何慶元，劉 麗，孫 武，朱軍軍，惠 雪，朱浩波，徐榮華

栝樓SRAP引物篩選及遺傳多樣性分析

何慶元1，劉 麗1，孫 武2，朱軍軍2，惠 雪1，朱浩波1，徐榮華1*

1. 安徽科技學(xué)院，安徽 鳳陽 233100 2. 潛山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，安徽 潛山 246300

分析不同來源栝樓資源群體的遺傳結(jié)構(gòu)和自然亞群間基因漂移分析以及資源的遺傳多樣性，為栝樓育種奠定基礎(chǔ)。從100對相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）引物中篩選出擴(kuò)增效果好、穩(wěn)定性高的43對引物對13個來源于3個自然亞群的栝樓資源進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行不同亞群間和品種之間的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性分析。共擴(kuò)增出691個位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)百分率達(dá)到79.16%，整個群體的多態(tài)性信息含量（polymorphic information content，PIC）、觀察等位基因數(shù)（observing the number of alleles，N）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，N）、香農(nóng)信息指數(shù)（Shannon information index，）和遺傳距離（genetic distance，）依次為0.495 5、1.791 6、1.374 6、0.359 4和0.231 6，3個自然亞群中其他野生類群的遺傳豐富度最高，潛山和合肥自然亞群之間的遺傳相似度高，達(dá)到0.922 9。親緣關(guān)系類群體間的群間分化系數(shù)（intergroup differentiation coefficient，）平均為0.265 6，類群間基因流（gene flow，N）平均為1.382 6，遺傳分化系數(shù)較大，不同自然亞群間具有一定的基因交流，但不同位點(diǎn)基因交換的差異很大。13個品種資源被分成2個亞群，2個長萼栝樓地方品種單獨(dú)組成一個亞群，其他11個雙邊栝樓資源被聚為另一個亞類，2個亞群遺傳相似性系數(shù)僅為60.94%，福建野生型與安徽育成品種相似性較低，四川野生型相似性較高，說明四川野生型已被大量應(yīng)用于安徽栝樓育種。栝樓種質(zhì)資源之間有較大的遺傳相似性，不同自然亞群的栝樓種質(zhì)資源之間有一定的基因交流。

栝樓；長萼栝樓；雙邊栝樓；SRAP；遺傳分化；遺傳多樣性

栝樓Maxim.是葫蘆科栝樓屬多年生攀緣型草本植物。在我國各地均有分布和種植，栝樓根和皮具有清熱、潤肺、化痰、散結(jié)、滑腸的功效，是我國常用中藥材，栝樓籽是良好的保健休閑食品，因此栝樓具有很高的綜合開發(fā)和經(jīng)濟(jì)價值[1]。栝樓屬植物有80多種[2]，我國產(chǎn)約40多種，多數(shù)已被栽培利用，并且不同的栝樓以＝11為染色體基數(shù)，有2、4、6和8倍（22、44、66和88）不同倍性，但當(dāng)前栽培栝樓主要是4倍體栝樓（44），雌雄不同株的異花授粉植物，其遺傳基礎(chǔ)較為復(fù)雜[3-4]。而從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生化同工酶水平上雖有少量關(guān)于栝樓的遺傳研究，但分類受到環(huán)境條件影響較大。從DNA水平上選用一種高效的分子標(biāo)記技術(shù)研究栝樓的種質(zhì)資源，將為栝樓遺傳改良和育種應(yīng)用打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。目前應(yīng)用于栝樓遺傳多樣性評價的分子標(biāo)記有隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）[5]和間隔簡單重復(fù)多態(tài)性（interval simple repeat polymorphism，ISSR）[6]和ITS序列[7]的鑒定。

SRAP標(biāo)記技術(shù)針對基因組的開放閱讀框（open reading frame，ORFs）外顯子富含GC序列和內(nèi)含子富含AT設(shè)計正反向引物進(jìn)行特異擴(kuò)增，無需基因組參考信息即可實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增檢測，具有操作簡便、穩(wěn)定、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)[8]，已被廣泛應(yīng)用于油菜、花生、黃瓜、辣椒、結(jié)縷草、多花黑麥草和苜蓿等植物的遺傳多樣性和遺傳圖譜構(gòu)建等研究[9-12]，但應(yīng)用于栝樓的研究還鮮有報道。

由于栝樓是雌雄異株植物，長期異花授粉和無性繁殖，導(dǎo)致品種退化和混雜，不同品種之間遺傳關(guān)系不清，致使栝樓產(chǎn)業(yè)陷入停滯不前的困局。因此加強(qiáng)栝樓品種的遺傳研究，為栝樓品種選育和復(fù)壯奠定基礎(chǔ)，達(dá)到提質(zhì)增效目的。本研究選用當(dāng)前13個安徽地區(qū)育成品種及相關(guān)野生種質(zhì)栝樓品種資源，通過SRAP研究不同資源之間的遺傳關(guān)系，為明確不同品種之間的遺傳關(guān)系，促進(jìn)栝樓合理引種及育種利用提供依據(jù)。

1 材料與試劑

材料為13個安徽育成及相關(guān)野生栝樓品種，由安徽科技學(xué)院徐榮華副教授鑒定為Hayata和雙邊栝樓Harms，其來源、產(chǎn)地和自然群、種類和主要形態(tài)特征見表1。SRAP分析引物（上下游各10個）由通用生物（安徽）股份有限公司合成（表2）、Taq酶和dNTPs等購自索萊寶生物有限公司。

表1 供試的栝樓品種及產(chǎn)地和類群

表2 SRAP標(biāo)記的引物序列

2 方法

2.1 DNA的提取

取各栝樓品種幼嫩葉片，液氮研磨成粉末，經(jīng)改良CTAB法提取總基因組DNA[13]，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得清晰條帶，用紫外分光光度計測定濃度和質(zhì)量，于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 SRAP反應(yīng)及引物篩選

PCR體系為10 μl，包括25 ng的DNA，0.6 U的Taq酶，3 pmol上下游引物，0.6 mmol的dNTPs，20 pmol的MgCl2和1 μL的10×buffer。SRAP-PCR反應(yīng)程序按94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性1 min、35 ℃退火1 min、72℃延伸1 min、5個循環(huán)，接著94 ℃、1 min，50 ℃、1 min，72 ℃、1 min、再進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min，12 ℃保存。以皖簍17號和皖簍18號DNA作為模板對100對引物組合進(jìn)行篩選，按上述反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增篩選，選擇擴(kuò)增效果好的引物進(jìn)行遺傳多樣性鑒定。

2.3 凝膠電泳檢測

擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性丙烯酰胺凝膠電泳檢測，200 V電泳約1.2 h。電泳結(jié)束后凝膠銀染顯色，用0.1%的AgNO3染色約10 min、經(jīng)蒸餾水漂洗2次，在顯影液（16 g/L氫氧化鈉＋甲醛10.8 ml/L）中顯色至條帶清晰可見為止。

2.4 數(shù)據(jù)獲取與分析

2.4.1 居群內(nèi)遺傳多樣性分析 將13個栝樓品種資源上擴(kuò)增的條帶按通過人工統(tǒng)計帶型，將同一個水平線上有帶的標(biāo)記為“1”，無條帶處標(biāo)記為“0”表示進(jìn)行基因分型。將13個品種分為3個自然群，分別為潛山地區(qū)自然群（5個），合肥育成自然群（4個）和其他野生自然群（4個）。計算總?cè)后w和3個自然群的總等位位點(diǎn)數(shù)（total number of alleles，TNB），多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（number of polymorphic loci，NPB），多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)百分比（percentage of polymorphic alleles，PPB）。用軟件Popgene version1.31[14]計算觀察等位基因數(shù)（observing the number of alleles，a）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，e）、多態(tài)性信息含量（polymorphic information content，PIC）、香農(nóng)信息指數(shù)（Shannon information index，）和遺傳距離（j）。

2.4.2 居群間遺傳變異，基因漂移分析 用Popgene32軟件計算不同群體之間的Nei’s遺傳距離（GD）和遺傳一致度（genetic identity，GI）、基因流（gene flow，m）、群間分化系數(shù)（st）以及居群之間的遺傳相關(guān)性，并用MEGA4.0.2轉(zhuǎn)化為樹狀圖。

2.4.3 品種資源的遺傳結(jié)構(gòu)分析 利用NTSYSpc 2.1軟件進(jìn)行相似性分析，并利用非加權(quán)組平均法（unweighted pair group with mathematic average，UPGMA）對供試栝樓品種資源進(jìn)行聚類分析，將結(jié)果轉(zhuǎn)化為樹狀圖譜。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA質(zhì)量分析

提取的栝樓基因組DNA電泳檢測只有1條帶，說明所提取的DNA具有良好的完整性，紫外分光光度計檢測，其260/280的值在1.5～1.8，可用作為SRAP的模板。

3.2 引物的篩選結(jié)果分析

上下游各10個引物，組合成100對引物以皖簍17號和皖簍18號DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，篩選出在2個品種上擴(kuò)增效果好，穩(wěn)定性較好的43對引物（圖1）。

3.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

用篩選出的43對效果好的引物對13個栝樓品種資源進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后獲得相應(yīng)多區(qū)分度良好。其中AW75305F～AW75295R這對引態(tài)性圖譜，共擴(kuò)增出691個位點(diǎn)，條帶清晰，帶型物擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)最多，擴(kuò)增出29個位點(diǎn)，其次是AW75302F～AW75291R這對引物能擴(kuò)增出26個位點(diǎn)，最少的是AW75303F～P0814P1H10R這對引物僅擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)最少，僅擴(kuò)增出7個位點(diǎn)。從整體看，SRAP每對引物獲得的位點(diǎn)數(shù)多，擴(kuò)增的位點(diǎn)多態(tài)性高，分辨區(qū)分度良好，可以作為栝樓遺傳分析標(biāo)記。圖2是AW75304F～AW75298R擴(kuò)增的圖譜。

圖1 皖簍17號和皖簍18號部分SRAP引物篩選電泳圖

電泳圖中泳道序號與表1序號所對應(yīng)品種資源一致

3.4 類群內(nèi)遺傳多樣性分析

將13個品種分為3類群，從表3中看出整個群體有較高的多態(tài)性，標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性百分率達(dá)到79.16%，、a、e、和依次為0.495 5、1.791 6、1.374 6、0.359 4和0.231 6。其中野生型品種類群資源遺傳多樣性最高，其標(biāo)記平均達(dá)到57.45%、PIC為0.498 8、a為1.574 5、e為1.363 9、為0.317 2和為0.213 1都最高，合肥育成的品種類群的遺傳多樣性最低，標(biāo)記位點(diǎn)多態(tài)性也最低。

3.5 類群間的遺傳結(jié)構(gòu)和基因漂移分析

從表4可以看出，自然群間具有一定的遺傳一致度（GI≥0.866 9），自然群間遺傳距離（GD）均小于0.142 8，說明不同自然群間從進(jìn)化來源一致性較高，當(dāng)前所收集的栝樓不同群體間遺傳相似性較高，特別是安徽合肥和潛山的類群遺傳相似性達(dá)到0.922 9。從聚類圖（圖3）和表4上可知，潛山和合肥育成品種之間的遺傳一致性很高，遺傳距離較近，說明安徽當(dāng)前栽培選育的栝樓品種遺傳基礎(chǔ)較為狹窄。而不同地區(qū)來源的野生栝樓和安徽本地的遺傳距離較遠(yuǎn)，具有較大的遺傳差異，能夠拓寬栝樓育種的遺傳基因，具有較高的育種價值。

從自然群之間的基因流和基因分化來看，親緣關(guān)系地方群體間的群體間分化系數(shù)（st）平均為 0.265 6，說明不同自然群間存在較多的雜交，不同位點(diǎn)上最小為0.001 6，最大為1.000。自然群間m平均為1.382 6，位點(diǎn)之間最小為0.088 5，最大為303.545 5?？梢钥吹借闃穷惾哼z傳分化系數(shù)較大，不同自然群間具有一定的基因交流，但不同位點(diǎn)間差異很大。

3.6 品種資源的遺傳結(jié)構(gòu)分析

13個栝樓品種資源的聚類分析結(jié)果見圖4，從圖中可以看出，13個品種資源被分成2個亞群，2個長萼栝樓品種與其他栝樓品種資源遺傳相似性系數(shù)僅僅為60.94%，它們單獨(dú)組成1個亞群，與其他栝樓品種的遺傳差異最大，但在內(nèi)部2個長萼栝樓地方品種的相似性較高，兩者相似性達(dá)到82.92%。其余11個品種被分成另外一個亞群，其中福建野生栝樓與其他品種遺傳相似系數(shù)最小，僅為70.33%，其次是天寶2號與其他栝樓品種遺傳相似性差異較大，相似系數(shù)為71.92%。皖簍9號和皖簍17之間的遺傳相似性最高，達(dá)到85.82%。從圖中可以看出，天寶2號雄株與皖簍9號和17以及潛山野生型相似性更高，而四川野生型與皖簍20和皖簍9號籽生資源從遺傳上被聚類在1個亞群中。天寶2號雌株和雄株之間也遺傳差異較大，因此選育栝樓品種要同時考慮雌株和雄株的遺傳背景，從栝樓遺傳相似性可以看出安徽所選育的栝樓品種遺傳相似性較高，而四川和福建的野生品種同時也被聚類在一起，特別是四川野生種質(zhì)資源，其基因已大量摻入，可能是其已被安徽栝樓育種廣泛應(yīng)用。

表3 栝樓類群內(nèi)遺傳多樣性指標(biāo)

表4 類群間的GI和GD

GI（上三角）和GD（下三角）

GI (above diagonal) and GD (below diagonal)

圖3 基于Nei’s遺傳距離類群聚類圖

圖4 13個栝樓品種資源的SRAP分析聚類樹狀圖

4 討論

4.1 SRAP用于栝樓遺傳多樣性分析適用性

SRAP作為一種不需要參考基因組序列信息的高效、快速分子標(biāo)記，已被廣泛用于各類大田作物、園藝、草坪和中草藥的遺傳多樣性及分子圖譜的構(gòu)建[9-12,15-17]，然而迄今還很少有栝樓的SRAP研究報道[18]。本研究選取上下游各10條SRAP引物，組成100對擴(kuò)增引物，通過篩選，獲得了43對穩(wěn)定擴(kuò)增的引物，條帶清晰，帶型區(qū)分度良好，標(biāo)記位點(diǎn)在13個種質(zhì)資源上多態(tài)性百分率達(dá)到79.16%，說明SRAP標(biāo)記適用于栝樓遺傳多樣性分析。

4.2 栝樓的遺傳多樣性

栝樓是異化授粉，雌雄異株植物，而栝樓以無性繁殖為主，通過雜交獲得種子，多采用集團(tuán)選擇，選育的品種具有高度的雜合性，并且品種內(nèi)部不同單株之間同樣存在遺傳背景差異，迄今為止，對瓜蔞遺傳多樣性研究還不多，孫稚穎等[5]采用了RAPD技術(shù)研究了山東栝樓的遺傳多樣性、高燕會等[6]采用ISSR研究了34份瓜蔞種質(zhì)資源的遺傳多樣性、呂澤芳等[7]采用ITS序列研究了湖北及西南地區(qū)瓜蔞遺傳多樣性，但都沒有分析不同來源地的起源進(jìn)化關(guān)系。本研究從每個品種資源上隨機(jī)選取3個單株進(jìn)行混合取樣，建立DNA樣品池，確保所用基因組能夠代表品種資源的群體基因型。所用的43對SRAP引物所獲得的691個等位基因信息表明為0.495 5，類群內(nèi)的值變化較小。說明栝樓品種資源之間具有較高的遺傳多樣性。并且3個自然群間具有較高的遺傳一致性（≥0.866 9），較小的遺傳差異（≤0.142 8），特別是合肥自然群和潛山自然群之間一致性很高，差異很小，這說明當(dāng)前安徽所選育的瓜蔞品種其來源遺傳基礎(chǔ)還比較狹窄，而其他野生型與這2個自然群之間具有較高的遺傳差異，可以通過引入這些野生種質(zhì)資源拓寬安徽栝樓育種的種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)。從品種資源的遺傳聚類結(jié)果看，不同地域來源的品種資源聚類結(jié)果并不在同一個遺傳類群中，并且不同居群之間的基因流較大，說明不同栝樓之間存在較大的基因交換，符合異交作物的遺傳特征。但11個雙邊栝樓品種資源與2個長萼栝樓（TGX和TGD）之間存在較大的遺傳差異，2個種間存在一定的生殖障礙，鮮有將2個種進(jìn)行雜交育種，并獲得成功的先例。當(dāng)前栝樓的基因型與表型之間的關(guān)系研究還較少，構(gòu)建栝樓遺傳圖譜，乃至如大田作物一樣進(jìn)行QTL定位和關(guān)聯(lián)定位，利用標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇是栝樓未來育種的方向，也是分子標(biāo)記利用的最終方向[19]。

4.3 栝樓種質(zhì)資源的保護(hù)與利用

先前的育種實(shí)踐表明，異交作物，如玉米通過自交或者近交，獲得純合基因型，淘汰不利等位基因，獲得優(yōu)良的純合自交或近交系，再雜交往往能夠獲得巨大的產(chǎn)量和抗性增益[20]。然而當(dāng)前，栽培的栝樓品種大多數(shù)通過野生品種馴化選育獲得，以無性繁殖為主，經(jīng)多年栽培種植，品種退化，異花授粉導(dǎo)致品種混雜，而育種上多采用集團(tuán)選擇，還沒有進(jìn)行系統(tǒng)的系譜選育。通過分子標(biāo)記鑒定栝樓種質(zhì)資源遺傳特性，為創(chuàng)制和選育新品種奠定基礎(chǔ)。本研究選用了2個類型的栝樓種，兩者之間的遺傳差異較大，利用SRAP分子標(biāo)記鑒定了不同種質(zhì)資源遺傳上的相似性，為進(jìn)一步的系譜選育選擇親緣關(guān)系最近的雌雄單株構(gòu)建姊妹近交系，加快創(chuàng)制出純合度高的栝樓遺傳研究材料和育種中間品系，為選育出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和抗逆的新品種奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Primer screening of SRAP reaction system and analysis on genetic diversity of

HE Qing-yuan1, LIU li1, SUN Wu2, ZHU Jun-jun2, HUI Xue1, ZHU Hao-bo1, XU Rong-hua1

1. Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China 2. Qianshan Agricultural Science Research Institute, Qianshan 246300, China

To analyze the genetic structure, gene drift and genetic diversity of theresources from different sources within and among natural groups, so as to lay a foundation forbreeding.A total of 43 pairs of sequence-related amplified polymorphism (SRAP) primers with good amplification effect and high stability were screened from 100 pairs of SRAP primers to amplify 13resources from three natural groups, the genetic structure and diversity between genetic groups and varieties were analyzed.A total of 691 loci were amplified, of which the percentage of polymorphic loci reached 79.16%. The polymorphic information content (PIC)the number of observed alleles (N), the number of effective alleles (), the Shannon information index () and the genetic distance () of the whole population were 0.495 5, 1.791 6, 1.374 6, 0.359 4 and 0.231 6, respectively. The genetic richness of other wild groups was the highest in the three natural groups. The genetic similarity between Qianshan and Hefei natural groups was higher, reaching 0.922 9. The intergroup differentiation coefficient () between the genetic groups was 0.265 6, and gene flow (N) between the groups was 1.382 6. The coefficient of genetic differentiation was large. There was certain gene exchange between different groups, but the difference of gene exchange was very large in different loci. The 13 varieties resources were divided into two genetic subgroups. The two wild resources ofwere clustered into one subgroup separately, and the other 11resources were clustered into another subgroup. The genetic similarity coefficient of the two subgroups was only 60.94%. The similarity between wild resource from Fujian and Anhui resources was low, and the similarity between wild resource from Sichuan was high, indicating that Sichuan wild resource has been widely used in Anhuibreeding.There is greater genetic similarity between different germplasm resources, and there is a certain gene exchange between different groups of germplasm resources.

Maxim.;Hayata;Harms; sequence-related amplified polymorphism; genetic differentiation; genetic diversity

R286.12

A

0253 - 2670(2023)20 - 6813 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.024

2023-02-10

安徽省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（202104a06020029）；安徽勝教育廳重大項(xiàng)目（2023AH040279）；國家自然基金項(xiàng)目（32101704）；大學(xué)生創(chuàng)新課題（202210879102，S202210879310）

何慶元（1978—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参镞z傳育種。E-mail: heqingyuan1@163.com

通信作者：徐榮華（1979—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参锓肿舆z傳。E-mail: xrh96@163.com

[責(zé)任編輯 時圣明]