楊沛勛，劉忞璇, ，劉 婧，李志強，張新莊，曹 亮，王振中，范小雪*，肖 偉, *

龍血通絡(luò)膠囊對異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌缺血的保護作用

楊沛勛1，劉忞璇1, 2, 3，劉 婧2, 3，李志強2, 3，張新莊2, 3，曹 亮2, 3，王振中2, 3，范小雪2, 3*，肖 偉1, 2, 3*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023 2. 中藥制藥過程控制與智能制造技術(shù)全國重點實驗室，江蘇 連云港 222001 3. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001

探究龍血通絡(luò)膠囊對異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）誘導(dǎo)大鼠心肌缺血的保護作用。Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、地奧心血康（62.50 mg/kg）組和龍血通絡(luò)膠囊低、中、高劑量（103.12、206.25、412.50 mg/kg）組，每組10只。各組連續(xù)28 d ig給予相應(yīng)藥物，第27、28天給藥1 h后，除對照組sc生理鹽水外，其余各組sc ISO（150 mg/kg）。第1次sc ISO 48 h后摘取大鼠心臟，計算心臟指數(shù)；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察各組大鼠心肌組織病理變化；采用ELISA法檢測各組大鼠血清中肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）和心肌鈣蛋白-I（cardiac troponin-I，cTn-I）水平；采用試劑盒檢測大鼠血清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平；采用TUNEL染色觀察大鼠心肌細胞凋亡情況；采用免疫組化法檢測心肌組織中核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血紅素加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）和剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）蛋白表達。與對照組比較，模型組大鼠心臟指數(shù)顯著升高（＜0.001），血清中cTn-I、CK-MB、CK、MDA水平以及LDH、AST活性顯著升高（＜0.001），SOD活性降低（＜0.001），心肌組織出現(xiàn)明顯的病理變化（＜0.001），心肌細胞凋亡率顯著升高（＜0.001），心肌組織中cleaved Caspase-3、Nrf2和HO-1蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.001）。與模型組比較，龍血通絡(luò)膠囊組大鼠心臟指數(shù)明顯降低（＜0.001），血清中cTn-I、CK-MB、CK、MDA水平以及LDH、AST活性顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），SOD活性顯著升高（＜0.001）；心肌組織的病理性改變得到改善（＜0.05）；心肌組織中心肌細胞凋亡率顯著降低（＜0.01）；心肌組織中cleaved Caspase-3蛋白表達顯著降低（＜0.05、0.01），Nrf2、HO-1蛋白表達顯著升高（＜0.01、0.001）。龍血通絡(luò)膠囊可改善ISO誘導(dǎo)大鼠心肌缺血損傷，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路，進而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡。

龍血通絡(luò)膠囊；心肌缺血；氧化應(yīng)激；細胞凋亡；核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1通路

心血管疾病是人類面臨的最大健康問題，造成極為嚴重的社會負擔(dān)[1-2]。心肌缺血是最常見的心血管疾病，是全球最主要的死亡原因，每年約914萬人死于心肌缺血[3-4]。當(dāng)心肌缺血發(fā)生時，會出現(xiàn)心肌供血供氧不足，造成心肌組織的不可逆損傷，引發(fā)心衰、心絞痛等[5-6]。目前常采用血運重建術(shù)恢復(fù)缺血心肌血流達到治療心肌缺血的目的，但會造成心肌組織的進一步損傷[7-8]。中藥因其具有多成分、多靶點的特點，在治療心肌缺血方面已經(jīng)取得較好的臨床效果[9]。

龍血竭是我國傳統(tǒng)名貴中藥，有“活血圣藥”之稱[10]。研究發(fā)現(xiàn)，龍血竭具有抗血小板聚集[11]、治療心肌缺血的作用[12]。龍血通絡(luò)膠囊成分為龍血竭酚類提取物，是從龍血竭藥材中經(jīng)提取精制純化得到的有效部位，具有活血化瘀、通絡(luò)的功效，臨床用于卒中病中經(jīng)絡(luò)（輕中度腦梗死）恢復(fù)期血瘀證。中醫(yī)認為心腦血管疾病存在共同的病理基礎(chǔ)，即本虛標實，久病入絡(luò)?；谛哪X相通和異病同治，后世醫(yī)家提出心、腦血管疾病的同法治療，并以益氣活血、活血通絡(luò)為主要治法[13]。此外，龍血竭以及相關(guān)中成藥在治療心腦血管疾病方面的有效性也多有文獻報道[11,14-16]。因此，推測龍血通絡(luò)膠囊對心臟疾病可能具有改善作用。故本研究通過sc異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）建立大鼠心肌缺血模型，考察龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血的保護作用，以期為臨床上龍血通絡(luò)膠囊治療心肌缺血提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量160～180 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，合格證號No.110324220102763713，許可證號SCXK（京）2019-0010，實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2018-0026。動物飼養(yǎng)于室溫（22±2）℃、相對濕度50%～60%的環(huán)境下，大鼠分籠飼養(yǎng)，2只/籠，12 h光照/黑暗交替，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司機構(gòu)動物護理與使用委員會批準（批準號2022073102）。

1.2 藥品與試劑

龍血通絡(luò)膠囊（批號220203）由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供；地奧心血康膠囊（批號211004）購自成都地奧制藥集團有限公司；舒泰50（批號88SHA）購自法國維克有限公司；拜特速眠新（鹽酸賽拉嗪注射液，批號20210102）購自長沙拜特生物科技研究所公司；鹽酸異丙腎上腺素（批號H2124300）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉注射液（批號A21022302B）購自河南科倫藥業(yè)有限公司；羧甲基纖維素鈉（批號20220104）、無水乙醇（批號20220514）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；4%多聚甲醛溶液（批號20220209）購自南京森貝伽生物科技有限公司；二甲苯（批號C14131606）、切片石蠟（批號C12959678）、中性樹膠（批號C14203248）、伊紅（批號C1405672）、蘇木素（批號C11922494）均購自上海麥克林生化科技股份有限公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）試劑盒（批號20220628）、心肌肌鈣蛋白-I（cardiac troponin-I，cTn-I）試劑盒（批號20220628）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（批號20220621）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號20220509）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒（批號20220611）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號20220611）購自南京建成生物工程研究所；肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒（批號202205）購自江萊生物技術(shù)有限公司；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（批號071422221206）購自上海碧云天生化科技有限公司；YF?594-Phalloidin YF?594標記鬼筆環(huán)肽（紅色，批號GY0926）、蛋白酶K（批號210705L1-03）購自蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司；抗熒光衰減封片劑（不含DAPI，批號20221101）、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（批號20220702）購自北京索萊寶科技有限公司；增強型DAB顯色試劑盒（批號CR2210090）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體（批號XJ3725685）購自美國Invitrogen公司；血紅素加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）抗體（批號GR3348210-20）、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（批號1001006230）購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號22）購自美國CST公司。

1.3 儀器

XY1000-1B型電子天平（常州市幸運電子設(shè)備有限公司）；AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；EnSpire型多光譜掃描酶標儀（美國PerkinElmer公司）；TP1020型自動生物組織脫水機、RM2235型切片機（德國Leica公司）；YD-6L型生物組織冷凍包埋機、YD型包埋機冷凍臺、YD-A型生物組織攤片機、YD-B型生物組織烤片機（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；Gemini AS型染色機（美國Epredia公司）；Soptop HS6型病理切片掃描儀（寧波舜宇儀器有限公司）；IX73型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

將Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、地奧心血康（62.50 mg/kg）組和龍血通絡(luò)膠囊低、中、高劑量（103.12、206.25、412.50 mg/kg，分別相對于臨床劑量的0.5、1、2倍）組，每組10只。各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積羧甲基纖維素鈉溶液，1次/d，連續(xù)28 d。第27天給藥1 h后，模型組和各給藥組大鼠sc 150 mg/kg ISO（2 mL/kg），對照組sc等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)2 d。

2.2 體質(zhì)量變化率測定

給藥期間對大鼠體質(zhì)量進行監(jiān)測，并計算sc ISO后大鼠體質(zhì)量變化率。

體質(zhì)量變化率＝(sc ISO后體質(zhì)量－造模前體質(zhì)量)/造模前體質(zhì)量

2.3 樣本收集

第1次sc ISO 48 h后，大鼠sc舒泰（25 mg/kg）和拜特速眠新（6.25 mg/kg）麻醉，仰位固定大鼠，剪開腹部皮膚，腹主動脈取血，置于4 ℃冰箱過夜，第2天進行離心，用于后續(xù)檢測。采血后打開胸腔，迅速取出心臟，生理鹽水洗滌，用吸水紙吸去心臟表面殘留的液體后稱定質(zhì)量，然后置于4%多聚甲醛溶液中固定保存，用于后續(xù)蘇木素-伊紅（HE）病理染色、TUNEL染色和相關(guān)蛋白表達檢測。

2.4 大鼠心臟指數(shù)測定

稱定大鼠心臟質(zhì)量和體質(zhì)量，計算心臟指數(shù)。

心臟指數(shù)＝心臟質(zhì)量/體質(zhì)量

2.5 心臟病理學(xué)觀察

取固定好的各組大鼠心臟，梯度乙醇脫水，二甲苯處理后進行石蠟包埋，切片（4 μm厚），溫水展片并移到載玻片上，烘干，進行HE染色，于顯微鏡下觀察各組大鼠心臟的病理變化。

2.6 血清心肌酶檢測

按照試劑盒說明書檢測大鼠血清中CK、CK-MB、cTn-I水平以及AST、LDH活性。

2.7 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡

取大鼠心臟石蠟切片，依次用二甲苯、梯度乙醇、蒸餾水、不含DNase的蛋白酶K處理后，PBS漂洗后，滴加TUNEL檢測液，PBS漂洗，滴加熒光標記的鬼筆環(huán)肽液，PBS漂洗，用抗熒光淬滅封片液封片后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。用Image J軟件分析，計算細胞凋亡率。

細胞凋亡率＝凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)

2.8 免疫組化檢測心臟cleaved Caspase-3和Nrf2/HO-1通路蛋白表達

取大鼠心臟石蠟切片，依次用二甲苯、梯度乙醇和蒸餾水脫蠟至水，用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液對切片進行抗原修復(fù)，PBS漂洗，滴加3% H2O2，PBS漂洗，滴加封閉液；一抗孵育過夜后，滴加二抗孵育1 h，滴加DAB顯色液進行顯色，用蘇木素復(fù)染，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察并拍照，并用Image J軟件統(tǒng)計陽性表達面積占比，以對照組陽性表達面積為1，對數(shù)據(jù)進行歸一化處理。

2.9 血清中SOD活性和MDA水平檢測

按照試劑盒說明書檢測大鼠血清中SOD活性以及MDA水平。

2.10 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 龍血通絡(luò)膠囊對sc ISO后大鼠體質(zhì)量變化率的影響

如圖1所示，第1次sc ISO 48 h后，大鼠體質(zhì)量降低，而各給藥組大鼠體質(zhì)量均有所改善。

圖1 龍血通絡(luò)膠囊對sc ISO后大鼠體質(zhì)量變化率的影響

3.2 龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血大鼠心臟指數(shù)的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠心臟指數(shù)顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠心臟指數(shù)均顯著降低（＜0.001）。

對照組n＝10，模型組及龍血通絡(luò)膠囊低、中劑量組和地奧心血康組n＝8，龍血通絡(luò)膠囊高劑量組n＝9 與對照組比較：#P＜0.05 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.3 龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血大鼠心肌組織病理變化的影響

如圖3和表1所示，對照組大鼠心肌細胞排列整齊，界限清晰，呈束狀分布，心肌細胞核形態(tài)正常，未見明顯病理現(xiàn)象。與對照組比較，模型組心臟組織出現(xiàn)嚴重或極嚴重損傷，心肌纖維大量斷裂，細胞輪廓模糊，細胞融合性病變壞死，中性粒細胞大量浸潤，病理評分顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組心肌形態(tài)均得到不同程度改善，地奧心血康組和龍血通絡(luò)膠囊中、高劑量組病理評分均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.4 龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血大鼠血清中心肌酶的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中cTn-I、CK-MB、CK水平及LDH、AST活性均顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組cTn-I水平及LDH、AST活性均顯著降低（＜0.01、0.001），龍血通絡(luò)膠囊各劑量組CK-MB水平顯著降低（＜0.01、0.001），龍血通絡(luò)膠囊中、高劑量組和地奧心血康組CK水平顯著降低（＜0.01、0.001）。

黃色箭頭表示心肌纖維大量斷裂；紅色箭頭表示細胞融合性病變壞死；綠色箭頭表示中性粒細胞大量浸潤及出血嚴重

表1 龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血大鼠心臟組織病理評分的影響[M(Q1，Q3)]

與對照組比較：###＜0.001；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

###< 0.001control group;*< 0.05**< 0.01model group

3.5 龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中cleaved Caspase-3蛋白表達顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組cleaved Caspase-3蛋白表達均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。

如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中心肌細胞凋亡率顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，地奧心血康組和龍血通絡(luò)膠囊高劑量組心肌組織中細胞凋亡率均顯著降低（＜0.01）。

圖4 龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血大鼠血清中心肌酶的影響(, n = 6)

圖5 龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血大鼠心肌組織cleaved Caspase-3蛋白表達的影響(, n = 3)

圖6 龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡的影響(, n = 3)

3.6 龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血大鼠心肌組織Nrf2/HO-1蛋白表達的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1表達均升高（＜0.05、0.001）；與模型組比較，地奧心血康組和龍血通絡(luò)膠囊中、高劑量組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1蛋白表達均顯著升高（＜0.01、0.001）。

3.7 龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血大鼠血清中MDA水平和SOD活性的影響

如圖8所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中MDA水平顯著升高（＜0.001），SOD活性顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中MDA水平均顯著下降（＜0.05、0.001），SOD活性均顯著升高（＜0.001）。

圖7 龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血大鼠心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達的影響(, n = 3)

圖8 龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血大鼠血清中SOD活性和MDA水平的影響(, n = 6)

4 討論

心肌缺血是由于機體功能性改變或器質(zhì)性病變導(dǎo)致心肌供血供氧不足，引發(fā)能量代謝障礙，心臟不能發(fā)揮正常功能的病理狀態(tài)[17-18]。ISO是一種β腎上腺素受體激動劑，ISO通過增加心臟耗氧量，增快心率進而引發(fā)心肌損傷[19-20]。sc ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌缺血模型具有操作簡便、模型重復(fù)率高等特點[21]，目前已經(jīng)被廣泛用于心臟保護藥物開發(fā)與研究[18,22-24]，因此本實驗通過皮下多點注射ISO構(gòu)建大鼠心肌缺血模型用以研究龍血通絡(luò)膠囊對心肌缺血的作用。

龍血竭是我國傳統(tǒng)名貴中藥，由葉龍血樹屬植物的脂木材經(jīng)乙醇提取而得，龍血竭具有活血化瘀、消腫止痛、斂瘡生肌的功效[10]。由龍血竭藥材經(jīng)精制研發(fā)而成的龍血通絡(luò)膠囊主要用于卒中病中經(jīng)絡(luò)（輕中度腦梗死）恢復(fù)期血瘀證[25-26]。中醫(yī)認為心腦以脈絡(luò)相連，共主神明，心腦功能的正常發(fā)揮有賴于絡(luò)脈的通暢流利。氣血不足、風(fēng)痰瘀血阻絡(luò)是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。在異病同治和心腦相通的基礎(chǔ)上進一步發(fā)展出心、腦血管疾病的同法治療，并提出以益氣活血、活血通絡(luò)為主要治法[13,27]。提示龍血通絡(luò)膠囊對于心臟疾病具有潛在作用。此外，現(xiàn)代藥理學(xué)已經(jīng)證明龍血竭以及相關(guān)中成藥在治療心腦血管疾病方面的有效性。龍血竭可以通過抑制氧化應(yīng)激改善心肌缺血再灌注損傷[11]；龍血竭提取物通過調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/ 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路治療小鼠心肌梗死[14]；龍血通絡(luò)膠囊具有改善動脈粥樣硬化的作用[15]，并且可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善腦缺血再灌注損傷[16]。表明龍血竭及其相關(guān)藥物在治療心腦血管疾病方面具有顯著療效，也提示龍血通絡(luò)膠囊具有改善心肌缺血的潛在作用。

心肌缺血會造成心肌細胞膜的損傷，從而導(dǎo)致心肌酶釋放到血液中，血清中心肌酶活性以及心肌蛋白水平的異常升高是評價心肌缺血的重要指標，其中血清中CK-MB、CK、cTn-I水平以及AST、LDH活性可以反映大鼠心肌損傷程度[28]。研究發(fā)現(xiàn)，龍血竭中的活性成分能夠降低CK-MB、CK水平和AST、LDH活性[11,29]，提示龍血通絡(luò)膠囊具有降低血清心肌酶的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，龍血通絡(luò)膠囊可以降低大鼠血清中CK-MB、CK、cTn-I水平以及AST、LDH活性，表明龍血通絡(luò)膠囊可以改善ISO造成的大鼠心肌損傷。

當(dāng)sc ISO誘發(fā)心肌缺血時，會加速心臟的氧氣消耗，并且由于缺血心肌的氧氣供應(yīng)不足，心肌細胞進行無氧呼吸產(chǎn)生大量H+，破壞線粒體從而產(chǎn)生過量活性氧[30-31]。過量活性氧會導(dǎo)致線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能障礙，造成能量代謝障礙以及鈣超載，此外活性氧也會破壞生物膜、蛋白質(zhì)以及DNA，這些因素互相影響，進而引起細胞的凋亡、壞死等[32-33]。MDA和SOD是衡量氧化應(yīng)激水平的標志物，其中MDA作為活性氧的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，其水平反映了機體氧化應(yīng)激的水平；SOD作為一種氧化清除劑，其活性反映了機體的抗氧化水平[34]。龍血竭及其活性成分具有良好的抗氧化應(yīng)激能力，可以提高SOD活性，并降低MDA水平[35]，提示龍血通絡(luò)具有抑制氧化應(yīng)激的可能。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，龍血通絡(luò)膠囊顯著提高大鼠血清中SOD活性，降低血清中MDA水平，表明龍血通絡(luò)膠囊可以通過提高抗氧化水平抑制心肌缺血引起的氧化應(yīng)激，從而保護心肌細胞。

心肌組織長期缺血會誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，造成缺血部位及其周邊心肌的細胞死亡，進而導(dǎo)致心力衰竭[36-37]。在心肌缺血過程中，細胞內(nèi)活性氧含量的上升是造成心肌細胞凋亡的重要因素[31-33]。Nrf2是與氧化應(yīng)激相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性維持細胞氧化還原平衡。在正常生理環(huán)境下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-related protein 1，Keap1）形成低活性聚合體被細胞質(zhì)中的肌動蛋白錨定。當(dāng)細胞被活性氧等親電子劑攻擊時，Nrf2從聚合體釋放并轉(zhuǎn)位到細胞核，與細胞核內(nèi)的Maf蛋白和Jun bZip轉(zhuǎn)錄因子形成異二聚體，并被核內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant reaction elements，AREs）序列識別并結(jié)合，進而啟動Nrf2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程，激活下游HO-1以及相關(guān)抗氧化通路，從而抑制氧化應(yīng)激，減少心肌細胞凋亡[38-40]。Caspase-3是細胞凋亡的重要執(zhí)行蛋白，當(dāng)發(fā)生凋亡時，Caspase-3被剪切為cleaved Caspase-3而活化，進而發(fā)揮促凋亡作用，cleaved Caspase-3也被認為是細胞凋亡的標志物[18,41]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，龍血竭及其活性成分能夠抑制細胞凋亡，激活Nrf2/HO-1通路，進而抑制氧化應(yīng)激[35,42]。提示龍血通絡(luò)膠囊具有通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路，抑制細胞凋亡的可能。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，龍血通絡(luò)膠囊顯著提高大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1表達水平，顯著降低大鼠心肌組織中cleaved Caspase-3表達水平，并且可以顯著降低心肌組織中心肌細胞凋亡率。表明龍血通絡(luò)膠囊可以通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路，從而抑制心肌細胞凋亡。

綜上，龍血通絡(luò)膠囊可能通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路抑制氧化應(yīng)激，減少心肌細胞凋亡，從而減輕心肌損傷，達到改善心肌缺血的作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect of Longxuetongluo Capsule on isoproterenol-induced myocardial ischemia in rats

YANG Pei-xun1, LIU Min-xuan1, 2, 3, LIU Jing2, 3, LI Zhi-qiang2, 3, ZHANG Xin-zhuang2, 3, CAO Liang2, 3, WANG Zhen-zhong2, 3, FAN Xiao-xue2, 3, XIAO Wei1, 2, 3

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. National Key Laboratory of Technologies for Chinese Medicine Pharmaceutical Process Control and Intelligent Manufacture, Lianyungang 222001, China 3. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China

To investigate the protective effect of Longxuetongluo Capsule (龍血通絡(luò)膠囊) on isoproterenol (ISO)-induced myocardial ischemia in rats.Wistar rats were randomly divided into control group, model group, Di’ao Xinxuekang (62.50 mg/kg) group and Longxuetongluo Capsule low-, medium- and high-dose (103.12, 206.25, 412.50 mg/kg) groups, with 10 rats in each group. Each group was ig corresponding medication for 28 consecutive days. After 1 h of administration on 27th and 28th days, except for the control group with physiological saline, all other groups were sc ISO (150 mg/kg). The hearts of rats were collected and heart weight index was calculated 48 h after the first subcutaneous injection of ISO; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of myocardial tissues in each group; The levels of creatine kinase (CK), creatine kinase-MB (CK-MB), cardiac troponin-I (cTn-I) were detected by ELISA; The activities of lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and aspartate aminotransferase (AST) and level of malondialdehyde (MDA) in serum were detected by kit; TUNEL staining was used to observe the apoptosis of cardiomyocytes in rats; The expressions of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), heme oxygenase-1 (HO-1) and cleaved cystein-asparate protease-3 (cleaved Caspase-3) in myocardial tissue were detected by immunohistochemistry.Compared with control group, heart weight index of rats in model group was significantly increased (< 0.001), levels of cTn-I, CK-MB, CK, MDA and activities of LDH, AST in serum were significantly increased (< 0.001), SOD activity in serum was decreased (< 0.001); Obvious pathological changes were observed in myocardial tissue (< 0.001), cardiomyocyte apoptosis rate was increased (< 0.001); The expressions of cleaved Caspase-3, Nrf2 and HO-1 proteins in myocardial tissue were up-regulated (< 0.05, 0.001). Compared with model group, heart weight index of rats in Longxuetongluo Capsule group was significantly decreased (< 0.001), levels of cTn-I, CK-MB, CK, MDA and activities of LDH, AST in serum were significantly decreased (< 0.05, 0.01, 0.001), SOD activity was significantly increased (< 0.001); The pathological changes of myocardial tissue were ameliorated (< 0.05); The cardiomyocyte apoptosis rate in myocardial tissue was significantly decreased (< 0.01); The expression of cleaved Caspase-3 in myocardial tissue was significantly decreased (< 0.05, 0.01), the expressions of Nrf2 and HO-1 in myocardial tissue were significantly increased (< 0.01, 0.001).Longxuetongluo Capsule can ameliorate ISO-induced myocardial ischemia injury in rats, and its mechanism may be related to the regulation of Nrf2/HO-1 pathway, thereby inhibiting oxidative stress-induced apoptosis.

Longxuetongluo Capsule; myocardial ischemia; oxidative stress; cell apoptosis; nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1 pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)20 - 6712 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.015

2023-06-20

2021年國家中醫(yī)藥管理局岐黃學(xué)者項目（國中醫(yī)藥人教函[2022]6號）

楊沛勛，男，碩士研究生，研究方向為中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail: yangpeixun2751@163.com

通信作者：肖 偉，中國工程院院士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥新藥研發(fā)及過程質(zhì)量控制。E-mail: kanionlunwen@163.com

范小雪，女，主管藥師，研究方向為藥物篩選與藥效評價。E-mail: 13914779902@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]