黑色素瘤相關抗原3、zeste 2 多梳抑制復合物2 亞基增強子在宮頸癌組織中的表達及與患者預后的關系

牛云霞，王越月，王雷

1陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院病理科，陜西 咸陽 712000

2延安大學咸陽醫(yī)院病理科，陜西 咸陽 712000

宮頸癌是全球第三大女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率。目前，晚期宮頸癌患者的中位生存期僅16 個月，嚴重影響患者的預后[1]。因此，晚期宮頸癌患者的治療重點是改善患者的預后，抑制腫瘤細胞的進一步侵襲、轉移。免疫治療是近年來新興的研究熱點之一，創(chuàng)傷小，易被醫(yī)師和患者接受。免疫靶點需要具有較高的特異性，即在正常組織中呈陰性或弱陽性表達，在腫瘤組織中呈陽性表達，從而避免治療后產生自身免疫性疾病[2]。隨著分子生物學的不斷發(fā)展完善，人們逐漸意識到宮頸癌是由多基因參與的癌變，因此，了解宮頸癌特異性抗原對腫瘤的監(jiān)測、判斷至關重要，可為掌握腫瘤精準治療奠定基礎。研究發(fā)現，下調黑色素瘤相關抗原3（melanoma-associated antigen 3，MAGEA3）的表達可抑制腫瘤細胞的侵襲，表明MAGEA3 可促進腫瘤細胞的生長[3-4]。目前臨床已開展關于MAGEA3 免疫治療的臨床試驗，但僅局限在肺癌、膀胱癌等患者，對宮頸癌的研究較少。此外，zeste 2 多梳抑制復合物2 亞基增強子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）也被證實可增強肺癌細胞的增殖和轉移能力，但對宮頸癌發(fā)生發(fā)展的作用及與患者預后的關系仍未能完全明確。因此，本研究探討MAGEA3、EZH2 在宮頸癌組織中的表達及與患者預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年5 月至2016 年5 月陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院收治的宮頸癌患者。納入標準：①符合《宮頸癌磁共振檢查及診斷規(guī)范專家共識》[5]中宮頸癌的診斷標準；②精神狀態(tài)良好；③既往未接受手術或化療；④病歷資料完整。排除標準：①繼發(fā)性宮頸癌；②隨訪資料不完整；③語言認知功能障礙，無正常溝通能力。依據納入和排除標準，本研究共納入45 例宮頸癌患者，年齡30～67 歲，平均（47.92±5.16）歲。選取同期陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院收治的18 例宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者和17 例健康體檢者。CIN 患者年齡31～66 歲，平均（46.89±5.31）歲。健康體檢者年齡29～65歲，平均（47.43±4.92）歲。宮頸癌患者、CIN患者、健康體檢者年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化法檢測MAGEA3、EZH2 的表達情況

取宮頸癌患者的宮頸癌組織、CIN 患者的CIN組織和健康體檢者的正常宮頸組織，切片、脫蠟、水化后，以0.01 mmol/L 枸櫞酸鹽溶液進行抗原修復13 min，冷卻至室溫后，滴加少量過氧化氫，以滅活過氧化物酶活性，山羊血清封閉，于室溫下孵育20 min，并用濾紙將表面殘余水分擦除。滴加一抗EZH2 多克隆抗體、MAGEA3 多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗，滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，梯度乙醇脫水，蘇木精復染，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

結果判定：MAGEA3、EZH2 主要定位于細胞核，依據染色強度和陽性細胞所占比例進行評分。無著色計0分，淡黃色染色計1分，棕色染色計2分，棕褐色染色計3 分；陽性細胞所占比例﹤25%計0分，陽性細胞所占比例25%～50%計1 分，陽性細胞所占比例51%～75%計2 分，陽性細胞所占比例﹥75%計3分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相乘，﹤3分判定為陰性，≥3分判定為陽性。

1.3 隨訪方法

采用電話或微信等方式對宮頸癌患者進行為期3 年的隨訪，隨訪時間截至2019 年5 月，記錄患者的生存情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對所有數據進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；MAGEA3、EZH2 表達的相關性采用Spearman 相關分析；宮頸癌患者預后的影響因素采用多因素Logistic 回歸分析；以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MAGEA3、EZH2 表達情況的比較

宮頸癌組織、CIN 組織和正常宮頸組織中MAGEA3、EZH2 的陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01），宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽性表達率均高于正常宮頸組織和CIN 組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。（表1）

表1 宮頸癌組織、CIN 組織和正常宮頸組織中MAGEA3、EZH2 表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征宮頸癌患者MAGEA3、EZH2 表達情況的比較

不同年齡、絕經狀態(tài)、腫瘤直徑、病理類型宮頸癌患者宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）；淋巴結轉移、肌層浸潤深度﹥1/2、臨床分期為ⅡA 期、組織學分級為G3級宮頸癌患者宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽性表達率分別高于無淋巴結轉移、肌層浸潤深度≤1/2、臨床分期為Ⅰ期、組織學分級為G1～2級的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征宮頸癌患者MAGEA3、EZH2 表達情況的比較

2.3 宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 表達的相關性

宮頸癌組織中MAGEA3 的表達與EZH2 的表達呈正相關（r=0.337，P﹤0.05）。

2.4 預后情況的比較

MAGEA3 陽性表達宮頸癌患者的3 年生存率為37.14%（13/35），低于陰性表達患者的80.00%（8/10），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.147，P=0.042）；EZH2 陽性表達宮頸癌患者的3 年生存率為37.84%（14/37），低于陰性表達患者的75.00%（6/8），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.679，P=0.031）。

2.5 宮頸癌患者預后影響因素的多因素分析

將2.2 中差異有統(tǒng)計學意義的淋巴結轉移情況、肌層浸潤深度、組織學分級、臨床分期作為自變量，宮頸癌患者的預后作為因變量，納入多因素Logistic 回歸分析，結果顯示，淋巴結轉移、肌層浸潤深度﹥1/2、臨床分期為ⅡA 期、組織學分級為G3級均是宮頸癌患者預后的獨立危險因素（P﹤0.05）。（表3）

表3 宮頸癌患者預后影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

宮頸癌主要由人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染引起，HPV 是一種可引起組織異常增生的小DNA 病毒，可在多種基因的作用下導致宮頸癌發(fā)生，且該過程漫長、復雜[6-7]。近年來，HPV 疫苗、宮頸癌的診斷已取得較大突破，臨床宮頸癌的治療主要采用手術、化療、放療或系統(tǒng)綜合治療。早期宮頸癌患者的治療效果較好，但對于持續(xù)性、晚期或復發(fā)性宮頸癌的治療效果較差。靶向治療作為一種新興的治療方式，可同時抑制多個癌基因的表達，具有高效、低毒的優(yōu)勢，為免疫治療的發(fā)展開創(chuàng)了一條新道路[8-9]。此外，研發(fā)新的診斷手段、治療策略，對改善宮頸癌患者的預后有重要意義。

張晶晶等[10]對97 例宮頸癌患者的宮頸癌組織進行分析發(fā)現，MAGEA3 表達上調與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。陳茜等[11]通過敲除人宮頸鱗狀細胞癌SiHa 細胞系中EZH2的表達發(fā)現，宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力顯著減弱。本研究結果顯示，宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽性表達率均高于正常宮頸組織和CIN 組織（P﹤0.05），這可能與以下4個方面有關：①EZH2 可促進血管內皮生長因子分泌，從而改變微血管性質和密度，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。②EZH2 可促進腫瘤生長因子Ki-67 的表達，從而促進腫瘤細胞轉移。③MAGEA3 可與p53結合，降低血細胞中p53 水平，從而使宮頸癌細胞更加活躍。④MAGEA3作為凋亡抑制基因，可降低腫瘤細胞凋亡率[12-13]。EZH2 在中樞神經系統(tǒng)中發(fā)揮監(jiān)控發(fā)育調節(jié)因子的作用，糾正其不當表達，可確保神經系統(tǒng)發(fā)育正常。研究認為，EZH2是癌基因，可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14-15]，MAGEA3在多種腫瘤中發(fā)揮癌基因作用，MAGEA3 的表達情況可能影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡等生物學行為[16-17]。

本研究結果顯示，淋巴結轉移、肌層浸潤深度﹥1/2、臨床分期為ⅡA 期、組織學分級為G3級宮頸癌患者宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽性表達率分別高于無淋巴結轉移、肌層浸潤深度≤1/2、臨床分期為Ⅰ期、組織學分級為G1～2級的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。表明MAGEA3、EZH2均與腫瘤細胞的侵襲、轉移有關。研究顯示，腫瘤組織必須具備血管生成的條件，才可成功進行侵襲和轉移[18]。在肺癌、膀胱癌等腫瘤組織中，EZH2陽性表達率越高，腫瘤組織的新生血管網越豐富，說明EZH2過表達與腫瘤細胞的惡性生長和血管密度有關，是一種腫瘤微血管生成刺激因子[19]。

本研究結果中，宮頸癌組織中MAGEA3 的表達與EZH2 的表達呈正相關（r=0.337，P﹤0.05）。表明MAGEA3、EZH2 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了協(xié)同作用，通過共同建立新生血管網，增強了腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，同樣的結論也適用于卵巢癌、胃癌等。李青等[20]研究顯示，沉默MAGEA3基因的表達可抑制宮頸細胞的惡變潛能，其作用可能涉及上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路的激活。成纖維細胞生長因子受體是首個被發(fā)現的促微血管生成因子，研究表明，MAGEA3 參與了成纖維細胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2）信號通路的構成[21]。MAGEA3 可促進腫瘤組織中FGRF2 的表達，使腫瘤微血管生成活躍，并通過調節(jié)纖維連接蛋白，參與腫瘤細胞的侵襲過程。雖然MAGEA3 及FGRF2 均通過影響腫瘤微新生血管生成來促進腫瘤細胞的持續(xù)生長和侵襲轉移，但具體機制仍未明確，仍需進一步探討。

未來的研究可進一步關注MAGEA3、EZH2 表達對淋巴結轉移的預測價值，為宮頸癌的臨床監(jiān)測提供幫助。細胞表面包圍的MAGEA3 抗原，主要經組織相溶性復合體辨別結合，產生復合物后被宮頸癌細胞識別，進而提高腫瘤細胞的增殖能力；EZH2則通過參與DNA 甲基化抑制抑癌基因轉錄，二者在免疫療法治療宮頸癌中應用前景廣闊。本研究結果顯示，MAGEA3、EZH2 陽性表達宮頸癌患者的3 年生存率均低于陰性表達患者，提示MAGEA3、EZH2 檢測可為復發(fā)風險的預測提供有價值的信息。

綜上所述，MAGEA3、EZH2在宮頸癌組織中表達上調，且陽性表達患者預后較差，淋巴結轉移、肌層浸潤深度﹥1/2、臨床分期為ⅡA 期、組織學分級為G3級均是宮頸癌患者預后的獨立危險因素。