mean square error of prediction,RMSEP)等指標(biāo)進(jìn)行描述。模型預(yù)測(cè)能力以目標(biāo)函數(shù)F[24]進(jìn)行評(píng)價(jià):

1.4 馬氏距離計(jì)算及異常值篩選

計(jì)算主成分得分:

An×f=Xn×m×Pm×f

(2)

式(2)中X為光譜矩陣;P為主成分載荷矩陣;n為樣品數(shù);m為變量數(shù);f為主成分?jǐn)?shù)。

對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行中心化處理:

(3)

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)集的協(xié)方差矩陣:

(4)

計(jì)算樣品集中各樣品到平均光譜的馬氏距離:

(5)

式(5)中M-1為標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)集的協(xié)方差陣的逆矩陣;為樣品集數(shù)據(jù);代表平均光譜數(shù)據(jù)。

馬氏距離閾值計(jì)算:

(6)

式(6)中為馬氏距離平均值;為馬氏距離標(biāo)準(zhǔn)差;e為調(diào)整剔除閾值的權(quán)重系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 剔除前的血栓樣品光譜分析

采集的90個(gè)DVT光譜數(shù)據(jù)如圖1所示。對(duì)剔除前數(shù)據(jù)進(jìn)行PLSR,其交叉驗(yàn)證R2為0.743,小于0.75,模型穩(wěn)定性欠佳,預(yù)測(cè)R2為0.785,RMSEP為3.208 d,誤差較大,預(yù)測(cè)效果不理想。部分異常樣品的存在可能影響了血栓光譜建模的效果,需要對(duì)異常樣品進(jìn)行篩選和剔除。

2.2 光譜預(yù)處理方法的選擇

在進(jìn)行PCA之前,應(yīng)當(dāng)盡量減小光譜中的噪聲干擾。為提高血栓光譜穩(wěn)定性,本研究測(cè)試了平滑、基線校正、SNV、矢量歸一化、MSC等生物組織FTIR分析中常用的預(yù)處理方法的處理效果,對(duì)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行PLSR建模后,結(jié)果如表1所示。除平滑外,MSC、矢量歸一化、SNV和基線校正均使建模效果在原始光譜基礎(chǔ)上有明顯提升,其中以MSC對(duì)建模效果提升為最佳,其預(yù)測(cè)決定系數(shù)R2P為0.882,較原始光譜提升了12.4%; RMSEP為2.381 d,較原始光譜減小了25.8%。

表1 不同預(yù)處理方法對(duì)建模效果的影響

由于血栓樣品內(nèi)部組分分布和顆粒大小不均勻,溴化鉀壓片厚度不一等原因,有可能因散射效應(yīng)引入干擾而將重要信息掩蓋,而多元散射校正(MSC)是一種將散射信號(hào)與化學(xué)吸收信息進(jìn)行分離的一種預(yù)處理方法,可以消除由于樣品顆粒和壓片厚度不均勻,而造成的光譜差異[25]。因此,根據(jù)目標(biāo)函數(shù)值選擇最大的MSC法作為本研究的光譜處理方法。

2.3 PCA結(jié)合馬氏距離篩選異常樣品

對(duì)經(jīng)MSC處理后的血栓光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA,圖2顯示了提取到的7個(gè)主成分的特征值貢獻(xiàn)率。第一主成分的貢獻(xiàn)率為66.08%,前6個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到99.06%,第七主成分貢獻(xiàn)占比小于1%,故選取前6個(gè)主成分得分進(jìn)行馬氏距離計(jì)算,結(jié)果如圖3所示。從各樣品馬氏距離分布情況看,88,15,79,49等樣品呈現(xiàn)明顯離群分布。

圖2 PCA主成分累積貢獻(xiàn)率

圖3 馬氏距離分布圖

為了進(jìn)一步對(duì)異常樣品進(jìn)行判別,采用權(quán)重公式對(duì)馬氏距離的篩選閾值進(jìn)行測(cè)定。設(shè)定9個(gè)不同的權(quán)重系數(shù)e,即3,2.5,2,1.5,1,0.5,0.4,0.3,0.2,分別計(jì)算出篩選閾值后,將大于該閾值的樣品列為異常樣品剔除,對(duì)剔除后的樣品集再次進(jìn)行PLSR分析,結(jié)果如表2所示。計(jì)算各權(quán)重系數(shù)下的目標(biāo)函數(shù)值,結(jié)果如圖4所示,所有權(quán)重系數(shù)下的目標(biāo)函數(shù)值均大于剔除異常樣品前,且隨權(quán)重系數(shù)的減小,模型預(yù)測(cè)能力出現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象。對(duì)于各權(quán)重情況,當(dāng)權(quán)重為3和2.5時(shí),模型預(yù)測(cè)能力較差,目標(biāo)函數(shù)值均為18.940,剔除樣品均為4個(gè);進(jìn)一步減小權(quán)重系數(shù)模型預(yù)測(cè)能力提高,當(dāng)權(quán)重為1時(shí),預(yù)測(cè)能力達(dá)到最優(yōu),目標(biāo)函數(shù)值為28.877,該權(quán)重下的預(yù)測(cè)R2為0.905,較剔除前提升了2.61%,RMSEP為2.134 d,較剔除前降低了10.3%,共剔除樣品9個(gè)。模型預(yù)測(cè)能力得到有效提升。

表2 不同權(quán)重系數(shù)的剔除樣品數(shù)及PLSR建模效果

圖4 不同權(quán)重系數(shù)下的目標(biāo)函數(shù)值

權(quán)重系數(shù)的設(shè)定是判別和剔除異常樣品的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn),采用不同的權(quán)重劃分異常值,對(duì)血栓光譜建模的預(yù)測(cè)能力有不同程度的影響,當(dāng)權(quán)重過大會(huì)導(dǎo)致樣品剔除不夠,而權(quán)重過小則會(huì)導(dǎo)致樣品剔除過多,都會(huì)導(dǎo)致模型預(yù)測(cè)能力下降。進(jìn)一步分析被剔除的9個(gè)樣品,產(chǎn)生差異的原因可能是由于動(dòng)物個(gè)體差異所致。血栓的形成、溶解及機(jī)化再通是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化過程,需要多種效應(yīng)細(xì)胞以及調(diào)節(jié)因子共同參與[3]。不同個(gè)體之間,血栓的進(jìn)展有一定區(qū)別,從而導(dǎo)致了血栓在生物化學(xué)方面存在一定差異。紅外光譜是一種十分靈敏的計(jì)量?jī)x器,當(dāng)這種差異較大時(shí),則會(huì)達(dá)到儀器的檢測(cè)閾值,從而產(chǎn)生足以影響機(jī)器學(xué)習(xí)建模效果的誤差。采用PCA結(jié)合馬氏距離法對(duì)樣品集中的異常值進(jìn)行篩選,可以判定異常值,剔除異常樣品,從而提升血栓紅外光譜的建模效果。

3 結(jié)論

利用PCA結(jié)合馬氏距離法能夠有效地剔除血栓組織紅外光譜樣品集中存在的異常樣品,提高了紅外光譜PLSR建模的預(yù)測(cè)能力。不同的權(quán)重系數(shù)對(duì)血栓光譜的PLSR分析預(yù)測(cè)能力有不同程度的影響,以權(quán)重為1篩選異常值,剔除異常樣品后PLSR預(yù)測(cè)精度最好。為DVT的紅外光譜分析提供了方法依據(jù),為利用FTIR技術(shù)推斷大鼠DVT形成時(shí)間提供了理論基礎(chǔ),豐富了FTIR用于推斷法醫(yī)學(xué)損傷時(shí)間、法醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)推斷死亡原因的研究?jī)?nèi)容。