茶葉中霉菌毒素危害與質(zhì)量控制研究進(jìn)展

繆伊雯，白 菲，童華榮*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

茶（Camellia sinensisL.）屬山茶科山茶屬，原產(chǎn)于中國(guó)的常綠灌木，是世界上最受歡迎的無(wú)酒精飲料之一[1-3]。中國(guó)已有千年的飲茶史，2020年我國(guó)茶葉產(chǎn)量高達(dá)297萬(wàn) t[4-5]。茶葉按照加工工藝分為六大類(lèi)，其中綠茶加工工藝較簡(jiǎn)單，有效保留了其鮮葉所含的天然物質(zhì)，在中、日、韓等國(guó)備受歡迎；白茶、黃茶和烏龍茶是中國(guó)特有茶類(lèi)，主要在中國(guó)產(chǎn)銷(xiāo)；紅茶是一種酶促發(fā)酵的全發(fā)酵茶，在亞洲和歐洲備受歡迎，在全世界銷(xiāo)量位居第一；黑茶則是一種由酶、微生物和濕熱加工條件三者綜合作用的后發(fā)酵茶，主產(chǎn)于中國(guó)西南部地區(qū)[6]。茶葉因具有多種保健功能而深受大眾的喜愛(ài)，然而有毒化學(xué)物質(zhì)污染可能會(huì)削弱茶葉的健康作用[2,7]。如今，茶葉質(zhì)量安全已日益引起關(guān)注，其中與霉菌毒素相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是當(dāng)前學(xué)界與大眾所關(guān)注的熱點(diǎn)[8]。茶葉在種采、加工和流通等環(huán)節(jié)中極易受到霉菌侵染，其中產(chǎn)毒菌在適宜的條件下會(huì)產(chǎn)生霉菌毒素，人類(lèi)通過(guò)飲用茶湯可能會(huì)存在霉菌毒素膳食暴露的風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。

霉菌毒素主要是由曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、鏈格孢屬（Alternaria）和鐮刀菌屬（Fusarium）等特定霉菌在適宜的產(chǎn)毒條件下產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，經(jīng)口、皮膚或呼吸道等途徑吸收時(shí)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體機(jī)能下降、生病或死亡，是世界范圍內(nèi)食品和飼料中最常見(jiàn)的污染物，如黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）曾被美國(guó)食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）評(píng)價(jià)為食品中不可避免的污染物[11-12]。

如今，發(fā)達(dá)國(guó)家相繼要求對(duì)茶葉進(jìn)行微生物項(xiàng)目檢驗(yàn)，這無(wú)形中增加了我國(guó)茶葉出口貿(mào)易的技術(shù)性貿(mào)易壁壘，使茶葉產(chǎn)業(yè)陷入十分被動(dòng)的局面[13]。中國(guó)食品土畜進(jìn)出口商會(huì)所編寫(xiě)的《出口商品技術(shù)指南-輸歐茶葉》也曾指出，茶企有必要關(guān)注茶葉中存在的霉菌毒素風(fēng)險(xiǎn)，以應(yīng)對(duì)發(fā)達(dá)國(guó)家的技術(shù)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)和合格評(píng)定程序的復(fù)雜多變[14]。因此，世界各國(guó)衛(wèi)生部門(mén)加強(qiáng)對(duì)霉菌毒素的監(jiān)督是大勢(shì)所趨，而茶葉中霉菌毒素的控制、分析檢測(cè)仍然是目前學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。本文對(duì)茶葉中霉菌毒素的來(lái)源、種類(lèi)及危害進(jìn)行了簡(jiǎn)述，對(duì)茶葉中霉菌毒素污染現(xiàn)狀進(jìn)行了總結(jié)，探討了相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)茶葉中霉菌毒素的防控措施進(jìn)行了展望，旨在為茶葉質(zhì)量控制提供參考。

1 茶葉中霉菌毒素的來(lái)源

目前，全球范圍內(nèi)被認(rèn)定的霉菌毒素已超過(guò)400 種[15]。茶葉加工的周期長(zhǎng)短不一且步驟多樣導(dǎo)致其在任何階段可發(fā)生霉菌侵染，如種采、加工與流通等環(huán)節(jié)[2]。如圖1所示，霉菌侵染的影響因素和發(fā)生污染的概率存在差異，其中茶葉的特性和貯藏條件又會(huì)進(jìn)一步影響霉菌的產(chǎn)毒能力，而茶葉中霉菌毒素殘留會(huì)影響茶葉的品質(zhì)和貿(mào)易，并對(duì)人類(lèi)構(gòu)成潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。因此，掌握霉菌侵染茶葉的途徑可有效改善茶葉中霉菌毒素污染[16-17]。

圖1 中國(guó)6 種典型茶類(lèi)的生產(chǎn)流程、霉菌侵染的風(fēng)險(xiǎn)程度與影響因素Fig.1 Production process of six kinds of typical Chinese tea, degree of risk of mold contamination, and its influential factors

1.1 種采環(huán)節(jié)

氣溫20～30 ℃、土溫25～30 ℃、酸性土壤且最大持水量80%～90%的環(huán)境有利于茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育，但溫暖濕潤(rùn)的環(huán)境也為霉菌定植和產(chǎn)毒提供了最佳條件[6]。當(dāng)前，茶葉中常見(jiàn)的霉菌包括曲霉屬、青霉屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬、散囊菌屬（Eurotiumsp.）和根霉屬（Rhizopusspp.）等[2]。青霉屬、鐮刀菌屬是田間霉菌，可能存在于茶樹(shù)種植區(qū)的空氣、土壤、水源和肥料中，并在茶樹(shù)的生長(zhǎng)和采收過(guò)程中附著于鮮葉上并帶入后續(xù)加工中。此外，采收環(huán)節(jié)中工作人員與容器的衛(wèi)生情況則會(huì)進(jìn)一步影響霉菌污染茶葉的程度[2,6]。

目前，在世界上主要的茶葉生產(chǎn)國(guó)中，中國(guó)和印度地處亞熱帶氣候，這也直接導(dǎo)致中印兩國(guó)是受霉菌毒素影響最嚴(yán)重的國(guó)家[2]。在針對(duì)中國(guó)的六大茶類(lèi)的霉菌毒素檢測(cè)中均發(fā)現(xiàn)了不同程度的霉菌毒素感染情況，其中，產(chǎn)自拉脫維亞的綠茶和黑茶中檢測(cè)出的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和T-2毒素（T-2 toxin，T-2）通常是由田間霉菌入侵而產(chǎn)生的[17-18]。雖然曲霉屬歸屬于倉(cāng)貯性霉菌，但在日本茶園的27 份酸性土壤中也分離出57 株黃曲霉屬真菌[19]，王鷺等[20]則在日本綠茶中檢出黃曲霉毒素B2（aflatoxins B2，AFB2）（4.40 μg/kg），這表明在茶葉的生產(chǎn)實(shí)踐中，茶葉所受到的侵染菌和產(chǎn)毒菌是多樣的，且存在污染擴(kuò)散的情況。

1.2 加工環(huán)節(jié)

茶葉鮮葉的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為75%，蛋白含量較低，含有可溶性糖，加工成干毛茶后水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至2%～10%不等，可被多種來(lái)自環(huán)境或自帶的潛在產(chǎn)毒霉菌侵染[21-22]。Dutta等[23]從茶廠的空氣、葉際和土壤樣本中分離出34 種霉菌，包括產(chǎn)生霉菌毒素的黑曲霉（A.niger）、黃曲霉（A.flavus）、煙曲霉（A.fumigatus）和乳酸鐮刀菌（Fusarium lactis）。此外，霉菌的繁殖能力較強(qiáng)，所產(chǎn)的霉菌孢子可以通過(guò)原料、空氣、生產(chǎn)用水、工具等媒介侵入茶樣并在條件適宜時(shí)萌發(fā)繁殖，對(duì)茶樣造成進(jìn)一步污染[24]。

不同的茶類(lèi)具有不同的加工工藝，造成各大茶類(lèi)霉菌侵染的影響因素和發(fā)生污染的概率存在差異[2,24]。綠茶被認(rèn)為是加工過(guò)程中受污染風(fēng)險(xiǎn)最小的茶類(lèi)，這主要與綠茶加工步驟簡(jiǎn)單、周期短及干茶水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)低（4.64%～9.73%）密切相關(guān)[2,25]，但目前也有研究報(bào)道了綠茶中感染AFB2、黃曲霉毒素G1（aflatoxins G1，AFG1）、互隔交鏈孢酚（alternariol，AOH）、恩鐮孢菌素B（enniatin B，ENN B）、騰毒素（tentoxin，TENT）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等毒素的案例。其中，AOH（1.70～5.90 μg/kg）、TENT（4.60 μg/kg）和HT-2毒素（HT-2 toxin，HT-2）（5.58 μg/kg）僅在綠茶樣品中有報(bào)道[16-17]，赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）在綠茶的袋泡茶（0.01～19.96 μg/kg）、茶湯（0.10～0.80 ng/L）和散茶（0.54～20.35 μg/kg）中均有檢出[26-27]。此外，研究人員認(rèn)為綠茶受到霉菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)較低，與其富含的多酚類(lèi)化合物具有一定的抗菌作用密切相關(guān)[6,24]。

同樣，作為加工步驟較少的白茶，也被認(rèn)為是受污染較少的茶類(lèi)，截至目前僅有2 例報(bào)道，在西班牙樣品中檢出了OTA、AFs、ZEN、T-2、DON和桔青霉素（citrinin，CIT），其中DON高達(dá)259.10 μg/kg[28]。在中國(guó)的13 個(gè)白茶樣品中檢出的棒曲霉素（patulin，PAT）含量最高可達(dá)10.90 μg/kg，而此前針對(duì)PAT的關(guān)注更多是在水果及其制品中[29]，這表明隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多研究人員開(kāi)始重視在其他食品類(lèi)別中存在的霉菌毒素在茶葉中的檢出情況。黃茶需要在高濕高溫的條件下進(jìn)行悶黃，可為霉菌的繁殖及產(chǎn)毒提供條件[30]，針對(duì)黃茶的研究?jī)H在Li Hai等[29]報(bào)道的7 份黃茶樣品中檢出PAT（＜2.90 μg/kg），究其原因可能是黃茶本身的產(chǎn)銷(xiāo)量較少，在全球的消費(fèi)群體數(shù)量少于其他茶類(lèi)，但隨著人類(lèi)對(duì)健康的關(guān)注程度不斷提高，當(dāng)前對(duì)于茶葉的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估正在逐步擴(kuò)大試驗(yàn)茶樣的范圍。青茶在工序上采用的毛火溫度高、烘焙時(shí)間長(zhǎng)，所制成的茶水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%～7%，因此，青茶受到的霉菌侵染較少，可能是因?yàn)樵诖诉^(guò)程中不耐高溫的霉菌毒素會(huì)發(fā)生降解，從而降低霉菌毒素的含量[6]。至今，僅在中國(guó)所產(chǎn)銷(xiāo)的青茶樣品中檢出黃曲霉毒素B1（aflatoxins B1，AFB1）（34 μg/kg）[31]、AFB2（5.76 μg/kg）[20]和PAT（＜21.40 μg/kg）[29]。

紅茶作為一種全發(fā)酵茶，其在揉捻時(shí)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外溢增多，有利于霉菌菌絲和孢子大量繁殖，同時(shí)，霉菌代謝產(chǎn)生蛋白酶和氨基酸脫羧酶，分解后會(huì)產(chǎn)生臭味，影響紅茶的品質(zhì)[32]。和青茶一樣，高溫干燥可以有效降低紅茶中部分不耐高溫的霉菌毒素的含量。

AFs[17,20,27,33]和OTA[17,26-27,31,34]是在紅茶中檢出率最高的2 類(lèi)霉菌毒素，這主要是因?yàn)锳Fs和OTA的熔點(diǎn)較高，分別為269 ℃和169 ℃，且針對(duì)AFs和OTA的檢測(cè)技術(shù)最為成熟，研究者關(guān)注度較高[24]。伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn) B1）是紅茶中檢出的含量最高的霉菌毒素，可達(dá)280 μg/kg，這可能與FB1熱穩(wěn)定性強(qiáng)，且具有水溶性有關(guān)[35]。

以微生物后發(fā)酵為主的黑茶是如今受污染和研究最多的一類(lèi)茶葉[36]。黑茶的渥堆發(fā)酵主要是在炎熱潮濕的復(fù)雜環(huán)境下進(jìn)行，來(lái)自原料茶、環(huán)境和人員等媒介的霉菌或霉菌孢子在渥堆發(fā)酵階段侵染茶樣，主要包括曲霉屬、散囊菌屬和青霉屬[37-38]。此外，普洱茶在發(fā)酵過(guò)程中的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%～30%）、pH值（5～6）、渥堆中心溫度（＜50 ℃）等條件有利于霉菌繁殖并產(chǎn)毒[39]。目前，世界各國(guó)針對(duì)黑茶中霉菌毒素的研究較多。Haas等[38]在36 份普洱茶樣品中檢測(cè)到根霉、毛霉和青霉。在茯磚茶生產(chǎn)過(guò)程中，散囊菌屬中的冠突散囊菌是“發(fā)花”和“菌花香”的來(lái)源，而青霉和黑曲霉則屬于污染菌[40]。相反，曲霉屬是六堡茶渥堆階段的優(yōu)勢(shì)菌[35,39]，胡沛然[41]在六堡茶中分離出傘狀毛霉菌（Lichtheimia corymbifera）、塔賓曲霉（A.tubingensis）和煙曲霉（A.fumigatus）。與紅茶類(lèi)似，AFs和OTA是研究和檢出率最高的兩類(lèi)霉菌毒素，其中黃曲霉毒素G2（aflatoxins G2，AFG2）含量可達(dá)59 600 μg/kg，是綠茶中的784 倍[42-43]。因此，相較于其他茶類(lèi)，黑茶具有更加多元化的侵染菌與產(chǎn)毒菌和多樣化的霉菌毒素。

此外，成茶所選擇的外包裝方式亦能影響霉菌侵染程度[44]。采用天然材料（木質(zhì)、竹質(zhì)等）、紙材料類(lèi)（紙袋、紙盒、棉紙等）和陶瓷材料類(lèi)（土陶、紫砂等）等密閉性較差、易受潮的材料可能會(huì)在包裝破損或不適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存方式下發(fā)生霉菌侵染并產(chǎn)毒，而金屬包裝（鐵罐、鋁罐、錫罐、不銹鋼罐等）、塑料包裝（聚乙烯、聚丙稀、聚氯乙烯等）和復(fù)合材料包裝（紙塑復(fù)合包裝盒、鋁塑復(fù)合真空包裝袋等）等具有較好的阻氣性、防潮性，采用此類(lèi)包裝材料加之真空或充氮技術(shù)包裝茶葉則能在一定程度上降低茶葉霉變的概率[45]。

1.3 流通環(huán)節(jié)

由于茶葉具有多孔性結(jié)構(gòu)，若在流通環(huán)節(jié)因包裝破損或儲(chǔ)存條件不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致茶葉的水分活度升高，加大了茶葉受霉菌侵染并產(chǎn)毒的可能性[46-47]。其中，運(yùn)輸工具的潔凈程度、貯藏時(shí)間的長(zhǎng)短和環(huán)境條件是最重要的影響因素。當(dāng)前，對(duì)茶葉中霉菌毒素的研究主要是針對(duì)市售樣品，例如，在奧地利購(gòu)買(mǎi)的36 份市售普洱茶樣品中，有11%的樣品含有OTA，含量最高可達(dá)94.70 μg/kg[38]。此外，也有部分學(xué)者針對(duì)貯藏時(shí)間與條件展開(kāi)研究，在對(duì)不同年份六堡茶的研究中發(fā)現(xiàn)，CIT與貯藏時(shí)間相關(guān)，其陳化過(guò)程儲(chǔ)存溫度在25～42 ℃之間，這有利于曲霉和青霉的繁殖和產(chǎn)生CIT，而貯藏過(guò)程中的氣候條件和水分活動(dòng)是影響霉菌定植和CIT積累的關(guān)鍵因素[48]。

2 茶葉中常見(jiàn)的霉菌毒素及危害

由于茶葉加工工藝不規(guī)范或是在環(huán)境中感染霉菌，特別是未知霉菌產(chǎn)生的次生代謝物可能對(duì)茶葉的飲用安全構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)[49]。霉菌毒素毒性譜較廣，對(duì)人體具有致神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂及肝腎損傷等危害。同時(shí)，如AFs、OTA、CIT等霉菌毒素已被證實(shí)具有致癌、致畸和致突變作用[46]。霉菌毒素的中毒癥狀及嚴(yán)重程度取決于霉菌毒素的類(lèi)型、暴露的數(shù)量和持續(xù)時(shí)間、暴露個(gè)體的年齡、健康狀況和性別及與其他物質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)[16,46]。另外，豐富的品類(lèi)和多樣的飲茶方式，導(dǎo)致世界各地對(duì)不同茶類(lèi)的飲用習(xí)慣不同，例如，中國(guó)以熱飲茶為主，而美國(guó)則喜歡冰茶[50]；綠茶的沖泡時(shí)間較短，水溫較低[51]，而黑茶除清飲外[2]，在中國(guó)少數(shù)民族地區(qū)的酥油茶[52]和咸奶茶[53]則會(huì)進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間熬煮。因此，生茶的污染程度、沖泡溫度的高低、沖泡時(shí)間的長(zhǎng)短、溶劑性質(zhì)、霉菌毒素的熱穩(wěn)定性及從基質(zhì)轉(zhuǎn)移到茶湯中的能力都會(huì)影響茶葉中霉菌毒素的浸出率，從而影響飲茶者的霉菌毒素膳食暴露量和健康情況[54]。目前，茶葉中常見(jiàn)的霉菌毒素主要包括AFs、CIT、OTA、ZEN等共31 種[2,16-17,24,48]。

2.1 黃曲霉毒素

AFs是一類(lèi)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似的二氫呋喃雜氧萘的衍生物，因其在食品基質(zhì)中的強(qiáng)致癌性成為了茶葉中首先被追蹤的候選物質(zhì)[2]。AFs急性中毒導(dǎo)致死亡，慢性中毒導(dǎo)致癌癥、免疫抑制等[46]。AFs能夠與DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合，已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為1類(lèi)致癌物[16]。通過(guò)飲食攝入AFs被認(rèn)為是引發(fā)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的重要危險(xiǎn)因素，特別是乙型肝炎患者[46]。據(jù)報(bào)道，AFs從茶葉遷移到飲料中的比例約為30%～40%[16]。但AFs具有很高的脂溶性，難溶于水，耐熱，茶葉受到AFs污染后只有少量會(huì)在沖泡過(guò)程中進(jìn)入茶湯[24]。

2.2 赭曲霉毒素A

OTA是繼AFs之后被人們所關(guān)注到的一類(lèi)具有香豆素和苯丙氨酸結(jié)構(gòu)的類(lèi)似物，OTA是最強(qiáng)的腎臟致癌物，已被IARC認(rèn)定為2B類(lèi)致癌物，在人體內(nèi)的半衰期最長(zhǎng)[55]。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明OTA還具有肝毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性、致畸性，具有物種和性別敏感性差異的特點(diǎn)[46]。OTA以多種方式干擾細(xì)胞生理活動(dòng)。OTA微溶于水，在茶湯中的轉(zhuǎn)移率比AFs高，膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)更高，且其產(chǎn)毒菌曲霉屬和青霉屬均為茶葉加工和倉(cāng)儲(chǔ)過(guò)程中的常見(jiàn)微生物[55]。此外，在沖泡過(guò)程中茶葉與水接觸時(shí)間越長(zhǎng)，茶湯中浸出的OTA含量越高[34]。

2.3 桔青霉素

CIT為聚酮類(lèi)化合物，攝入被CIT污染的產(chǎn)品對(duì)人和動(dòng)物具有腎毒性、肝毒性、免疫抑制和致癌作用。腎臟被認(rèn)為是CIT的關(guān)鍵靶器官，且CIT與OTA的協(xié)同作用和腎毒性已有報(bào)道[56]。據(jù)IARC報(bào)道，暫無(wú)科學(xué)證據(jù)表明CIT具有致癌性，被列為第3類(lèi)致癌物。然而，值得引起關(guān)注的是在茶葉中CIT與OTA共存的比例較高，且CIT具有一定的水溶性[48]。此外，細(xì)胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（adenosine 5’-triphosphate，ATP）含量的降低已被發(fā)現(xiàn)與CIT有關(guān)[56]。目前，白茶和黑茶中已有相關(guān)檢出的報(bào)道[28,48]。

2.4 玉米赤霉烯酮

ZEN是一類(lèi)2,4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯類(lèi)化合物，具有免疫毒性、肝毒性等。它與人類(lèi)卵巢產(chǎn)生的主要激素雌二醇非常相似，以至于它可以與哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞中的雌激素受體結(jié)合，具有很強(qiáng)的雌激素樣作用和合成代謝作用。ZEN及其代謝物隨食物攝入后會(huì)被人體吸收，可出現(xiàn)在血液、尿液和母乳等生物體液中[46]。人體推薦的玉米赤霉烯酮安全攝入量為每天0.05 g/kgmb[24]。目前，ZEN在中國(guó)紅茶[8]、摩洛哥綠茶[16]、拉脫維亞黑茶[17]和西班牙白茶[30]的研究中均有報(bào)道。

2.5 伏馬菌素B1

FB1是一種雙酯化合物，主要由丙三羧酸和不同的多氫醇組成。與OTA同屬于2B類(lèi)致癌物，F(xiàn)B1可損傷肝腎功能，在中國(guó)和南非部分地區(qū)伏馬毒素污染與食道癌發(fā)病率呈正相關(guān)[46]。與其他霉菌毒素不同，F(xiàn)B1極易溶于水，這就可能導(dǎo)致FB1在實(shí)際沖泡茶湯時(shí)轉(zhuǎn)移率高等問(wèn)題，因此需要加大對(duì)茶葉中FB1的關(guān)注[24,35]。目前，F(xiàn)B1在綠茶、紅茶和黑茶中均有報(bào)道[20,35,57]。

2.6 其他毒素

除上述霉菌毒素外，柄曲霉素（sterigmatocystin，STC）[8]、TENT[16]和HT-2[17]等霉菌毒素在茶葉中也有檢出，但由于其檢出含量較少或危害較小，研究人員暫時(shí)對(duì)其關(guān)注度相對(duì)偏低，相關(guān)報(bào)道研究較少。

茶葉中存在的產(chǎn)毒菌及霉菌毒素如表1所示；表2列舉了近年來(lái)茶葉中霉菌毒素的檢測(cè)結(jié)果。

表1 茶葉中存在的產(chǎn)毒菌及霉菌毒素Table 1 Toxigenic fungi and mycotoxins present in tea

表2 茶葉中霉菌毒素的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Mycotoxin contents in tea

續(xù)表2

3 茶葉中霉菌毒素的檢測(cè)方法

3.1 樣品前處理技術(shù)

霉菌毒素是一類(lèi)小分子的化合物，而茶葉則是一種復(fù)雜的食品基質(zhì)，其豐富的內(nèi)含物可能會(huì)干擾正常的分析檢測(cè)過(guò)程，茶樣需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的提取和凈化程序才能進(jìn)行分析[58,65]。在茶葉預(yù)處理過(guò)程中，消除基質(zhì)效應(yīng)是當(dāng)前開(kāi)展分析工作的主要挑戰(zhàn)。目前，茶葉實(shí)際分析過(guò)程中需要結(jié)合下述分析方法進(jìn)行前處理，以提高復(fù)雜基體的精密度和特異性[66]。茶葉毒素檢測(cè)的提取方法主要包括固相萃取（solid-phase extraction，SPE）[67]、分散固相萃?。╠ispersive solid-phase extraction，DSPE）[31]、液-液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）[68]、固相支撐液-液萃?。╯upported liquid extraction，SLE）[59]、分散液-液微萃?。╠ispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）[16]、懸浮固化分散液-液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction based on the solidification of floating organic droplets，DLLME-SFO）[65]、基于同位素的快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、堅(jiān)固和安全（quick-easycheap-effective-rugged and safe，QuE-ChERS）[69]、稀釋進(jìn)樣（dilute and shoot，D&S）[68]；凈化方法主要有免疫親和柱（immune affinity column，IAC）與多功能柱（multi-function columns，MFC）[70-71]等。

SPE和LLE是當(dāng)前霉菌毒素殘留常用的提取方法，常用于降低基質(zhì)效應(yīng)并提高靈敏度，但LLE存在有機(jī)溶劑用量大、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，而SPE費(fèi)用昂貴，不符合綠色化學(xué)的要求[67-68]；DLLME具有快速、簡(jiǎn)便、成本低、溶劑用量少、富集率高等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于霉菌毒素樣品的處理[72]。DLLME在實(shí)際應(yīng)用中還常與其他提取方法相結(jié)合，比如，Cina等[65]建立袋泡茶樣品中OTA的分析提取和凈化方法，將DLLME-SFO與高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合定量評(píng)價(jià)，該分析技術(shù)具有生態(tài)友好、靈敏、選擇性好、快速等特點(diǎn)；QuE-ChERS被廣泛應(yīng)用于食品基質(zhì)（水果和蔬菜）中農(nóng)藥殘留檢測(cè)，現(xiàn)主要將QuE-ChERS與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）相結(jié)合用于茶葉中的AFs與多種霉菌毒素的檢測(cè)，該方法獲得了令人滿意的回收率（78.94%～121.00%）[58,64,69]；目前解決基質(zhì)效應(yīng)的最新趨勢(shì)是采用稀釋進(jìn)樣技術(shù)，該方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、樣品損失最小、吞吐量高、分析物種類(lèi)多。但在茶葉霉菌毒素檢測(cè)方面該技術(shù)仍處于方法建立階段，還有待進(jìn)一步開(kāi)拓其在不同茶樣中的應(yīng)用[73]。

IAC是一種利用抗體與抗原特異性結(jié)合的凈化方法，該方法凈化后的霉菌毒素純度高，已應(yīng)用于大多數(shù)的樣品檢測(cè)當(dāng)中，但由于抗體特異性、凈化耗時(shí)長(zhǎng)與柱子不可重復(fù)使用等原因均限制了IAC的應(yīng)用[61,66]。MFC與IAC相比無(wú)需經(jīng)過(guò)活化、淋洗和洗脫步驟，凈化時(shí)間更短、操作更簡(jiǎn)單。MFC可以通過(guò)對(duì)茶葉樣品的基質(zhì)進(jìn)行選擇性地吸附，減少樣品基質(zhì)對(duì)待測(cè)霉菌毒素的干擾，但該方法對(duì)部分霉菌毒素的特異性差，存在吸附毒素本身的問(wèn)題，造成回收率偏低[24,70]。目前，已有MFC-IAC聯(lián)合凈化法，該方法通常用于復(fù)雜的基質(zhì)，具有優(yōu)異的分離能力和較高的靈敏度和回收率（75%～120%），但該方法預(yù)處理過(guò)程復(fù)雜且昂貴，尤其是對(duì)茶葉而言[59,70]。

綜上，未來(lái)應(yīng)開(kāi)發(fā)凈化和預(yù)濃縮步驟，以提高方法的分析能力。其中，基于納米材料、生物材料和合成材料的樣品預(yù)處理和分析技術(shù)被認(rèn)為是測(cè)定霉菌毒素的重要方法[64]。據(jù)報(bào)道，二氧化硅/石墨烯氧化物和多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）已成功應(yīng)用于谷物和食品中AFs的檢測(cè)。此外，已有研究報(bào)道了胺化多壁碳納米管對(duì)茶多酚和葉綠素的去除能力，以及基于MWCNTs開(kāi)發(fā)的AFs檢測(cè)生物傳感器[64]。雖然新的技術(shù)層出不窮，但也有學(xué)者指出茶在飲用方式上與其他谷物相比有著根本的差異，評(píng)價(jià)飲茶中攝入的霉菌毒素應(yīng)該根據(jù)其飲用方式的不同做出相應(yīng)調(diào)整[20]。

3.2 檢測(cè)技術(shù)

基于側(cè)向流試紙條（lateral flow test，LFT）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和液相色譜（liquid chromatography，LC）的霉菌毒素檢測(cè)方法已被廣泛采用，在檢測(cè)常見(jiàn)的霉菌毒素方面已建立了良好的基礎(chǔ)[62,66,74]。LFT可實(shí)現(xiàn)快速篩選且抗基質(zhì)干擾，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜處理，但該方法線性范圍不及現(xiàn)代儀器分析，且重現(xiàn)性較差[74]。ELISA具有操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，但該方法需要制備特定的抗體，面臨著開(kāi)發(fā)難度大、重現(xiàn)性差、易出現(xiàn)假陽(yáng)性等問(wèn)題。例如，在ACT聯(lián)合ELISA試驗(yàn)中，樣品的預(yù)處理不僅費(fèi)時(shí)，而且會(huì)存在假陽(yáng)性的問(wèn)題[62]。相比于LFT和ELISA，LC是目前應(yīng)用最廣的檢測(cè)方法，LC包括高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和UPLC/MS/MS等。LC在提取上有試劑用量少、萃取體積小的優(yōu)點(diǎn)；在結(jié)果上有靈敏度高、回收率高、選擇性好、穩(wěn)定性高和假陽(yáng)性率低等優(yōu)點(diǎn)，此外，LC還可以應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)多種霉菌毒素[31,66]。然而，LC的柱前或柱后衍生化需要大量的衍生劑（如三氟乙酸），這會(huì)對(duì)儀器造成損害。同時(shí)LC依賴于基質(zhì)的電離抑制，因此想要準(zhǔn)確定量目標(biāo)分析物就需要進(jìn)行耗時(shí)且復(fù)雜的矩陣匹配校正[69]。

一般情況下，由于強(qiáng)烈的基質(zhì)效應(yīng)，茶葉中霉菌毒素的平均回收率在80%左右[65]。但這些技術(shù)既耗時(shí)又會(huì)產(chǎn)生大量有機(jī)溶劑廢物，不符合綠色化學(xué)的要求?？紤]到OTA、AFs本身具有熒光性，Gonzalez等[59]基于并行因子分析（parallel factor analysis，PARAFAC）和多元曲線分辨率交替最小二乘法（multivariate curve resolutionalternating least squares，MCR-ALS）聯(lián)合高效液相色譜-熒光檢測(cè)法（high performance liquid chromatographyfluorescence detection，HPLC-FLD）進(jìn)行檢測(cè)，以極低的溶劑就可實(shí)現(xiàn)定量。Bogdanova等[58]建立二維液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（two-dimensional liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry，2D-LC-TOF-MS）同時(shí)檢測(cè)出普洱茶中70 種霉菌毒素，該方法不僅能夠快速準(zhǔn)確地分析復(fù)雜基質(zhì)樣品中的霉菌毒素，而且在分離不同霉菌毒素時(shí)具有更好的效果，使得分析結(jié)果更清晰準(zhǔn)確。同時(shí)，該方法還可檢測(cè)到極少被關(guān)注的OTB。此外，利用HPLC與高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)農(nóng)藥殘留、霉菌毒素、吡咯里西啶和生物堿的方法已在小麥、韭菜和茶等食品中有所應(yīng)用[75]，未來(lái)利用高分辨率技術(shù)檢測(cè)茶葉中的霉菌毒素將成為趨勢(shì)。茶葉中霉菌毒素檢測(cè)方法與評(píng)價(jià)指標(biāo)見(jiàn)表3。

表3 茶葉中霉菌毒素檢測(cè)方法與評(píng)價(jià)指標(biāo)Table 3 Detection methods for mycotoxins in tea and their figures of merit

綜上所述，茶葉中的霉菌毒素檢測(cè)研究目前多集中在AFs、OTA、DON中，其他毒素（如STC、AHO和PAT）關(guān)注較少，而關(guān)注多種霉菌毒素的研究更少。在六大茶類(lèi)中，針對(duì)黑茶的檢測(cè)占據(jù)大多數(shù)，青茶、白茶和黃茶中較少涉及。值得注意的是，由于樣品及測(cè)定方法不同，茶葉中的霉菌毒素的檢測(cè)結(jié)果并不一致。針對(duì)茶葉基質(zhì)中的霉菌毒素的快檢技術(shù)研究較少，現(xiàn)有的定量分析方法不足以實(shí)現(xiàn)未知霉菌毒素的準(zhǔn)確定性定量分析，是否存在假陽(yáng)性的問(wèn)題還有待深究。此外，這些研究中大多沒(méi)有說(shuō)明其檢測(cè)樣品的原始狀態(tài)、具體來(lái)源和倉(cāng)儲(chǔ)狀態(tài)等情況，這為霉菌毒素的科學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估帶來(lái)難題。因此，建立一種可靠的、能有效降低茶葉基質(zhì)干擾的霉菌毒素檢測(cè)方法勢(shì)在必行。

4 控制措施

4.1 育種與改良

在防止作物在收獲前被污染方面，可以通過(guò)植物育種和基因工程增強(qiáng)抗霉菌基因，使用生防劑及針對(duì)霉菌毒素開(kāi)發(fā)中的調(diào)控基因來(lái)提高宿主抵抗力[46]。在植物中基于基因工程開(kāi)發(fā)宿主植物對(duì)霉菌毒素的抗性已有先例[76]。Solliman等[77]將從鷹嘴豆（Cicer arietinumL.）中分離的防御基因作為抗霉菌基因生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因番茄，增強(qiáng)了番茄的抗霉菌性能。Chen Qiming等[78]發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果抗再植病相關(guān)基因MdCERK1-2的超表達(dá)可以影響本氏煙草植物的多重防御反應(yīng)并增加其對(duì)霉菌病原體的抗性。該研究還發(fā)現(xiàn)超表達(dá)MdCERK1-2增強(qiáng)了蘋(píng)果對(duì)霉菌病原體的防御反應(yīng)。然而，育種改良技術(shù)在茶樹(shù)中的研究較少，但有望形成一種趨勢(shì)，其中，有研究在大吉嶺茶樹(shù)中發(fā)現(xiàn)AV-2栽培品種在抗水皰?。ú≡鸀镋xobasidium vexans）方面具有優(yōu)勢(shì)，可作為今后茶樹(shù)選育的參考[79]。

4.2 控制加工條件

當(dāng)前，茶葉質(zhì)量控制所面臨的挑戰(zhàn)之一是在不影響原有品質(zhì)的情況下消除危害因素。所以控制霉菌毒素的方法在很大程度上是預(yù)防性的，其中良好的農(nóng)業(yè)實(shí)踐和適應(yīng)的加工方式對(duì)茶葉而言尤為重要[46]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求在茶葉生產(chǎn)過(guò)程中嚴(yán)格遵守GB/T 20014.12—2013《良好農(nóng)業(yè)規(guī)范: 第12部分 茶葉控制點(diǎn)與符合性規(guī)范》[80]、GB/T 32744—2016《茶葉加工良好規(guī)范》[81]和GB/Z 21722—2008《出口茶葉質(zhì)量安全控制規(guī)范》[82]等，確保加工和倉(cāng)庫(kù)等場(chǎng)所保持干燥、通風(fēng)和清潔，并設(shè)立防霉設(shè)施。茶葉在貯藏時(shí)應(yīng)該符合GH/T 1071—2011《茶葉貯存通則》規(guī)定，即確保茶葉無(wú)霉變[83]。Zhang Xuanjun等[24]認(rèn)為中國(guó)茶葉所選擇的低溫貯藏和真空包裝的方式可有效避免霉菌污染。

此外，研究表明，對(duì)加工場(chǎng)所及加工的各個(gè)環(huán)節(jié)采取相關(guān)的措施可有效降低霉菌侵染的風(fēng)險(xiǎn)及霉菌毒素污染程度。比如，Tong Wei等[32]研究發(fā)現(xiàn)利用10 g/L NaClO溶液對(duì)鮮葉進(jìn)行殺菌可有效降低鮮葉表面微生物豐度，但殺菌后所制成的紅茶中總兒茶素和茶氨酸的含量降低。而傳統(tǒng)的熱殺菌技術(shù)在應(yīng)用時(shí)也被發(fā)現(xiàn)會(huì)影響茶葉品質(zhì)[84]。如今，隨著技術(shù)的發(fā)展，利用輻照殺菌等技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)品殺菌能有效保證茶葉品質(zhì)。Jayasinghe等[85]利用Co-60 γ輻照器對(duì)市售錫蘭紅茶進(jìn)行輻照，發(fā)現(xiàn)5 kGy是有效確保微生物安全、保留市售錫蘭紅茶的物理參數(shù)和總多酚含量的最佳劑量。Hayashi等[86]研究發(fā)現(xiàn)綠茶在200 kV的加速電壓和8 μA的束流條件下暴露15 min對(duì)其顏色和芳香成分沒(méi)有影響，不會(huì)降低其商業(yè)價(jià)值，同時(shí)還可以凈化茶葉，且沒(méi)有顯著的質(zhì)量劣化。因此，在確保茶葉原有品質(zhì)的基礎(chǔ)上，探究適合鮮葉與成茶的殺菌技術(shù)及安全性是未來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。

4.3 完善限量標(biāo)準(zhǔn)

目前，關(guān)稅同盟國(guó)家（亞美尼亞、白俄羅斯、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦和俄羅斯）就茶葉中的霉菌毒素制定了相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定生茶中AFB1的限量為5 μg/kg。此外，印度規(guī)定AFT在紅茶中的限量為30 μg/kg，阿根廷規(guī)定涼茶沖泡原料中的AFB1和AFs限量分別為5 μg/kg和20 μg/kg。中國(guó)則暫未針對(duì)茶葉中的霉菌毒素制定相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)[2,24]。因此，為了評(píng)估霉菌毒素在茶中的安全風(fēng)險(xiǎn)，有必要參考上述國(guó)家對(duì)不同種類(lèi)的茶葉進(jìn)行霉菌毒素監(jiān)管的代表性研究，并應(yīng)選擇其他食品的霉菌限制標(biāo)準(zhǔn)作為參考，建立適用于茶葉中霉菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)[49]。

4.4 建立風(fēng)險(xiǎn)效益評(píng)估機(jī)制

根據(jù)茶葉的特殊性，其攝入方式不同于其他食品，飲茶者往往采用沸水沖泡干茶后飲入茶湯，棄去茶渣，但目前茶葉中的霉菌毒素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估機(jī)制主要參考食品中的評(píng)估機(jī)制，這不利于正確分析茶葉中的霉菌毒素風(fēng)險(xiǎn)。因此，只有在沖泡過(guò)程中進(jìn)入茶湯的霉菌毒素（即“有效風(fēng)險(xiǎn)量”）才能造成健康風(fēng)險(xiǎn)[34]。建立風(fēng)險(xiǎn)效益評(píng)估機(jī)制，評(píng)估由飲茶誘發(fā)的霉菌毒素風(fēng)險(xiǎn)和茶葉的健康作用之間的關(guān)系，調(diào)查茶葉中霉菌毒素在茶湯中的轉(zhuǎn)移情況，并對(duì)商品茶產(chǎn)品中是否存在多種霉菌毒素進(jìn)行分析[46]，完善風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估機(jī)制，這將有助于指導(dǎo)政府制定食品政策和刺激消費(fèi)者消費(fèi)行為[47]。

5 結(jié) 語(yǔ)

茶葉中的霉菌病害作為一種嚴(yán)重的國(guó)際衛(wèi)生問(wèn)題已成為關(guān)注焦點(diǎn)，在茶葉種采、加工及流通過(guò)程中存在受霉菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。如今，針對(duì)茶葉中霉菌及其毒素的定性定量與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估已成為研究熱點(diǎn)。但仍然需要引起注意的是：首先，目前針對(duì)茶葉中的霉菌毒素的研究數(shù)據(jù)仍然有限，茶葉與霉菌接觸后是否一定會(huì)產(chǎn)生毒素，毒素的轉(zhuǎn)移率如何等問(wèn)題目前尚未完全闡明；其次，針對(duì)茶葉中的霉菌毒素分析檢測(cè)技術(shù)還有待進(jìn)一步完善；最后，針對(duì)茶葉中的霉菌及其毒素的監(jiān)督管理力度還不足，相關(guān)法律法規(guī)體系還不健全，專門(mén)針對(duì)茶葉霉菌的管理措施還有待進(jìn)一步研究。因此，掌握茶葉中霉菌毒素的來(lái)源，研究茶葉中常見(jiàn)霉菌及其毒素的危害，制定相應(yīng)的控制措施并完善分析檢測(cè)體系，對(duì)提升茶葉質(zhì)量具有重大意義。