張靜靜 王亞冰 王 倩 韓多彩 彭士明①

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 上海 200090; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院 北京 100081)

大黃魚是我國(guó)養(yǎng)殖規(guī)模最大的海水魚類, 被列為我國(guó)八大優(yōu)勢(shì)出口養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等, 2021; 韓承義等, 2022)。傳統(tǒng)的大黃魚養(yǎng)殖主要集中在近海海域, 近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖過程中,除陸源輸入外, 排泄物及殘餌以及養(yǎng)殖區(qū)自身污染物的大量排放可引起局部海域氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽、有機(jī)質(zhì)含量過高, 造成水質(zhì)惡化。隨著大黃魚養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大,病害頻發(fā)、品質(zhì)退化、成活率低等問題日益突出, 嚴(yán)重影響了大黃魚的產(chǎn)業(yè)效益(Caoet al, 2015; Maet al,2020; 徐鵬等, 2022)。因此, 推動(dòng)大黃魚深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展是實(shí)現(xiàn)大黃魚養(yǎng)殖提質(zhì)增效、產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的有效途徑, 也是踐行大食物觀, 向江河湖海要食物,推進(jìn)我國(guó)深藍(lán)漁業(yè)發(fā)展的重要戰(zhàn)略舉措(徐皓等,2021)。深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖海域營(yíng)養(yǎng)豐富、水體交換率高、污染物含量少, 配合現(xiàn)代化養(yǎng)殖裝備及先進(jìn)的養(yǎng)殖技術(shù), 可高效獲得高品質(zhì)的養(yǎng)殖大黃魚(鄒國(guó)華等,2021)。然而, 深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖水域浪高流急、海況惡劣,且易受臺(tái)風(fēng)大浪的侵襲, 這對(duì)于大黃魚的養(yǎng)殖是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn), 要求養(yǎng)殖大黃魚需要具備較強(qiáng)的抗流能力。目前, 通過國(guó)審的4 個(gè)大黃魚新品種其選育的性狀主要聚焦在生長(zhǎng)、條形及耐低溫等方面, 這些品種無法應(yīng)對(duì)復(fù)雜的海域環(huán)境, 特別是較快的水流條件。深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖魚類新品種現(xiàn)已被列入《2022 農(nóng)業(yè)農(nóng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展重大技術(shù)需求》。因此, 為滿足深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖大黃魚種業(yè)發(fā)展需求, 需培育抗流能力強(qiáng)適宜深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖的大黃魚新品種, 以推動(dòng)我國(guó)大黃魚深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。

魚類性狀的遺傳解析可為新品種創(chuàng)制及其育種技術(shù)開發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。目前已有的針對(duì)大黃魚性狀遺傳基礎(chǔ)解析的研究主要聚焦在疾病(Zhaoet al, 2021; Baiet al, 2022; Zhanget al, 2022)、低氧(Muet al, 2020)、低溫(曾霖等, 2022)、生長(zhǎng)(Zhouet al,2019)、性別控制(Luoet al, 2019)等方面, 針對(duì)大黃魚抗流性狀的遺傳基礎(chǔ)解析尚未見有相關(guān)報(bào)道。本研究基于轉(zhuǎn)錄組技術(shù)(RNA-seq)對(duì)不同抗流能力大黃魚肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析, 以期從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的層面解析大黃魚抗流性狀的分子基礎(chǔ), 研究結(jié)果可為培育適宜深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖大黃魚抗流新品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚抗流分組及樣本采集

2021 年9 月從福建省福鼎市沙埕灣主養(yǎng)區(qū)收集1 000 余尾大黃魚, 購(gòu)買于同一家養(yǎng)殖戶, 這批魚來自同一批受精卵(來源于寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司),養(yǎng)殖區(qū)位于沙埕灣后港村的養(yǎng)殖漁排, 體重(274.58±14.09) g, 體長(zhǎng)(23.9±0.96) cm, 為1 齡大黃魚, 其養(yǎng)殖周期、養(yǎng)殖模式及所處水域的水文特征均為一致。大黃魚暫養(yǎng)于2 口室內(nèi)水泥池(直徑6 m, 水深1.5 m,500 尾/池)中, 進(jìn)行一周的。暫養(yǎng)條件為: 水溫(27.0±1.0) °C, 鹽度25～26, 溶氧量 DO>6 mg/L。每天早晚兩次投喂商業(yè)飼料至飽食狀態(tài), 日換水量1/2。

在進(jìn)行抗流篩選實(shí)驗(yàn)前大黃魚禁食24 h, 通過抗流實(shí)驗(yàn)裝置(圖1)進(jìn)行大黃魚抗流能力強(qiáng)弱的分篩,抗流裝置內(nèi)水深0.5 m, 每次取50 條魚放入水槽中(E區(qū)), 用充氣泵保持足夠的溶氧水平, 水流控制采用無極變速, 以實(shí)驗(yàn)魚體長(zhǎng)(約20 cm/s)的流速作為初始流速, 使實(shí)驗(yàn)魚適應(yīng)20～30 min, 隨后在1 min 內(nèi)使流速增加到1.0 m/s, 觀察并記錄大黃魚的抗流時(shí)間,將抗流時(shí)間>30 min 的大黃魚歸為HM 組, 抗流時(shí)間<5 min 且以抵觸隔網(wǎng)30 s 作為篩選條件確定為SM組。用于進(jìn)行樣品采集及統(tǒng)計(jì)48 h 累計(jì)死亡率的實(shí)驗(yàn)魚其具體操作流程如下: 在分篩實(shí)驗(yàn)前, 根據(jù)大黃魚的游動(dòng)能力, 將所有大黃魚初步分為了游動(dòng)能力強(qiáng)組和游動(dòng)能力弱組。操作的目的除了提高分篩的效率外, 主要是考慮到抗流裝置每次分篩只能一次性放置50 尾魚, 實(shí)驗(yàn)魚被篩選出來的先后順序是不同的。為了準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)抗流組和非抗流組的48 h 累計(jì)死亡率, 避免相同實(shí)驗(yàn)組內(nèi)實(shí)驗(yàn)魚在時(shí)間上的不同步性, 在初步分組的基礎(chǔ)上, 分別針對(duì)游動(dòng)能力強(qiáng)組和游動(dòng)能力弱組各進(jìn)行3 批次的抗流分篩。針對(duì)游動(dòng)能力強(qiáng)組的3 批次抗流分篩, 分別篩選到35、38、39尾HM 組實(shí)驗(yàn)魚, 每次分篩結(jié)束后將篩選到的HM 組實(shí)驗(yàn)魚放置于單獨(dú)的一個(gè)水泥池中(直徑4 m, 水深1 m), 然后分別統(tǒng)計(jì)3 個(gè)水泥池中實(shí)驗(yàn)魚的48 h 累計(jì)死亡率。針對(duì)游動(dòng)能力弱組的3 批次抗流分篩, 分別篩選到37、40、36 尾SM 組實(shí)驗(yàn)魚, 采用上述相同的方法統(tǒng)計(jì)48 h 累計(jì)死亡率。48 h 后, 分別從HM 組、SM 組隨機(jī)收集18 尾大黃魚, 以20 mg/L 丁香酚溶液進(jìn)行麻醉, 統(tǒng)一收集背鰭中間下方1 cm 左右的肌肉組織0.2 g, 每6 尾大黃魚肌肉組織等量混合放置于2 mL 的無菌凍存管中, 每個(gè)處理組共收集3 管, 經(jīng)液氮速凍后置于–80 °C 冰箱保存。

圖1 大黃魚抗流實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 The schematic diagram of anti-flow experiment of large yellow croaker

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.2.1 總RNA 提取、建庫(kù)與測(cè)序 根據(jù)Trizol 試劑盒(Invitrogen, 美國(guó))提取每管肌肉組織的總RNA,并分別使用 Nanodrop?分光光度計(jì)、Agilent 2100 生物分析儀進(jìn)行RNA 的純度、濃度及完整性檢測(cè)。用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA, 以mRNA 為模板,合成cDNA, 利用AM Pure XP beads 純化cDNA, 純化的雙鏈cDNA 再進(jìn)行末端修復(fù)、加poly(A)尾并連接測(cè)序接頭, 然后用AMPure XP beads 進(jìn)行片段大小選擇;最后通過PCR 富集得到cDNA 文庫(kù)。檢測(cè)合格的cDNA 文庫(kù)在Illumina HiseqTM2500 平臺(tái)上測(cè)序。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組分析 利用Fast QC 軟件對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估, 去除原始數(shù)據(jù)中含有帶接頭和低質(zhì)量的片段, 保證獲得的數(shù)據(jù)具有品質(zhì)較高的有效測(cè)序數(shù)據(jù)(clean reads)。利HISAT2 軟件, 使用BWT 算法將clean reads 與大黃魚參考基組(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/972/845/GCF_000972845.2_L_crocea_2.0)進(jìn)行比對(duì)。使用 DESeq2軟件采用 FPKM 計(jì)算方法將 clean data 標(biāo)準(zhǔn)化, 以差異倍數(shù)|log2fold change|≥1 且P<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因(DEGs)。對(duì)組裝的序列進(jìn)行遺傳相似性比較, 以進(jìn)行蛋白質(zhì)功能注釋, 將單基因與GO、COG(clusters of orthologous groups) 、KOG (eukaryotic orthologous groups)、KEGG、Nr (non- redundant)、Swiss-Pro 和Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并注釋。根據(jù)注釋結(jié)果, 分別對(duì)DEGs 的功能和生物學(xué)途徑進(jìn)行分類。將DEGs 與 GO 數(shù)據(jù)庫(kù)和 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),從而獲得 GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析。

1.2.3 DEGs RT-qPCR 驗(yàn)證 隨機(jī)選取DEGs 中的8 個(gè)基因, 以β-actin為內(nèi)參基因, 進(jìn)行RT-qPCR 檢驗(yàn),特異性引物使用軟件NCBI 在線設(shè)計(jì)(表1)。使用Quant Studio 6 Flex 進(jìn)行RT-qPCR, 反應(yīng)體系按 Ultra SYBR Mixture (康為, 中國(guó))試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為: 2×Ultra SYBR Mixture 12.5 μL; Forward primer (10 μmol/L) 0.5 μL; Reverse primer (10 μmol/L)0.5 μL; Template cDNA 1 μL; ddH2O 10.5 μL, 總體積25 μL。采用兩步法PCR 擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序, 循環(huán)參數(shù)為反應(yīng)程序: 95 °C 預(yù)變性 10 min, 95 °C 變性15 s,60 °C 退火延伸 1 min, 共40 個(gè)循環(huán)。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行溶解曲線分析, 用2–??Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物Tab.1 Primers used for real-time PCR analysis

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量及注釋分析

利用RNA-seq 對(duì)HM組、SM組進(jìn)行測(cè)序分析, 對(duì)測(cè)得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)一步質(zhì)控后得到 21 522 509～24 869 415 條有效測(cè)序量, 與大黃魚參考基因組比對(duì)后得到41 412 309～47 651 205 條匹配的序列, 比對(duì)率為 95.27%～96.37%, 拼接共獲得 33 191 個(gè)單基因(unigene)。本試驗(yàn)中GC 含量區(qū)間為51.51%～52.15%,Q30>92.9% (表2), 表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量可用于對(duì)后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Summary statistics of transcriptome sequencing date

將unigene 與常用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并注釋, 發(fā)現(xiàn)共有24 252 條unigene 被注釋, 其中有18 494 個(gè)unigene在GO 中注釋(76.26%), 長(zhǎng)度大于1 000 bp 有12 895個(gè) unigene; 在 KEGG 注釋到 24 177 個(gè) unigene(99.69%), 長(zhǎng)度大于1 000 bp 有15 871個(gè)單基因(表3)。

表3 Unigene 注釋統(tǒng)計(jì)Tab.3 Summary of unigene annotation

2.2 DEGs 分析

將HM 組與SM 組肌肉組織DEGs 進(jìn)行對(duì)比分析。將基因表達(dá)量倍數(shù)設(shè)置為二倍以上,P<0.05 的基因作為DEGs。由HM 組與SM 大黃魚肌肉組織的RNA 測(cè)序和基因表達(dá)譜分析可知: DEGs 的總數(shù)一共有1 806, 其中有1 090 個(gè)基因顯著上調(diào)(P<0.05; 圖2, 紅色), 716 個(gè)基因顯著下調(diào)(P<0.05; 圖2, 綠色)。聚類分析熱圖顯示, HM 與SM 組間差異基因表達(dá)模式相差較大, HM組個(gè)體間表達(dá)模式相似, 但是SM 組個(gè)體間基因表達(dá)模式存在明顯差異(圖3)。

圖2 差異表達(dá)基因火山圖Fig.2 Volcano diagram of differentially expressed genes

圖3 組間差異表達(dá)基因分層聚類熱圖Fig.3 Heatmap of differentially expressed genes between groups

2.3 DEGs 的GO 富集分析

為進(jìn)一步探究HM 組與SM 組DEGs 的功能, 對(duì)DEGs 進(jìn)行GO 功能注釋。DEGs 在細(xì)胞組分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)和生物學(xué)過程(biological process, BP)中均有富集。在CC 中顯著富集在肌鈣蛋白復(fù)合物、蛋白酶體輔助復(fù)合物、肌球蛋白、線粒體內(nèi)膜等條目; 在MF 中顯著富集在MAP 激酶酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性條目; 在BP 中顯著富集在Rho 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)條目(圖4)。

圖4 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的GO 分析Fig.4 Gene ontology (GO) item analyses of differentially expressed genes in transcriptome

2.4 DEGs 的KEGG 富集分析

本研究中共有24 177 個(gè)基因在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配, 并將富集程度最顯著的20 條通路進(jìn)行散點(diǎn)圖繪制。HM 組與SM 組相比, 上調(diào)的DEGs 富集到的信號(hào)通路主要與能量代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān), 包括心肌收縮、氧化磷酸化信號(hào)通路、黏著斑、ECM-受體相互作用、AGE-RAGE、MAPK、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能等信號(hào)通路, 而下調(diào)的DEGs 富集的信號(hào)通路主要為真核生物核糖體的發(fā)生、蛋白酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白加工、RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)以及泛素介導(dǎo)的蛋白水解等(圖5)。

圖5 肌肉組織差異表達(dá)基因KEGG 功能富集分布Fig.5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes in muscle tissue

2.5 RT-qPCR 驗(yàn)證

隨機(jī)選取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中8 個(gè)DEGs 做RT-qPCR驗(yàn)證。RT-qPCR 所得到的基因表達(dá)情況與轉(zhuǎn)錄組獲得的基因表達(dá)趨勢(shì)一致, 說明轉(zhuǎn)錄組結(jié)果可靠(圖6)。

圖6 RNA-Seq 與RT-qPCR 的基因表達(dá)比較分析Fig.6 Comparative analysis of differentially expressed genes of RNA-Seq and RT-qPCR

2.6 抗流分組后48 h 累計(jì)死亡率

抗流分組后, HM 組和SM 組大黃魚均出現(xiàn)死亡情況, 但SM 組的死亡率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均極顯著高于HM 組(P<0.01)。其中SM 組在抗流分組后12 h 內(nèi)就出現(xiàn)死亡現(xiàn)象, 48 h 內(nèi)累計(jì)死亡率達(dá)到了18.00%, 而HM 組在抗流試驗(yàn)24 h 內(nèi)才出現(xiàn)死亡情況, 48 h 內(nèi)累計(jì)死亡率為5.33% (表4)。

表4 大黃魚累計(jì)死亡率Tab.4 Cumulative mortality rate of large yellow croaker

3 討論

3.1 DEGs 聚類分析

本研究采用RNA-Seq 技術(shù)對(duì)比揭示了不同抗流能力大黃魚群體間肌肉組織的基因表達(dá)差異, 為進(jìn)一步挖掘定位大黃魚抗流性狀關(guān)鍵控制基因奠定了重要基礎(chǔ)。通過DEGs 聚類分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn), 抗流弱的SM 組DEGs 并沒有全部聚類在一起, 個(gè)體間差異較為明顯, 其原因可能與SM 組個(gè)體間的抗流能力存在較大差異有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)條件下, SM 組大黃魚其抗流時(shí)間的跨度從0～5 min, 換言之, 有的個(gè)體抗流的時(shí)間可以維持將近5 min, 但有的個(gè)體其抗流的時(shí)間可能不足 1 min, 甚至個(gè)別個(gè)體的抗流時(shí)間僅有20～30 s, 由此導(dǎo)致了SM 組個(gè)體間的抗流能力差異較大; 而抗流能力強(qiáng)的HM 組中, 所有個(gè)體的抗流時(shí)間均在30 min 以上, 意味著所有個(gè)體均具有較強(qiáng)的抗流能力, 個(gè)體間的抗流能力差異不大, 所以HM 組DEGs 聚類分析的結(jié)果顯示其一致性較好。眾所周知,魚類表型性狀受遺傳與環(huán)境的雙重控制(Jonssonet al,2019; Raffiniet al, 2020; Downieet al, 2021), 本研究中大黃魚的來源相同, 因此可以斷定不同大黃魚個(gè)體間抗流能力的差異主要受遺傳因素的影響, SM 組個(gè)體間的抗流能力存在較大差異進(jìn)而導(dǎo)致了DEGs 的表達(dá)模式未能呈現(xiàn)出較好的一致性。

3.2 DEGs 的GO 富集分析

肌球蛋白、肌鈣蛋白復(fù)合物是構(gòu)成肌肉結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵組成部分, 肌節(jié)是肌肉收縮的基本單位, 參與各種類型的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞骨架的維持(Drazicet al, 2018;Ochiaiet al, 2020) 。本研究發(fā)現(xiàn), 不同抗流能力大黃魚群體間的DEGs 主要富集在肌球蛋白、肌鈣蛋白復(fù)合物、肌節(jié)和Rho 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控等與肌肉收縮功能有關(guān)的條目, 這表明了大黃魚肌肉組織中肌球蛋白、肌鈣蛋白復(fù)合物與肌節(jié)等重要組分的生理功能與其抗流能力的強(qiáng)弱之間存在密切的關(guān)聯(lián)。這一點(diǎn)在斑馬魚(Danio rerio)和金頭鯛(Sparus aurata)的研究中也得到了證實(shí), 其游泳能力與骨骼肌肌球蛋白和肌鈣蛋白基因的表達(dá)密切相關(guān)(Van Der Meulenet al,2006; Palstraet al, 2020)。當(dāng)然, 魚類肌肉組織中重要組分的生理功能與其相關(guān)基因的表達(dá)不僅與遺傳因素相關(guān), 與環(huán)境因素同樣密切相關(guān)。Moya 等(2019)指出持續(xù)性的游泳會(huì)使金頭鯛(Sparus aurata)幼魚肌纖維特征發(fā)生明顯變化, 使虹鱒(Oncorhynchus mykiss)肌肉收縮發(fā)育相關(guān)的多個(gè)基因表達(dá)發(fā)生改變(Palstraet al, 2013), 此外, Totland 等(1987)研究表明較強(qiáng)的水流條件會(huì)使大西洋鮭魚(Salmo salar)白肌中單位面積的纖維數(shù)量減少, 單個(gè)肌肉纖維的平均面積增加。本研究中, 實(shí)驗(yàn)所用大黃魚的養(yǎng)殖環(huán)境因素是一致的, 因此可以確定, 遺傳因素的差異影響了大黃魚個(gè)體間肌肉組織中重要組分的生理功能進(jìn)而決定了其抗流能力的強(qiáng)弱。

3.3 DEGs 的KEGG 通路分析

心肌收縮對(duì)魚類維持正常的生理活動(dòng)具有重要作用(Singhet al, 2016; Kublyet al, 2019; Nabeebaccus,2022), 周盈穎(2001)發(fā)現(xiàn)心肌收縮受心肌細(xì)胞中腎上腺素能信號(hào)通路的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn), 在抗流能力強(qiáng)的大黃魚肌肉組織中心肌收縮相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào), 表明大黃魚心肌收縮功能與其抗流能力間存在正相關(guān)關(guān)系。心輸出量和血氧含量是魚類游泳能力的重要指標(biāo), 持續(xù)游泳中魚類通過心輸出量和血氧含量的改變影響能量代謝和氧氣利用, 來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。Castro 等(2013)發(fā)現(xiàn)大西洋鮭魚的游泳訓(xùn)練可以通過激活特定基因來誘導(dǎo)心臟的肥大和增生參與對(duì)心臟生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。反過來, 心臟生長(zhǎng)可以潛在地增加心輸出量, 促進(jìn)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送。Li 等(2023)利用臨界游泳速度對(duì)篩選得到的快速和慢速游泳的大黃魚幼魚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在氧化磷酸化、心肌收縮等途徑, 說明游泳過程中大黃魚通過增加心輸出量影響能量代謝和氧氣利用, 來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。同樣地, 具有較強(qiáng)游泳能力的藍(lán)鰭金槍魚(Thunnus orientalis), 強(qiáng)大的心肌收縮能力是其在快速游泳狀態(tài)下保持心室充盈、維持心輸出量的重要生理基礎(chǔ)(Ciezareket al, 2020)。除此之外,較強(qiáng)的水流條件也會(huì)引起魚類新陳代謝的顯著變化,進(jìn)而引起機(jī)體能量需求的增加(袁喜等, 2012; Schrecket al, 2016; Yuet al, 2022; 柴若愚等, 2023)。研究已證實(shí), 氧化磷酸化信號(hào)通路不僅與ATP 的生成途徑有關(guān), 還是能量代謝的重要樞紐(Linet al, 2020; Suet al,2020)。本研究中, HM 組大黃魚肌肉組織中參與氧化磷酸化信號(hào)通路的基因表達(dá)顯著上調(diào), 這些基因編碼的產(chǎn)物已證實(shí)在呼吸鏈電子傳遞過程中發(fā)揮重要作用(Neelet al, 2020), 推測(cè)抗流組個(gè)體中氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP 是其具有較強(qiáng)抗流能力的能量基礎(chǔ)。黏著斑是細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)骨架之間聯(lián)系的橋梁,對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有重要作用(Moulderet al, 2010; Liet al,2019; Mackayet al, 2021), 而ECM-受體相互作用信號(hào)通路可參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)分化(Kanchanawonget al,2023)。本研究結(jié)果顯示, 抗流能力強(qiáng)的大黃魚肌肉組織中黏著斑與ECM-受體相互作用信號(hào)通路的相關(guān)基因同樣顯著上調(diào)。

3.4 抗流分組后累計(jì)死亡率分析

應(yīng)激是影響魚類生命活動(dòng)的重要影響因素之一(Nitzet al, 2020)。于麗娟等(2014)發(fā)現(xiàn)不同水流速度下的中華倒刺鲃 肌肉(Spinibarbus sinensis)自由基代謝會(huì)發(fā)生改變, 而自由基代謝紊亂會(huì)引起氧化/還原系統(tǒng)的失衡, 進(jìn)而導(dǎo)致魚體的應(yīng)激損傷。本研究中SM 組大黃魚肌肉組織中泛素介導(dǎo)的蛋白水解、蛋白酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白加工等與氧化應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路基因明顯上調(diào), 表明水流刺激顯著誘發(fā)了SM 組大黃魚的應(yīng)激反應(yīng)。婁宇棟等(2019)在對(duì)美國(guó)紅魚(Sciaenops ocellatus)肝臟轉(zhuǎn)錄組分析中同樣發(fā)現(xiàn), 高流速下美國(guó)紅魚會(huì)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的脅迫相關(guān)基因PKA、Wnt的上調(diào),這表明過快的水流會(huì)引起魚類的氧化應(yīng)激反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為外界環(huán)境的壓力感受器(Yooet al, 2017), 可以啟動(dòng)機(jī)體通過自噬或細(xì)胞凋亡來清除損傷的細(xì)胞。本研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白加工信號(hào)通路被顯著富集, 而其在介導(dǎo)錯(cuò)誤折疊的蛋白進(jìn)入胞質(zhì)中發(fā)揮重要作用(Iurlaroet al, 2016), 這也進(jìn)一步表明了水流的刺激導(dǎo)致了SM組大黃魚機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了應(yīng)激損傷, 此是導(dǎo)致SM 組累計(jì)死亡率明顯高于HM 組的主要原因之一。

4 結(jié)論

本研究基于不同抗流能力大黃魚群體間肌肉組織DEGs 的GO 功能與KEGG 通路富集分析, 推測(cè)抗流能力強(qiáng)的大黃魚可能是通過改變肌肉收縮的方式及能量代謝來提高機(jī)體應(yīng)對(duì)水流的能力。結(jié)合死亡率等表型數(shù)據(jù)的分析, 進(jìn)一步印證了較強(qiáng)的抗流能力可顯著提高大黃魚在強(qiáng)水流刺激下的成活率, 研究結(jié)果為深入挖掘抗流相關(guān)基因提供了基礎(chǔ)信息, 并為培育適宜深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖的大黃魚抗流新品種奠定了理論基礎(chǔ)。