NOD 樣受體家族含CARD 結(jié)構(gòu)域5 在胃癌中的相互作用蛋白及其對(duì)胃癌的診斷價(jià)值△

吳楊，張小敏，鄭少華

定州市人民醫(yī)院1腫瘤內(nèi)科，2消化內(nèi)科，河北 定州 073000

NOD 樣受體家族含CARD 結(jié)構(gòu)域5（NOD-like receptor family CARD domain containing 5，NLRC5）的表達(dá)抑制可以顯著增強(qiáng)脂基糖（liposaccharide，LPS）刺激下核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的活性以及細(xì)胞因子的表達(dá)量，而其自身也是NF-κB 通路的產(chǎn)物，被LPS 活化的NF-κB可以上調(diào)NLRC5 的表達(dá)，從而形成一個(gè)負(fù)反饋環(huán)，對(duì)NF-κB 活性進(jìn)行更精細(xì)的調(diào)控[1-3]。胃癌發(fā)生的影響因素較多，包括遺傳因素、地域飲食文化因素、環(huán)境因素等，胃黏膜感染后產(chǎn)生的多種炎性因子可以激活NF-κB 通路，進(jìn)而使多種細(xì)胞趨化因子上調(diào)，在胃癌的發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[4]。雖然NLRC5 是NF-κB 信號(hào)通路的上游因子，但是否還有其他生物學(xué)通路參與NLRC5 的表達(dá)，目前無較多的研究報(bào)道。因此本研究應(yīng)用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫和基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫探究與NLRC5 相關(guān)的調(diào)控通路，明確其在胃癌中的診斷價(jià)值和生物學(xué)特性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 生物信息分析（數(shù)據(jù)獲取與預(yù)處理）

TCGA（https://www.genome.gov/Funded- Programs-Projects/Cancer-Genome-Atlas）數(shù)據(jù)庫是由美國國家癌癥研究所設(shè)立的腫瘤樣本數(shù)據(jù)庫，旨在通過基因組分析尋找腫瘤相關(guān)的基因變異。根據(jù)本研究要求，利用“TCGAbiolinks”包下載TCGA 中胃癌樣本，細(xì)胞學(xué)分類只選擇腺癌樣本，防止由于細(xì)胞學(xué)分類不同帶來的影響，最終納入377 例腫瘤組織樣本和34 例癌旁組織樣本。

GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是由美國國家生物技術(shù)信息中心建立并管理的生物信息公共數(shù)據(jù)庫。GEO 數(shù)據(jù)庫是全球最大且免費(fèi)開放的數(shù)據(jù)庫，包含了各國科研人員收集上傳的測(cè)序數(shù)據(jù)和芯片數(shù)據(jù)，其涵蓋的疾病范圍不僅包含腫瘤疾病也包含非腫瘤疾病，物種從智人、小鼠、果蠅等擴(kuò)展到微生物，是生物信息學(xué)研究的重要數(shù)據(jù)來源。根據(jù)本研究要求收集胃腺癌樣本數(shù)據(jù)集，最終鎖定數(shù)據(jù)集為GSE213324，數(shù)據(jù)集中包含63 例腫瘤組織樣本和60 例癌旁組織樣本。

本研究為了探討NLRC5基因?qū)ξ赴┗颊呱媲闆r的影響，以TCGA 為發(fā)現(xiàn)集、GEO 為驗(yàn)證集來評(píng)估NLRC5 在胃癌患者中的生物學(xué)作用。采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)比較NLRC5 在胃癌組織及癌旁組織間的表達(dá)差異，同時(shí)利用“l(fā)imma”包篩選組間差異表達(dá)基因。利用“clusterProfiler”包對(duì)關(guān)鍵基因分別進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，均以P﹤0.05 為判別標(biāo)準(zhǔn)篩選有意義的生物學(xué)途徑。以NLRC5 為研究中心，將其他基因分別與NLRC5 進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析來篩選與NLRC5 在表達(dá)量上存在協(xié)同變化的基因。若無特殊說明，利用R 軟件中的“ggplot2”對(duì)上述數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

1.2 一般資料

收集2020 年3 月至2022 年11 月于定州市人民醫(yī)院就診的胃癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)和病理學(xué)檢查確診為胃癌；②在定州市人民醫(yī)院就診及治療；③未接受過放化療、免疫治療；④臨床資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有嚴(yán)重心腦血管疾??；②嚴(yán)重肝腎功能不全；③合并其他惡性腫瘤；④合并免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾病。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入60 例胃癌患者，男性48 例，女性12 例；平均年齡（68.09±7.15）歲；TNM 分期：Ⅰ期4 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期27 例，Ⅳ期6例。取60 例胃癌患者的60 例胃癌組織和60 例癌旁組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意。

1.3 方法

1.3.1 胃癌組織與癌旁組織的采集和處理 將病理檢查取樣的組織樣本分為兩部分，一部分在取樣后進(jìn)行石蠟處理保存，一部分進(jìn)行組織勻漿制備，置于-20 ℃下保存。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)核因子κB 激酶復(fù)合物抑制劑組分（component of inhibitor of nuclear factor kappa B kinase complex，CHUK）、核因子κB 激酶亞單位β的抑制劑（inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit beta，IKBKB）在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量 CHUK 蛋白檢測(cè)采用武漢云克隆科技股份有限公司保守螺旋環(huán)螺旋廣泛存在激酶（CHUK）檢測(cè)試劑盒。IKBKB 蛋白檢測(cè)采用武漢伊艾博科技股份有限公司核因子κB抑制蛋白激酶亞基β檢測(cè)試劑盒。使用制備好的胃癌組織以及癌旁組織勻漿根據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 免疫組化法檢測(cè)三重基序蛋白25（tripartite motif containing 25，TRIM25）、NLRC5 表達(dá)情況胃癌組織及癌旁組織石蠟塊進(jìn)行4 μm 切片，運(yùn)用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（streptavidin-peroxidase，SP）法檢測(cè)胃癌組織和癌旁組織中NLRC5、TRIM25 的表達(dá)情況，具體步驟根據(jù)SP 試劑盒進(jìn)行操作。免疫組化結(jié)果由兩位副主任醫(yī)師及以上職稱的病理科醫(yī)師雙盲閱片，獨(dú)立評(píng)分。依據(jù)切片中陽性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度：無色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性細(xì)胞所占比例：無陽性細(xì)胞為0 分，1%≤陽性細(xì)胞所占比例﹤25%為1分，25%≤陽性細(xì)胞所占比例﹤50%為2 分，50%≤陽性細(xì)胞所占比例﹤75%為3 分，陽性細(xì)胞所占比例≥75%為4 分。將兩項(xiàng)得分相乘：0～3 分定義為“-”，4～5 分為“+”，6～7 分為“++”，≥8 分為“+++”；0～5 分為陰性，≥6 分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，評(píng)價(jià)TRIM25、IKBKB、CHUK、NLRC5 對(duì)胃癌的診斷價(jià)值；采用散點(diǎn)圖評(píng)估TRIM25、IKBKB、CHUK 與NLRC5 的相關(guān)性；以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選NLRC5相關(guān)差異表達(dá)基因并進(jìn)行富集分析

在TCGA 數(shù)據(jù)集中采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)比較NLRC5 在胃癌組織及癌旁組織間的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，胃癌組織中NLRC5 表達(dá)水平明顯高于癌旁組織[（0.123±0.011）vs（0.008±0.003），P﹤0.01）]。組間差異基因分析以P﹤0.05 且|log2FC|﹥0.11 為標(biāo)準(zhǔn)共篩選出4466 個(gè)差異表達(dá)基因。將基因譜中的全部基因分別與NLRC5 進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析并進(jìn)行富集分析，GO 富集分析結(jié)果顯示，生物學(xué)途徑中mRNA 和DNA 過程高度富集。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，核質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞周期也被高度富集（圖1）。因此得到NLRC5 涉及的相關(guān)顯著基因在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中主要參與基因合成、mRNA相關(guān)功能。

圖1 GO富集分析和KEGG富集分析

2.2 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用STRING 網(wǎng)站確定NLRC5 相互作用蛋白，根據(jù)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)可知，NLRC5 一共有29 條生物學(xué)關(guān)聯(lián)，共10 個(gè)基因與NLRC5有生物學(xué)相互作用。將這10個(gè)基因與TCGA數(shù)據(jù)庫篩選到的4466 個(gè)基因取交集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有3 個(gè)基因，分別為TRIM25、CHUK、IKBKB，TRIM25、CHUK、IKBKB 與NLRC5 有生物學(xué)相互作用。胃癌組織與癌旁組織中TRIM25、CHUK、IKBKB 表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）（圖2）。Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，TRIM25、CHUK、IKBKB 與NLRC5 均呈正相關(guān)（P﹤0.01）（圖3）。

圖2 胃癌組織和癌旁組織中TRIM25、CHUK和IKBKB表達(dá)情況的比較

圖3 TRIM25、CHUK、IKBKB與NLRC5的相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.3 GEO 數(shù)據(jù)集驗(yàn)證結(jié)果

從GEO 數(shù)據(jù)集下載GSE213324 數(shù)據(jù)集來驗(yàn)證TCGA 數(shù)據(jù)集篩選到的3 個(gè)基因。胃癌組織中TRIM25、IKBKB 和NLRC5 表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）；胃癌組織和癌旁組織中CHUK 表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）（圖4）。利用TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 構(gòu)建聯(lián)合診斷模型，繪制ROC 曲線量化聯(lián)合模型的診斷效能，結(jié)果顯示，TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌具有較高診斷價(jià)值（曲線下面積=0.920，95%CI：0.870～0.970）（圖5）。

圖4 GEO數(shù)據(jù)集中胃癌組織和癌旁組織中TRIM25、CHUK、IKBKB和NLRC5表達(dá)情況的比較

2.4 TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 表達(dá)情況的比較

免疫組化結(jié)果顯示，NLRC5 在60 例胃癌組織中的陽性表達(dá)率為95.00%（57/60），陰性表達(dá)率為5.00%（3/60），在癌旁組織中的陽性表達(dá)率為41.67%（25/60），陰性表達(dá)率為58.33%（35/60）。TRIM25 在60 例胃癌組織中的陽性表達(dá)率為81.67%（49/60），陰性表達(dá)率為18.33%（11/60），在癌旁組織中的陽性表達(dá)率為41.67%（25/60），陰性表達(dá)率為58.33%（35/60）。胃癌組織中NLRC5、TRIM25 免疫組化評(píng)分均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌組織中CHUK、IKBKB 表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表1、圖6）

表1 胃癌組織和癌旁組織中IKBKB、CHUK、TRIM25、NLRC5 表達(dá)情況的比較

圖6 胃癌組織和癌旁組織中NLRC5和TRIM25表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

2.5 臨床模型中TRIM25、CHUK、IKBKB 與NLRC5 的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，TRIM25、CHUK、IKBKB 與NLRC5 均呈正相關(guān)（P﹤0.01）。（圖7）

圖7 臨床模型中TRIM25、CHUK、IKBKB與NLRC5的相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.6 TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌的診斷效能分析

ROC 曲線顯示，NLRC5[曲線下面積為0.872（95%CI：0.809～0.935）]診斷胃癌的效能優(yōu)于TRIM25[ 曲線下面積為0.783（95%CI：0.697～0.869）]、CHUK[曲線下面積為0.755（95%CI：0.667～0.843）]、IKBKB[曲線下面積為0.771（95%CI：0.681～0.860）]。TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5聯(lián)合檢測(cè)[曲線下面積為0.946（95%CI：0.909～0.983）]診斷胃癌的效能優(yōu)于各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)，說明聯(lián)合模型對(duì)于胃癌具有良好的診斷效能，其中貢獻(xiàn)度最高的是NLRC5。（圖8）

圖8 臨床模型中TRIM25、CHUK、IKBKB和NLRC5單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷胃癌的ROC曲線

3 討論

NLRC5 是主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（major histocompatibility complex Ⅰ，MHCⅠ）類基因和參與MHCⅠ類抗原呈遞途徑的其他基因轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵調(diào)控因子。MHCⅠ類反式激活因子（MHC class Ⅰtransactivator，CITA）/NLRC5通過募集和激活殺死腫瘤的CD8+T細(xì)胞，在人類腫瘤免疫中起著至關(guān)重要的作用[5-6]。作為NLR 家族中的成員，NLRC5可通過調(diào)控炎性反應(yīng)維持機(jī)體的穩(wěn)定，而腫瘤的發(fā)生與炎性反應(yīng)存在顯著關(guān)系[7-8]。有研究顯示，NLRC5基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、TNM 分期、預(yù)后存在直接關(guān)聯(lián)[9]。徐徽等[10]研究也提示，NLRC5高表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，其研究重點(diǎn)在于NLRC5 與患者預(yù)后的關(guān)系以及胃癌細(xì)胞生物學(xué)，并未對(duì)NLRC5在胃癌診斷中的價(jià)值進(jìn)行分析。已有研究表明，NLRC5 作為NF-κB 的上游因子可結(jié)合NF-κB 通路中的關(guān)鍵激酶IKKα/β并抑制其磷酸化，抑制NF-κB 通路的活化[11-12]。而蛋白存在多條調(diào)控通路，直接或者間接參與疾病的發(fā)展，探究是否還存在其他與NLRC5 相關(guān)的蛋白，共同調(diào)節(jié)NF-κB 的表達(dá)，來參與胃癌的發(fā)生或發(fā)展在臨床工作中至關(guān)重要，可為臨床中胃癌診斷與治療提供新的方向。

本研究通過采用TCGA 數(shù)據(jù)庫探究NLRC5 在胃癌組織和癌旁組織中的差異，結(jié)合STRING 網(wǎng)站分析NLRC5 的相互作用蛋白，通過GEO 數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證TCGA 數(shù)據(jù)集篩選出來的蛋白對(duì)胃癌的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，與NLRC5 互關(guān)作用的蛋白為TRIM25、CHUK、IKBKB，聯(lián)合診斷模型對(duì)胃癌具有較高的診斷價(jià)值。IKBKB編碼的蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑/NF-κB 復(fù)合物中的抑制劑，導(dǎo)致抑制劑解離和NF-κB 激活[13]。而NLRC5 主要作用于NF-κB通路中的關(guān)鍵激酶IKKα/β 并抑制其磷酸化。CHUK基因編碼的復(fù)合物IKKα是NF-κB 信號(hào)通路必要的調(diào)節(jié)器之一[14-15]。NLRC5 負(fù)調(diào)控NF-κB 通路的機(jī)制在于結(jié)合通路中的關(guān)鍵激酶IKKα/β并抑制其磷酸化，當(dāng)磷酸化位點(diǎn)不能通過泛素化途徑觸發(fā)抑制劑的降解，則轉(zhuǎn)錄因子激活失敗。NF-κB通路活化失調(diào)后，NLRC5 負(fù)調(diào)控NF-κB 通路進(jìn)而降低通路活化數(shù)量。CHUK 磷酸化通過泛素化途徑觸發(fā)抑制劑降解的位點(diǎn)，從而激活轉(zhuǎn)錄因子，而TRIM25 作為泛素E3 連接酶發(fā)揮作用，參與多種細(xì)胞過程，包括抗病毒先天免疫的調(diào)節(jié)[16]。綜上所述，TRIM25、CHUK、IKBKB 與NLRC5 在胃癌發(fā)展中存在直接或者間接相互作用的機(jī)制通路。

研究顯示，IKBKB 參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，并且IKBKB 高表達(dá)胃癌患者生存率和無病生存率均顯著低于IKBKB 低表達(dá)胃癌患者[17]，提示IKBKB有可能成為胃癌臨床診斷的新靶標(biāo)，但未有此方面的研究。TRIM25 能影響胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，在胃癌發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[18]。而針對(duì)CHUK 的研究較少，目前在腫瘤方面尤其是胃癌處于空白。本研究通過引用臨床胃癌模型來驗(yàn)證生物信息學(xué)篩選出來的相關(guān)作用蛋白，結(jié)果顯示，TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 均在胃癌組織中高表達(dá)，且TRIM25、CHUK、IKBKB 與NLRC5 的表達(dá)均呈正相關(guān)，證實(shí)TRIM25、CHUK、IKBKB 是NLRC5 的相互作用蛋白。最后通過建立聯(lián)合診斷模型，繪制ROC 曲線量化聯(lián)合模型的診斷效能，結(jié)果顯示曲線下面積為0.946，95%CI 為0.909～0.983，說明TRIM25、CHUK、IKBKB 及NLRC5 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌具有較高的診斷價(jià)值。

綜上所述，NLRC5 通過抑制TRIM25 的表達(dá)來降低對(duì)CHUK 產(chǎn)物IKKα的降解位點(diǎn)的觸發(fā)，減少NF-κB 的激活，而IKBKB 通過降解NLRC5 來增強(qiáng)NF-κB 的激活。NLRC5 高表達(dá)導(dǎo)致IKBKB 的直接性高表達(dá)，定向降解NLRC5 對(duì)NF-κB 激活抑制，因此探究抑制IKBKB 的表達(dá)，對(duì)NLRC5 在腫瘤發(fā)展中的作用至關(guān)重要。本研究的不足在于臨床驗(yàn)證模型樣本量較少，沒有納入遺傳因素和地域飲食文化等因素，在后續(xù)的研究中需要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行5 年的隨訪觀察。