AM真菌孢子保藏條件的研究—以異形根孢囊霉為例

黎 雪,胡文濤,況宇瑄,唐 明

(嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院,廣東 廣州 510640)

叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)真菌能夠與72%以上的維管植物共生,形成叢枝菌根[1],包括大多數(shù)林木[2-3]。菌根的形成能夠促進(jìn)林木生長(zhǎng),提高光合能力[4],增強(qiáng)植物對(duì)干旱[5]、鹽堿[6]以及重金屬的耐受性[7]?；贏M真菌與植物生態(tài)系統(tǒng)的良好互作潛力,作為生物肥料可應(yīng)用于土壤改良和生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù),其菌種新型保藏技術(shù)的開(kāi)發(fā)對(duì)于AM真菌應(yīng)用于發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)具有一定意義[8]。新鮮的AM真菌孢子中存在大量的休眠孢子[9],孢子的休眠時(shí)間可能因營(yíng)養(yǎng)、生物和環(huán)境因素的不同持續(xù)數(shù)周甚至數(shù)月[10]。大多數(shù)AM真菌孢子都有后熟過(guò)程[11],低溫處理能促進(jìn)后熟過(guò)程,提高孢子成熟程度,從而提高孢子的萌發(fā)率[12]。

傳統(tǒng)的AM真菌菌種保藏方法有活體寄主體內(nèi)繁殖保藏、根器官體外培養(yǎng)保藏2種[13]。體外保藏是將混有AM真菌孢子的土壤干燥后于-60～-70 ℃冷凍保存,3個(gè)月后AM真菌孢子發(fā)芽率與初始幾乎無(wú)變化[14],而將含有AM真菌繁殖體的土壤冷凍干燥后儲(chǔ)藏8 a,其存活率從90%～100%下降到0%～30%[15]。張淑彬等[16]將摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)的菌種培養(yǎng)物(含孢子的河沙沸石混合物)裝入離心管中,于18～20、4、-20、-80 ℃ 4種溫度下保藏,發(fā)現(xiàn)1～2 a內(nèi)孢子活力下降至原來(lái)的20%以下;超過(guò)2 a孢子生理狀態(tài)急劇降低、失去侵染能力。

AM真菌保藏方法大多為菌種混合物的保藏,鮮有關(guān)于AM真菌純孢子保藏試驗(yàn)的探究。為探尋更簡(jiǎn)單有效、操作性強(qiáng)、花費(fèi)更少的高品質(zhì)AM真菌菌劑保藏方法,本研究在4 ℃和-20 ℃溫度下采用純水和甘油作為保藏介質(zhì),添加植物組培抗菌劑(plant preservation mixture,PPM),測(cè)定保藏2個(gè)月和5個(gè)月后的孢子侵染活性,從而確定Ri純孢子保藏的最佳條件,為AM真菌純孢子的短期、中期保藏提供一定參考依據(jù),對(duì)AM真菌研究和應(yīng)用的菌種純孢子的儲(chǔ)存具有實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

AM真菌異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis,Ri,DAOM197198)購(gòu)于北京市農(nóng)林科學(xué)研究院植物營(yíng)養(yǎng)研究所,經(jīng)玉米(Zeamays)擴(kuò)繁后,采用濕篩傾析法分離得到AM真菌孢子[17]。孢子過(guò)0.45 μm濾布去除雜質(zhì)后,于無(wú)菌水中保存,得到初始新鮮孢子液。

1.2 培養(yǎng)基質(zhì)

河沙(粒徑<1 mm)和蛭石(粒徑<3 mm)按1∶1體積混合,高壓蒸汽(121 ℃、0.1 MPa)滅菌2 h,冷卻、備用。

1.3 供試植物

三葉草(Trifoliumrepens)和玉米種子經(jīng)1.5%次氯酸鈉消毒15 min,無(wú)菌水沖洗3次后,浸泡催芽并播種到培養(yǎng)基質(zhì)中。每天澆水保持濕潤(rùn),1周左右選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米和三葉草分別移栽到裝有2 kg培養(yǎng)基質(zhì)的塑料盆中。盆大小為10 cm×10 cm×8 cm,玉米每盆種植1株,三葉草每盆種植3～5株。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

共設(shè)置4個(gè)因素:1)保藏時(shí)間(2個(gè)月,5個(gè)月);2)保藏介質(zhì)(甘油,純水);3)保藏溫度(4 ℃,-20 ℃);4)保藏介質(zhì)中添加或不添加植物組培抗菌劑(PPM)。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。甘油、純水于滅菌鍋中121 ℃、0.1 MPa滅菌15 min,PPM過(guò)濾滅菌。初始孢子液(0.5 mL,約有150個(gè)孢子)和保藏介質(zhì)(1.5 mL)加入2 mL無(wú)菌離心管中混勻后置于4 ℃和-20 ℃保藏。每種條件下保藏10管,共80管。

傳統(tǒng)的甘油保藏法保藏菌種在-70 ℃可以保藏3～5 a,在-20 ℃保藏時(shí)間更短,約1 a。因此本研究以1 a作為保藏的最終期限,2個(gè)月為短期,5個(gè)月為中期,12個(gè)月為長(zhǎng)期。

1.5 孢子侵染活性測(cè)定

首先,將0.5 mL初始孢子懸浮液接種到玉米和三葉草的根際,各接種5盆(作為原始孢子侵染活性的參照);然后,2個(gè)月和5個(gè)月后將不同保藏條件下的孢子液接種到玉米和三葉草根際;45 d后收獲植物根系,采用[18]改進(jìn)的臺(tái)盼藍(lán)染色法染色,使用網(wǎng)格線交叉法[19]測(cè)定根系侵染率,采用Hu等[20]開(kāi)發(fā)的VBA-AMF軟件統(tǒng)計(jì)原始數(shù)據(jù)。玉米和三葉草培育期間,每周澆2次原濃度50% Hoagland低P(30 μmol·L-1)溶液(50 mL·盆-1),培養(yǎng)溫度25 ℃,濕度60%～85%,白熾燈光照2 000 lx,光周期為16 h。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2019數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。使用SPSS 22.0(Armonk,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析,所有數(shù)據(jù)采用HSD法在顯著水平為5%條件下進(jìn)行比較,當(dāng)P<0.05時(shí),差異顯著。采用GraphPad Prism9.0制圖(GraphPad,USA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 保藏條件對(duì)Ri孢子侵染玉米的影響

2.1.1 短期保藏Ri孢子對(duì)侵染玉米的影響 保藏溫度相同時(shí),Ri孢子在甘油和純水中的活性無(wú)顯著差異。保藏介質(zhì)相同時(shí),Ri孢子在4 ℃和-20 ℃下活性無(wú)顯著差異。保藏溫度為4 ℃時(shí),Ri孢子在甘油和純水介質(zhì)保藏2個(gè)月對(duì)玉米根系侵染率分別為26.33%和26.91%(圖1A);保藏溫度為-20 ℃時(shí),Ri孢子在甘油和純水介質(zhì)保藏2個(gè)月對(duì)玉米根系侵染率分別為21.91%和25.20%(圖1B)。

CK.原始孢子液;G.甘油;PW.純水;PPM.植物組培抗菌劑。應(yīng)用HSD法檢驗(yàn)各處理間差異顯著性,柱子上不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。圖1 異形根孢囊霉孢子保藏2個(gè)月后玉米侵染率Fig.1 Clononization of Zea mays roots of R.irregularis spores at different temperatures for 2 months

PPM的添加能夠提高甘油和純水中保藏的Ri孢子活性,使甘油中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃時(shí)對(duì)玉米根系侵染率分別提高8.71%和12.81%;使純水中保藏的Ri孢子在-20 ℃時(shí)對(duì)玉米根系侵染率提高8.24%(圖1B)。

2.1.2 中期保藏Ri孢子對(duì)侵染玉米的影響 保藏溫度相同時(shí),Ri孢子在甘油中的活性顯著低于在純水中的活性(F4 ℃=118.461,P=0.000;F-20 ℃=500.581,P=0.000)。保藏介質(zhì)為甘油時(shí),Ri孢子活性不受保藏溫度影響;保藏介質(zhì)為純水時(shí),Ri孢子在4 ℃下活性顯著高于-20 ℃下活性(F=57.733,P=0.002)。保藏溫度為4 ℃時(shí),Ri孢子在甘油和純水介質(zhì)中保藏5個(gè)月對(duì)玉米根系侵染率分別為3.55%和52.92%(圖2A);保藏溫度為-20 ℃時(shí),Ri孢子在甘油和純水介質(zhì)中保藏5個(gè)月對(duì)玉米根系侵染率分別為3.56%和18.40%(圖2B)。

圖2 異形根孢囊霉孢子保藏5個(gè)月后玉米侵染率Fig.2 Clononization of Z.mays roots of R.irregularis spores at different temperatures for 5 months

PPM的添加能夠提高甘油中保藏的Ri孢子活性,而降低純水中保藏的Ri孢子活性,使甘油中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃時(shí)對(duì)玉米根系侵染率分別提高13.46%和5.71%;使純水中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃時(shí)對(duì)玉米根系侵染率分別降低50.4%和1.52%。

不同保藏條件下的Ri孢子對(duì)玉米根系的侵染情況見(jiàn)圖3。

a～d.初始Ri孢子侵染玉米根系圖;e～h.分別為4 ℃條件下甘油、甘油+PPM、純水、純水+PPM保藏2個(gè)月后Ri孢子侵染玉米根系圖;i～l.分別為-20 ℃條件下甘油、甘油+PPM、純水、純水+PMM保藏2個(gè)月后Ri孢子侵染玉米根系圖;m～p.分別為4 ℃條件下甘油、甘油+PPM、純水、純水+PPM保藏5個(gè)月后Ri孢子侵染玉米根系圖;q～t.別為-20 ℃條件下甘油、甘油+PPM、純水、純水+PPM保藏5個(gè)月后Ri孢子侵染玉米根系圖;H.菌絲;V.泡囊;A.叢枝。圖中q標(biāo)尺為200 μm,其余標(biāo)尺為500 μm。圖3 不同保藏條件下玉米根系侵染Fig.3 Picture of colonization for Zea mays roots at different preservation conditions

2.2 保藏條件對(duì)Ri孢子侵染三葉草的影響

2.2.1 短期保藏Ri孢子對(duì)侵染三葉草的影響 保藏溫度相同時(shí),Ri孢子在甘油和純水中的活性無(wú)顯著差異。保藏介質(zhì)相同時(shí),Ri孢子在4 ℃和-20 ℃下活性無(wú)顯著差異。保藏溫度為4 ℃時(shí),Ri孢子在甘油和純水介質(zhì)保藏2個(gè)月對(duì)三葉草根系的侵染率分別為21%和19.20%(圖4A);保藏溫度為-20 ℃時(shí),Ri孢子在甘油和純水介質(zhì)保藏2個(gè)月對(duì)三葉草根系的侵染率分別為21.44%和19.57%(圖4B)。

圖4 異形根孢囊霉孢子保藏2個(gè)月后三葉草侵染率Fig.4 Clononization of Trifolium repens roots of R.irregularis spores at different temperatures for 2 months

PPM的添加能夠提高甘油和純水中保藏的Ri孢子活性,使甘油中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃時(shí)對(duì)三葉草根系侵染率分別提高15.75%和27.99%;使純水中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃時(shí)對(duì)三葉草根系侵染率分別提高12.77%和16.77%。

2.2.2 中期保藏Ri孢子對(duì)侵染三葉草的影響 保藏溫度相同時(shí),Ri孢子在甘油中的活性低于在純水中的活性(F4 ℃=410.019,P=0.000;F-20 ℃=1.047,P=0.364)。保藏介質(zhì)為甘油時(shí),Ri孢子活性不受保藏溫度影響;保藏介質(zhì)為純水時(shí),Ri孢子在4 ℃下活性顯著高于-20 ℃下的活性(F=98.052,P=0.001)。保藏溫度為4 ℃時(shí),Ri孢子在甘油和純水介質(zhì)保藏5個(gè)月對(duì)三葉草根系侵染率分別為12.59%和71.76%(圖5A);保藏溫度為-20 ℃時(shí),Ri孢子在甘油和純水介質(zhì)保藏5個(gè)后對(duì)三葉草根系侵染率分別為12.51%和18.19%(圖5B)。

圖5 異形根孢囊霉孢子保藏5個(gè)月后三葉草侵染率Fig.5 Clononization of T.repens roots of R.irregularis spores at different temperatures for 5 months

PPM的添加能夠提高甘油中保藏的Ri孢子活性,而降低純水中保藏的Ri孢子活性,使甘油中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃時(shí)對(duì)三葉草根系侵染率分別提高10.55%和2.24%;使純水中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃時(shí)對(duì)三葉草根系侵染率分別降低58.45%和5.11%。

不同保藏條件下的Ri孢子對(duì)三葉草根系的侵染情況見(jiàn)圖6。

a～d.初始Ri孢子侵染三葉草根系圖;e～h.分別為4 ℃條件下甘油、甘油+PPM、純水、純水+PPM保藏2個(gè)月后Ri孢子侵染三葉草根系圖;i～l.分別為-20 ℃條件下甘油、甘油+PPM、純水、純水+PMM保藏2個(gè)月后Ri孢子侵染三葉草根系圖;m～p.分別為4 ℃條件下甘油、甘油+PPM、純水、純水+PPM保藏5個(gè)月后Ri孢子侵染三葉草根系圖;q～t.分別為-20 ℃條件下甘油、甘油+PPM、純水、純水+PPM保藏5個(gè)月后Ri孢子侵染三葉草根系圖;H.菌絲;V.泡囊;A.叢枝。圖中C標(biāo)尺為100 μm,其余標(biāo)尺長(zhǎng)度為500 μm。圖6 不同保藏條件下三葉草根系侵染Fig.6 Picture of colonization for Trifolium repens roots at different preservation conditions

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

研究結(jié)果表明,短期保藏Ri孢子時(shí),在純水和甘油2種介質(zhì)以及在4 ℃和-20 ℃中的孢子活性無(wú)顯著差異;添加PPM能夠提高孢子在純水和甘油中的活性。中期保藏Ri孢子時(shí),純水保藏活性高于甘油;4 ℃低溫保藏顯著提高孢子侵染活性;添加PPM能夠提高孢子在甘油中保藏的活性,而降低在純水中保藏的活性。因此,對(duì)異形根孢囊霉短期保藏(2個(gè)月)選擇純水+PPM作為保藏介質(zhì)于4 ℃保藏;中期保藏(5個(gè)月)選擇純水作為保藏介質(zhì)于4 ℃保藏。

3.2 討論

3.2.1 Ri孢子對(duì)不同宿主的侵染情況 AM真菌對(duì)宿主植物的親和性會(huì)因不同宿主而異[21],三葉草和玉米根系接種AM真菌后,三葉草根系侵染率高于玉米根系侵染率[22-23]。AM真菌孢子侵染宿主時(shí)會(huì)受到溫度、光照、濕度[23]以及土壤營(yíng)養(yǎng)狀況[24]]等因素的影響。本研究除宿主種類不同外,土壤、真菌、生長(zhǎng)環(huán)境條件均保持一致,初始新鮮Ri孢子對(duì)三葉草根系的侵染率為66.68%,顯著高于玉米根系侵染率41.85%(F=22.360,P=0.009),這說(shuō)明宿主是影響侵染率的關(guān)鍵因素。Ri對(duì)三葉草的親和性高于玉米,可能與兩者的根系分泌物[25,26]和須根豐富度有關(guān)[23]。

3.2.2 保藏時(shí)間、溫度和介質(zhì)對(duì)Ri孢子侵染活力的影響 長(zhǎng)時(shí)間干燥泥沙介質(zhì)保藏孢子會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)孢子干燥失水,難以維持正常生理狀態(tài),最終失去侵染能力,由此可見(jiàn)孢子內(nèi)部充足的水分是維持其正常生理狀態(tài)的必要條件[16]。本研究選擇30%甘油及純水作為保藏介質(zhì),能夠保證孢子長(zhǎng)時(shí)間保藏后不會(huì)因干燥失水而失去侵染能力。

甘油作為一種冷凍保護(hù)劑,與水結(jié)合減少冰晶的形成和降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液電解質(zhì)的濃度,可使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷[27],廣泛用于真菌保藏[28]。純水在-20 ℃會(huì)結(jié)冰從而對(duì)其中保藏的孢子造成不利影響[29],理論上,純水中保藏的孢子活性應(yīng)該低于甘油中保藏孢子活性,而本研究結(jié)果是2種介質(zhì)中孢子活性無(wú)差異,這可能與Ri孢子本身作為厚垣孢子含有豐富的脂質(zhì)有關(guān)[30],能夠有效幫助孢子抵御-80 ℃低溫脅迫[31]。因此,2個(gè)月時(shí)在-20 ℃、純水保藏的Ri孢子不會(huì)受到凍害,從而保持與4 ℃低溫下保藏的Ri孢子活性同步。

Ri孢子保藏5個(gè)月時(shí),在純水中保藏活性高于在甘油中的保藏活性。離體下的AM真菌孢子萌發(fā)會(huì)受到pH、溫度、濕度、儲(chǔ)存時(shí)間及抑制物質(zhì)的影響[25],甘油本身存在一定的滲透壓,會(huì)影響水、營(yíng)養(yǎng)物等進(jìn)入休眠孢子,不利于休眠孢子萌發(fā);而純水不存在影響孢子萌發(fā)的滲透壓,休眠孢子在適宜條件下打破休眠即可正常萌發(fā),因而純水中保藏的孢子活性高于甘油中。另外,Ri孢子可能存在后熟作用,純水中低溫保藏5個(gè)月,一部分Ri孢子完成后熟過(guò)程,從而提高Ri孢子的侵染活性[12]。

本研究發(fā)現(xiàn),Ri孢子在4 ℃、純水介質(zhì)保藏5個(gè)月會(huì)顯著提高侵染活性,是因?yàn)樵? ℃低溫長(zhǎng)期保藏后大量休眠孢子打破休眠發(fā)揮其侵染作用,另外也可能與Ri孢子完成后熟過(guò)程有關(guān)[12]。新鮮孢子發(fā)芽緩慢,將其于6 ℃下貯藏?cái)?shù)周會(huì)大大提高孢子萌發(fā)率[32],董昌金等[25]將富含AM真菌孢子的土壤放在4 ℃冰箱1～2個(gè)月,孢子萌發(fā)率提高28%～50%,且低溫貯藏時(shí)間越久,孢子萌發(fā)率越高。邵菊芳等[33]對(duì)球狀巨孢囊霉(Gigasporamargarita)、摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)的孢子在4 ℃下貯藏10～50 d,顯著提高了孢子萌發(fā)率,說(shuō)明低溫處理和長(zhǎng)期儲(chǔ)藏是打破休眠的關(guān)鍵步驟。

3.2.3 PPM的添加對(duì)Ri孢子侵染活力的影響 本研究發(fā)現(xiàn),PPM的添加在2個(gè)月內(nèi)能夠一定程度維持甘油和純水中保藏的孢子活性,在2～5個(gè)月能夠一定程度上維持甘油中保藏的孢子活性,而降低純水中保藏的孢子活性。PPM能夠維持孢子活性是由于其具有抗菌的特點(diǎn),PPM能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分肽聚糖,而對(duì)AM真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)沒(méi)有作用,且AM真菌為厚垣孢子,PPM很難穿過(guò)其進(jìn)入孢子內(nèi)部對(duì)其造成不利影響[31]。Ri孢子在含有PPM的純水保藏5個(gè)月活性反而降低,造成該現(xiàn)象的原因可能是孢子外源性休眠[34]。經(jīng)過(guò)5個(gè)月保藏后,具有抗菌作用的PPM成為休眠孢子萌發(fā)環(huán)境中的一種抑制劑,一部分休眠孢子感知到對(duì)自身有害的抗菌劑存在迫其延遲萌發(fā)[35]。