紫玉蘭樹皮中的生物堿類成分

孔令濤，趙超越，夏璐瑤，賈獻慧，白著雙，唐文照

紫玉蘭樹皮中的生物堿類成分

孔令濤，趙超越，夏璐瑤，賈獻慧，白著雙，唐文照*

山東第一醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（藥物研究所）；先進藥物遞釋系統(tǒng)全國重點實驗室；國家衛(wèi)健委生物技術(shù)藥物重點實驗室；山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南 250117

研究紫玉蘭樹皮的生物堿類化學(xué)成分。采用硅膠柱色譜、ODS柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜以及制備HPLC等分離方法進行分離純化，根據(jù)波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。利用MTT法測試化合物對人肺癌A549細胞的細胞毒活性。從紫玉蘭樹皮中分離得到6個生物堿類化合物，分別鑒定為()--(4′-(4′′-formyl-1′′- (hydroxymethyl)-1-pyrrol)butyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylamide（1）、magnolamide（2）、--feruloytyramine（3）、dicentrinone（4）、liriodenine（5）、lysicamine（6）。其中化合物1～3屬于有機胺類生物堿，4～6屬于阿樸菲類生物堿。生物活性測試結(jié)果表明化合物4～6可明顯抑制A549細胞增殖，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）分別為8.17、15.33與11.05 μmol/L?；衔?為新化合物，命名為紫玉蘭堿，化合物5為首次從木蘭屬植物中分離得到，化合物2、4～6為首次從該植物中分離得到。3個阿樸菲類生物堿（4～6）對A549細胞具有較強的細胞毒活性。

紫玉蘭；有機胺生物堿；阿樸菲生物堿；細胞毒活性；紫玉蘭堿；liriodenine

紫玉蘭Desr. 為木蘭科木蘭屬Linn. 植物，落葉灌木，產(chǎn)于福建、湖北、四川、云南等省份，現(xiàn)已被作為觀賞花卉樹種或行道樹廣泛引種。紫玉蘭的樹皮、葉、花蕾均可入藥，其花蕾民間用于治療鼻塞、風(fēng)寒頭痛等癥，在多地當(dāng)作中草藥辛夷使用[1]。目前紫玉蘭化學(xué)成分的研究主要集中在花蕾和葉部位，發(fā)現(xiàn)了多種木脂素類以及揮發(fā)油成分[2-3]，但是，對該植物樹皮中的化學(xué)成分研究未見報道。本實驗對紫玉蘭樹皮部位的化學(xué)成分進行系統(tǒng)研究，運用多種色譜分離手段，從紫玉蘭樹皮的95%乙醇和酸水提取物中首次分離得到6個生物堿類成分，分別鑒定為()-- (4′-(4′′-formyl-1′′-(hydroxymethyl)-1-pyrrol) butyl)- 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylamide（1）、magnolamide（2）、--feruloytyramine（3）、dicentrinone（4）、liriodenine（5）、lysicamine（6），包括3個有機胺類生物堿（1～3）和3個阿樸菲類生物堿（4～6），其中化合物1為新化合物（圖1），命名為紫玉蘭堿；化合物5為首次從木蘭屬植物中分離得到，化合物2、4～6為首次從該植物中分離得到。采用MTT法測定6個化合物對人肺癌A549細胞的細胞毒活性，結(jié)果顯示3個阿樸菲類生物堿抑制A549細胞增殖的活性較好，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值分別為8.17、15.33與11.05 μmol/L。

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu) (a)及其關(guān)鍵性的HMBC (b,)與1H-1H COSY (b, )

1 儀器與材料

Bruker Avance 800 MHz（Bruker公司，瑞士）；SCIEX AB X500R型液-質(zhì)聯(lián)用儀；Thermo ultimate 3000分析型高效液相色譜儀，色譜柱為（250 mm×4.6 mm，5 μm，GLScience）；SPD-20A制備型高效液相色譜儀（日本島津公司），色譜柱為（250 mm mm×4.6 mm，5 μm，GLScience）；柱色譜硅膠（青島海洋化工廠，200～300目）；GF254薄層色譜硅膠板（臨沂市海洋化工廠）；Sephadex LH-20（Amersham Biosciences公司，瑞典）；ODS柱色譜填料（50～75 μm，YMC公司）色譜級甲醇（美國天地有限公司）；分析級甲醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）。

紫玉蘭Desr. 樹皮于2021年10月采自山東臨沂，藥材經(jīng)由山東中醫(yī)藥大學(xué)辛義周主任藥師進行鑒定，標(biāo)本（20211003m）存放在山東第一醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥材標(biāo)本室。

2 提取與分離

紫玉蘭樹皮13 kg，干燥，粉碎后用95%乙醇冷浸提取3次，每次3 d，合并提取液，減壓蒸餾，除去有機溶劑，將提取物分散于水中，再用二氯甲烷萃取。二氯甲烷部位回收溶劑后得二氯甲烷部位（35.7 g）。將95%乙醇提取完的藥渣浸泡于1%（30 L）的鹽酸溶液中，浸泡48 h后將酸水提取液調(diào)節(jié)pH＝10，再用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷提取液，減壓回收溶劑后得酸水部位（18.0 g）。

二氯甲烷部位（35.7 g）進行硅膠柱色譜，以二氯甲烷–甲醇（100∶0→7∶3）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜分析，合并相同組分得Fr. 1～5。Fr. 5（19.6 g）經(jīng)ODS柱色譜，以甲醇-水50%～100%梯度洗脫，得Fr. 5.1～5.8。Fr. 5.5（201 mg）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯（8∶2→1∶1）梯度洗脫得Fr. 5.5.1～5.5.6。Fr. 5.5.3經(jīng)HPLC制備（甲醇-水52∶48），得到化合物1（15.14 mg，R＝23 min）和2（120.7 mg，R＝40 min）。Fr. 5.5.4經(jīng)HPLC制備（甲醇-水53∶47），得到化合物3（38.02 mg，R＝35 min）。

酸水部位用硅膠（200～300目）拌樣進行硅膠柱色譜，以二氯甲烷–甲醇（100∶0→6∶4）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜分析，合并相同組分，得Fr. 1～5。Fr. 4（423 mg）經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（50∶1）洗脫，再經(jīng)ODS柱色譜，以甲醇-水40%→100%梯度洗脫，得化合物6（8.0 mg）。剩下的部分用甲醇溶解，經(jīng)HPLC制備（甲醇-水60∶40），得化合物4（6.1 mg，R＝35 min）。Fr. 5（1 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（100∶0→30∶1）梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測合并相同部分，得Fr. 5.1～5.9。Fr. 5.9經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜，以環(huán)己烷-醋酸乙酯（8∶2）洗脫，甲醇溶解后經(jīng)HPLC制備（甲醇-水70∶30），得到化合物5（10 mg，R＝25 min）。

3 活性測試

采用MTT法對分離得到的化合物進行抑制肺癌細胞增殖的活性評價，以順鉑為陽性對照藥，取A549指數(shù)生長期細胞經(jīng)洗滌后，用0.25%胰蛋白酶消化后計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)為1×105/mL，將細胞接種于96孔板中，每孔1×104個，置37 ℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)液，加入含有不同濃度樣品的培養(yǎng)基，樣品依次用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔?？瞻讓φ战M加入與給藥組相對應(yīng)濃度DMSO的完全培養(yǎng)基，用順鉑作為陽性對照組。在37 ℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，向每孔加入MTT儲備液（質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL），37 ℃繼續(xù)孵育3～4 h，傾去孔內(nèi)的液體并向每孔加入150 μL DMSO，避光于溫室下充分振蕩，使藍紫色甲瓚結(jié)晶溶解，10 min內(nèi)用全自動酶標(biāo)儀檢測570 nm處各孔的吸光度（）值，以對照組為參考，計算不同濃度藥物的抑制率，并計算IC50。

抑制率=1－給藥/對照

4 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1與2的1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)(800/200 MHz, CDCl3)

化合物2：淡黃色油狀液體，分子式C20H24N2O5，HRESIMS/: 373.143 0 [M＋H]+，1H- 與13C-NMR數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[4]，故鑒定化合物2為magnolamide。

化合物3：淡黃色油狀液體，HRESIMS/: 373.143 0 [M＋H]+。1H-NMR (800 MHz, CD3OD): 6.55 (1H, s, H-2), 6.24 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 6.46 (1H, d,= 8.2 Hz, H-6), 6.89 (1H, d,= 15.6 Hz, H-7), 5.86 (1H, d,= 15.6 Hz, H-8), 4.39 (3H, s, 3-OCH3), 6.17 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2′, 6′), 6.50 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3′, 5′), 2.20 (2H, t,= 7.4 Hz, H-7′), 2.92 (2H, t,= 7.4 Hz, H-8′)；13C-NMR (200 MHz, CD3OD): 128.2 (C-1), 111.5 (C-2), 149.3 (C-3), 150.0 (C-4), 116.5 (C-5), 123.3 (C-6), 142.1 (C-7), 118.7 (C-8), 169.2 (C-9), 131.3 (C-1′), 130.8 (C-2′,6′), 116.3 (C-3′,5′), 156.9 (C-4′), 35.8 (C-7′), 42.6 (C-8′), 56.4 (3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[5]，故鑒定化合物3為--feruloytyramine。

化合物4：橙色針狀結(jié)晶（甲醇），HRESIMS/: 276.052 0 [M＋H]+。1H-NMR (800 MHz, DMSO-6): 7.21 (1H, s, H-3), 8.06 (1H, d,= 5.1 Hz, H-4), 8.82 (1H, d,= 5.1 Hz, H-5), 8.57 (1H, d,= 7.7 Hz, H-8), 7.66 (1H, t,= 7.7 Hz, H-9), 7.75 (1H, t,= 8.1 Hz, H-10), 8.66 (1H, d,= 8.1 Hz, H-11), 6.32 (2H, s, -OCH2O-)；13C-NMR (200 MHz, DMSO-6): 148.3 (C-1), 151.5 (C-2), 103.0 (C-3), 124.4 (C-4), 145.0 (C-5), 182.3 (C-7), 128.3 (C-8), 128.8 (C-9), 133.9 (C-10), 126.7 (C-11), 108.2 (C-1a), 145.6 (C-3a), 122.3 (C-1b), 136.0 (C-6a), 131.3 (C-7a), 132.8 (C-11a), 103.1 (-OCH2O-)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[6]，故鑒定化合物4為dicentrinone。

化合物5：橙色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式C19H13NO5，HRESIMS/: 336.082 6 [M＋H]+。1H-NMR (800 MHz, DMSO-6): 7.54 (1H, s, H-3), 7.71 (1H, d,= 5.1 Hz, H-4), 8.81 (1H, d,= 5.1 Hz, H-5), 7.81 (1H, s, H-8), 8.14 (1H, s, H-11), 6.36 (2H, s, -OCH2O-), 4.01 (3H, s, 9-OCH3), 3.97 (3H, s, 10-OCH3)；13C-NMR (200 MHz, DMSO-6): 147.3 (C-2), 102.8 (C-3), 124.4 (C-4), 144.9 (C-5), 180.9 (C-7), 108.6 (C-8), 148.8 (C-9), 153.6 (C-10) , 109.3 (C-11), 108.2 (C-1a), 135.8 (C-3a), 122.9 (C-1b), 145.5 (C-6a), 127.6 (C-7a), 125.6 (C-11a), 102.4 (-OCH2O-), 56.1 (9-OCH3), 56.3 (10-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[7]，故鑒定化合物5為liriodenine。

化合物6：綠色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式：C18H13NO3，HRESIMS/: 292.082 2 [M＋H]+。1H-NMR (800 MHz, DMSO-6): 7.66 (1H, s, H-3), 8.12 (1H, d,= 5.2 Hz, H-4), 8.87 (1H, d,= 5.2 Hz, H-5), 8.48 (1H, dd,= 8.4, 1.2 Hz, H-8), 7.65 (1H, t,= 8.4, 1.2 Hz, H-9), 7.89 (1H, t,= 8.4, 1.2 Hz, H-10), 9.15 (1H, dd,= 8.4, 1.2 Hz, H-11), 4.11 (3H, s, 1-OCH3), 4.04 (3H, s, 2-OCH3)；13C-NMR (200 MHz, DMSO-6): 145.2(C-1), 157.8 (C-2), 108.4 (C-3), 125.6 (C-4), 145.0 (C-5), 182.2 (C-7), 128.8 (C-8) , 129.6 (C-9), 135.3 (C-10), 129.6 (C-11), 157.6 (C-3a), 155.3 (C-6a), 123.0 (C-6b), 132.6 (C-7a), 135.5 (C-11a), 118.7 (C-11b), 61.1 (1-OCH3), 57.0 (2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[8]，故鑒定化合物6為lysicamine。

5 細胞毒活性

對活性數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果顯示化合物4～6對A549細胞的增殖具有明顯的抑制活性，IC50值分別為8.17、15.33與11.05 μmol/L，活性稍弱于陽性對照藥順鉑（IC50為6.05 μmol/L），其余化合物（1～3）沒有抑制A549細胞增殖的活性（IC50＞50 μmol/L）。

6 討論

本研究采用多種色譜方法從紫玉蘭樹皮中分離得到6個生物堿類成分，包括3個有機胺類生物堿和3個阿樸菲類生物堿，其中化合物1為新化合物，除化合物3外，其余化合物都是首次從紫玉蘭中分離得到，豐富了該植物中化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)類型。通過活性篩選，發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)生的阿樸菲類生物堿具有顯著的細胞毒活性，為進一步研究紫玉蘭的藥效物質(zhì)，促進該植物資源的綜合利用提供了科研基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Alkaloids from stem barks of

KONG Ling-tao, ZHAO Chao-yue, XIA Lu-yao, JIA Xian-hui, BAI Zhu-shuang, TANG Wen-zhao

School of Pharmaceutical Sciences & Institute of Materia Medica, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, National Key Laboratory of Advanced Drug Delivery System, Key Laboratory for Biotechnology Drugs of National Health Commission (Shandong Academy of Medical Sciences), Key Lab for Rare & Uncommon Diseases of Shandong Province, Jinan 250117, China

To study alkaloids from the stem barks ofwith their cytotoxicity on lung cancer cells A549.Compounds were isolated and purified by various chromatographic techniques, including silica gel, ODS, Sephadex LH-20 and preparative HPLC. Their structures were elucidated via spectroscopic data analysis. Cytotoxicity on lung cancer cells A549 was evaluated by MTT experiment.Three organic amine alkaloids (1—3) and three apophenoid alkaloids (4—6) were isolated. They were identified as magnoliliamide (1), magnolamide (2),--feruloytyramine (3), dicentrinone (4), liriodenine (5) and lysicamine (6). Bioactive results showed that compounds 4, 5 and 6 had good inhibitory activity on A549 cell line with IC50values of 8.17, 15.33 and 11.05 μmol/L.Compound 1 is a new compound and named magnoliliamide, compound 5 is isolated from the genus offor the first time, and compounds 2, 4, 5 and 6 are firstly obtained from this plant. Three aporphine alkaloids (4—6) have strong cytotoxicity on the proliferation of A549 cells.

Desr.; organic amine alkaloids; aporphine alkaloids; cytotoxicity; magnoliliamide; liriodenine

R284.1

A

0253 - 2670(2023)20 - 6587 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.003

2023-07-21

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目（21907059）；山東第一醫(yī)科大學(xué)學(xué)術(shù)提升計劃（2019LJ003）

孔令濤（1998—），男，碩士研究生，從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail: 3107575997@qq.com

通信作者：唐文照（1973—），男，教授，研究生導(dǎo)師，從事天然活性成分研究與中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: twzsd@sina.com

[責(zé)任編輯 王文倩]