趙剛,羅懌文,聞靜*

(1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,江西 上饒 334000;2.永新中學(xué),江西 吉安 343499)

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)為多年生蔓生藤本植物,學(xué)名三葉崖爬藤,屬于葡萄科崖爬藤屬,喜陰涼,多生長在林下,具地下塊根[1]。三葉青是我國具有悠久民間藥用歷史的植物,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明三葉青塊根提取物具有消炎、鎮(zhèn)痛及解毒等作用[2],對(duì)一些慢性疾病如糖尿病及高脂血癥等也具有良好的治療效果[3－4],其塊根提取物中的黃酮類化合物對(duì)腫瘤的治療有卓越的效果,有巨大的抗腫瘤臨床應(yīng)用價(jià)值[5]。MYB(V－myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)轉(zhuǎn)錄因子家族以含有獨(dú)特的MYB結(jié)構(gòu)域?yàn)榉肿咏Y(jié)構(gòu)特征[6],迄今為止的研究顯示MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物中普遍存在,并在植物對(duì)干旱與高鹽等非生物脅迫的耐逆性應(yīng)答[7－8]及次生代謝物質(zhì)的合成代謝過程中扮演重要角色[9－11],特別是在黃酮類化合物合成代謝中起到重要作用[12－13]。

本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),在三葉青塊根發(fā)育過程中伴隨著黃酮類化合物的顯著積累,MYB類轉(zhuǎn)錄因子大量差異表達(dá)。從三葉青塊根的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選表達(dá)豐度最高的兩個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子ThMYB1和ThMYB2,克隆該基因的cDNA 序列,對(duì)之進(jìn)行測(cè)序及初步的生物信息學(xué)分析,以期為進(jìn)一步研究該基因與三葉青塊根發(fā)育及與黃酮類化合物合成代謝的相關(guān)性提供分子生物學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以玉山縣農(nóng)林合作社自主馴化栽培的懷玉山三葉青品種“懷玉2號(hào)”為實(shí)驗(yàn)材料,該三葉青栽培種為國家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品。

針對(duì)多酚多糖中藥植物的專用RNA 提取試劑盒,由北京華越洋生物科技有限公司提供;反轉(zhuǎn)錄(RTPCR)試劑盒、膠回收試劑盒、克隆測(cè)序所用的載體及感受態(tài)細(xì)胞(E.coli DH5α),大連寶生物科技有限公司提供;PCR 高保真酶(Trans Taq DNA ploy High Fidely),北京全式金生物科技有限公司提供;從國藥集團(tuán)采購Boiwest瓊脂糖、Tris－base、氯仿、EDTA 等試劑;PCR 引物合成由上海生物工程股份有限公司合成;cDNA 樣品送南昌華大生物科技有限分公司測(cè)序。

1.2 三葉青總RNA 的提取及cDNA 的合成

以三葉青的芽為樣本提取總RNA,稱取100mg幼芽進(jìn)行液氮研磨,具體提取方法參照試劑盒說明書。RNA 提取后采用Spec Nano檢測(cè)RNA 的純度及濃度,采用RNA 濃度大于200 ng/μL的總RNA 用于反轉(zhuǎn)錄(RT－PCR),反轉(zhuǎn)錄的體系及溫控條件參考說明書進(jìn)行設(shè)置。

1.3 Th MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆和測(cè)序

從三葉青轉(zhuǎn)錄組篩選并調(diào)取ThMYB基因的cDNA 序列,利用Primer 3－SGD 在線程序設(shè)計(jì)擴(kuò)增兩個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子的引物,用于擴(kuò)增基因cDNA 全長,引物信息見表1。PCR 體系的配置方法參照說明書,熱反應(yīng)條件如下:98℃變性1 min;98℃變性15s,55℃退火10s,72℃延伸1.5 min,反應(yīng)40個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。以0.8%瓊脂糖TAE 凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的有無及其位置。PCR產(chǎn)物純化后與克隆載體p MD－18T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,氨芐霉素(50mg/m L)篩選陽性菌落,菌落PCR檢測(cè)后挑選兩個(gè)以上陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒后送公司測(cè)序。

表1 用于Th MYB 基因克隆的引物序列

1.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站中開放讀碼框預(yù)測(cè)(ORF－Finder)模塊推測(cè)開放讀碼框位置并獲得氨基酸序列,利用蛋白質(zhì)比對(duì)模塊(Blastp)分析蛋白質(zhì)的氨基酸序列與已知序列的相似性;利用信號(hào)肽在線預(yù)測(cè)模塊(SignalP－5.0)預(yù)測(cè)Th MYB1和Th MYB2蛋白質(zhì)信號(hào)肽的有無;利用SOPMA在線程序分析蛋白質(zhì)的保守氨基酸序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)特征;利用ExPASy分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及親/疏水性;利用Cell－PLoc 2.0預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位;利用SWISS－MODEL在線模塊構(gòu)建蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)空間模型;使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 Th MYB 1和Th MYB 2基因的克隆

通過PCR 擴(kuò)增成功克隆懷玉山三葉青的ThMYB1和ThMYB2基因,獲得包含完整讀碼框的cDNA序列,通過測(cè)序獲得的ThMYB1基因片段全長1 450bp,ThMYB2基因片段全長856bp,具體如圖1所示。

圖1 Th MYB 1與Th MYB 2 PCR 產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 三葉青Th MYB 基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1ThMYB1與ThMYB2基因推測(cè)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

ORF Finder在線分析表明,ThMYB1基因的ORF長度為960bp,編碼319個(gè)氨基酸(圖2)。Blastp比對(duì)結(jié)果顯示與葡萄(Vitisvinifera)的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子PHL6(登錄號(hào)RVW63118.1)相似度最高,覆蓋度為98%,相似度為80.50%;蛋白質(zhì)保守域分析表明,Th MYB1在97－153氨基酸位點(diǎn)間存在MYB 特征SHAQKYF的DNA 結(jié)合域,在189－235氨基酸位點(diǎn)具有Myb_CC 特征的LHEQLE 保守域。ThMYB2的ORF長度為489bp,編碼162個(gè)氨基酸(圖3),blastp 比對(duì)結(jié)果顯示與河葡萄(Vitisriparia)的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子(登錄號(hào)XP_034693329.1)相似度最高,覆蓋度為94%,相似度為95.93%;推測(cè)蛋白質(zhì)序列在78－105氨基酸位點(diǎn)存在PLN03212(Transcription repressor MYB5;Provisional)保守域。以上生物信息學(xué)初步分析表明,ThMYB1與ThMYB2基因的推測(cè)蛋白質(zhì)為植物MYB家族成員。ThMYB1與ThMYB2基因推測(cè)氨基酸序列的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位如表2所示。

圖2 Th MYB 1測(cè)序所得序列及ORF finder翻譯結(jié)果

圖3 Th MYB 2測(cè)序所得序列及ORF finder翻譯結(jié)果

表2 Th MYB 1與Th MYB 2基因編碼推測(cè)氨基酸序列的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、信號(hào)肽、細(xì)胞亞定位和親/疏水性

2.2.2ThMYB1和ThMYB2推測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)

ThMYB1推測(cè)蛋白質(zhì)的3D 模型是以磷酸鹽虧欠響應(yīng)蛋白質(zhì)2(Protein PHOSPHATE STARVATION RESPONSE 2)的模型建立起來的,模型對(duì)序列有效的識(shí)別率達(dá)到了62.12%;ThMYB2推測(cè)蛋白質(zhì)的3D 模型是以SAGA 輔助因子(SAGA－associated factor 11)為基本模型建立起來的,但是序列有效識(shí)別率較低為18.8%(圖4)。

圖4 Th MYB 1與Th MYB 2推測(cè)蛋白質(zhì)的3D 模型

2.2.3ThMYB1和ThMYB2進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用Blastp對(duì)兩種蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性比較,分別選取與Th MYB1和Th MYB2蛋白質(zhì)同源性較高的其他植物的MYB蛋白質(zhì)序列,使用MEGAX 軟件中的Neighbor－Joining法構(gòu)建Th MYB1和Th MYB2蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果如圖5所示。Th MYB1蛋白質(zhì)與葡萄MYB 類轉(zhuǎn)錄因子PHL6處于同一進(jìn)化分支,Th MYB2蛋白質(zhì)與河葡萄的MYB5轉(zhuǎn)錄因子處于同一進(jìn)化分支,Th MYB1與Th MYB2兩種蛋白質(zhì)序列相似性較低,處于不同的進(jìn)化分支。

圖5 Th MYB1與Th MYB2系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

3 討論

MYB蛋白質(zhì)超家族數(shù)量龐大,功能多樣,存在于所有真核生物中,大多數(shù)MYB蛋白質(zhì)作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用,多重復(fù)結(jié)構(gòu)域的主要功能是結(jié)合DNA 模板[14]。MYB 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征在于高度保守的MYBDNA 結(jié)合域,通常該結(jié)構(gòu)域由最多四個(gè)重復(fù)序列(被稱為R 序列)組成,每個(gè)重復(fù)序列約包含52個(gè)氨基酸或更少數(shù)量的氨基酸,每個(gè)重復(fù)序列形成三個(gè)α－螺旋,其中第二個(gè)和第三個(gè)螺旋能夠形成一個(gè)螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋(HTH)結(jié)構(gòu),具有三個(gè)規(guī)則間隔的色氨酸(或疏水)殘基,在3D HTH 結(jié)構(gòu)中形成疏水核心[15]。MYB類蛋白質(zhì)可以根據(jù)臨近重復(fù)序列的數(shù)量多少分成4個(gè)不同亞家族,其中最小的一類是4R－MYB亞家族,其成員包含四個(gè)類似R1/R2的重復(fù)序列,目前對(duì)該類蛋白質(zhì)研究極少[16];第二類是指R1R2R3型MYB(3R－MYB)蛋白質(zhì),編碼3R－MYB蛋白質(zhì)的基因已在大多數(shù)真核生物基因組中被發(fā)現(xiàn),主要在細(xì)胞周期控制中發(fā)揮著不同的作用[17];第三種MYB相關(guān)亞家族蛋白質(zhì)僅含有單個(gè)或部分MYB重復(fù)的蛋白質(zhì),統(tǒng)稱為MYB相關(guān)家族(1R－ MYB/MYB－related)[18－19],本研究中的ThMYB2基因只有一個(gè)PLN03212保守域,因此Th MYB2屬于該1R－MYB/MYB－related亞家族;第四種R2R3－MYB 轉(zhuǎn)錄因子,在N 端帶有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即MYB結(jié)構(gòu)域),而在C 端則帶有激活或抑制結(jié)構(gòu)域,Th MYB2在N 端(97－153氨基酸位點(diǎn))存在MYB特征SHAQKYF的DNA 結(jié)合域,在C端(189－235氨基酸位點(diǎn))具有Myb_CC特征的LHEQLE保守域,因此Th MYB1屬于該亞家族[20]。由于保守域的不同,Th MYB1及Th MYB2分屬不同的MYB亞家族,Th MYB2所屬的R2R3－MYB亞家族的蛋白質(zhì)參與到較為廣泛的植物學(xué)生物過程中,包括次生物質(zhì)的代謝[21]、生物脅迫[22]與非生物脅迫[23]、細(xì)胞分化與纖維發(fā)育[24]及種子萌發(fā)[25]等生物學(xué)過程;而關(guān)于Th MYB1所屬的MYB/MYB－related的亞家族的研究較少,目前只發(fā)現(xiàn)該類亞家族蛋白質(zhì)有可能參與到低溫脅迫[26]及ABA 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[27]。

目前有大量的研究表明,植物地下儲(chǔ)藏器官中黃酮類化合物的代謝與MYB轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)。St-MYB12A的過表達(dá)顯著增加了馬鈴薯(Solanumtuberosum)塊莖中黃酮醇和其他苯丙素的含量[28]。Yu等[29]的研究表明,芒柄花素和刺槐素含量在美麗雞血藤(Calleryaspeciosa,Champ.ex Benth)塊根發(fā)育過程中顯著增加,R2R3－Cs MYB可能調(diào)控了參與異黃酮生物合成途徑的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。MYB－b HLHWD40/MYB－b HLH－WD40－WRKY 復(fù)合物可結(jié)合花青素結(jié)構(gòu)基因IbDFR的啟動(dòng)子并激活該基因的表達(dá),以維持甘薯(Ipomoeabatatas)塊根中花青素的積累[30]。Th MYB2蛋白質(zhì)與河葡萄的MYB5轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系最近,阿馬托(Amato)等[31]的研究表明,葡萄的MYB5轉(zhuǎn)錄因子能夠使MBW 復(fù)合物與WRKY因子結(jié)合,以增強(qiáng)參與葡萄中液泡超酸化和運(yùn)輸相關(guān)的靶基因的表達(dá)。ThMYB1轉(zhuǎn)錄因子與葡萄MYB類轉(zhuǎn)錄因子PHL6處于同一進(jìn)化分支,而關(guān)于葡萄VvPHL6基因的功能,目前還沒有報(bào)道。

植物的MYB類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與到植物的生長發(fā)育過程中,目前MYB類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于三葉青黃酮類化合物生物合成調(diào)控的研究還未見報(bào)道,前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究表明,藍(lán)光輻照后伴隨著黃酮類化合物含量提高,ThMYB1和ThMYB2轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量顯著提高,但是ThMYB1和ThMYB2轉(zhuǎn)錄因子在三葉青塊根發(fā)育過程中的表達(dá)與黃酮化合物的積累是否相關(guān),還需要進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證進(jìn)行研究。