付亞亭,郭冬陽,吳清發(fā)

(中國科學技術(shù)大學 生命科學學院,合肥 230027)

南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black streaked dwarf virus,SRBSDV)屬于斐濟病毒屬,是一種無包膜的二十面體病毒,其基因組由10個雙鏈RNA片段組成[1-2]。SRBSDV由白背飛虱專一性傳播,灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)可以攜帶SRBSDV,但不能傳播病毒,褐飛虱(Nilaparvatalugens)既不能攜帶病毒也不能傳播病毒[3-4]。白背飛虱以持久增殖型方式傳播SRBSDV[5],這意味著在白背飛虱取食帶毒水稻后,病毒需克服白背飛虱的天然免疫屏障,完成從消化道入侵、組織擴增并最終回到唾液腺的巡回過程,才能進一步傳播[6-7]。因此,研究SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)的侵染、復制、擴散等過程的機制,對發(fā)展有效手段來控制病毒傳播至關(guān)重要。

病毒入侵細胞的一種主要方式是通過內(nèi)吞作用進入細胞[8-9],在這種作用方式下,病毒與宿主細胞膜受體識別并形成受體-配體復合物,使膜受體分子構(gòu)象發(fā)生改變,從而使受體-配體復合物向胞漿凹陷(凹陷側(cè)富含網(wǎng)格蛋白),并最終與細胞膜脫離形成囊泡,囊泡與胞漿中的內(nèi)體融合后,進一步與溶酶體融合,導致內(nèi)容物被降解,病毒釋放進入細胞質(zhì)[10-11]。借助網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞途徑進入宿主細胞的病毒有很多,如水皰性口炎病毒 (VSV) 和水稻矮縮病毒(RDV)等[12-15]。

組織蛋白酶D(CathD)是天冬氨酸型肽鏈內(nèi)切酶,在細胞自噬和內(nèi)吞通路中起著水解蛋白質(zhì)的重要作用[16]。研究報道呼腸孤病毒進入小鼠成纖維細胞需要內(nèi)體中天冬氨酸CathD,抑制CathD的活性可有效減少呼腸孤病毒的復制[17]。SRBSDV是呼腸孤病毒科成員,目前對SRBSDV通過內(nèi)吞作用進入白背飛虱細胞后的釋放機制尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型白背飛虱在人工氣候箱飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件為溫度26 ℃,濕度60%,12 h光照12 h黑暗交替循環(huán)。水稻品種為秈稻TN1。攜帶SRBSDV的水稻病株為華南農(nóng)業(yè)大學周國輝教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 白背飛虱顯微注射

本實驗所用到的雙鏈RNA(dsRNA)由T7 transcription kit (TOYOBO,Japan)體外轉(zhuǎn)錄制備。用于合成CathD dsRNA的模板DNA引物是P1:T7-TGTTGCAGCTAAATTCGACG,P2:T7-AGGTCCGACAATGAGA-CTGG,用于合成GFP dsRNA的模板DNA引物是P1:T7-ACGTAAACGGCCACAAGTTC,P2:T7-TGTTCTGCTGGTAGTGGTCG。實驗選擇2～3齡的白背飛虱若蟲用于注射dsRNA,注射部位為白背飛虱胸部中足以及后足之間的外側(cè)表皮處。在顯微注射時,首先用適量CO2麻醉飛虱;隨后用毛筆將飛虱若蟲在注射平板上排成一行,這樣利于快速注射;設(shè)置顯微注射儀(EPPENDORF)的參數(shù)為注射壓強1 300 hPa,注射時間0.3 s,補償壓10 hPa;向每只白背飛虱若蟲注射20～30 nL dsRNA。注射完成后將白背飛虱若蟲分裝在直徑3 cm,高9.5 cm的小管中,管內(nèi)裝有在濕潤的廚房用紙上生長的新鮮水稻苗,用尼龍網(wǎng)封住管口,每管若蟲不超過30頭。注射24 h后,收集5頭白背飛虱,提取總RNA,用于下游的qRT-PCR等分子生物學實驗。

1.2.2 白背飛虱獲毒試驗方法

顯微注射CathD基因的dsRNA到2～3齡白背飛虱若蟲體內(nèi),注射濃度5 μg/μL,注射體積20～30 nL,同期對照組白背飛虱注射GFP基因的dsRNA。注射完畢后將白背飛虱若蟲轉(zhuǎn)移至裝有健康水稻苗的小管中觀察,24 h后將實驗組白背飛虱和對照組白背飛虱轉(zhuǎn)移至攜帶SRBSDV病毒的水稻苗飼喂,48 h后將飼喂完畢的飛虱若蟲轉(zhuǎn)移至生長有健康水稻苗的組培罐中培養(yǎng),每罐可容納飛虱若蟲不超過100頭。在飼毒后潛伏期第4天、第8天和第12天分別收集各組白背飛虱20～30只,分別提取每只飛虱的總RNA,RT-PCR檢測白背飛虱飼毒后的帶毒比率,qRT-PCR檢測白背飛虱在飼毒后潛伏期第4天的病毒帶毒量(圖1)。

圖1 白背飛虱獲毒試驗流程圖

1.2.3 果蠅S2細胞dsRNA干擾以及病毒侵染實驗

制備果蠅dmCathD基因的dsRNA方法同上。用于合成dmCathD的 dsRNA的模板DNA引物是P1:T7-TCACCTACTTGCCCGTTACC,P2:T7-CCGGACAGACAG-ATGGTCTT,用于合成Ago2和β-gal基因dsRNA的DNA模板引物參考文獻[18-19]。果蠅S2細胞培養(yǎng)在加有體積分數(shù)分別為10%滅活血清和1%雙抗的昆蟲完全培養(yǎng)基(Sigma)中,待細胞生長到對數(shù)期,收集果蠅S2細胞懸液,1 400 r/min離心5 min后棄去上清液,使用不添加抗生素和血清的培養(yǎng)基將細胞重懸至細胞密度為1.5×106mL-1。將8 μg dsRNA使用250 μL無菌水稀釋后加至12孔細胞培養(yǎng)板(CORNING),然后加入500 μL重懸的S2細胞輕輕混勻,25 ℃饑餓處理30 min后,每孔中加入1 mL的完全培養(yǎng)基,最后補加血清至終含量為10%。48 h后向每孔中加入稀釋到105濃度的病毒200 μL,培養(yǎng)48 h后即可檢測S2細胞的病毒復制情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 dsRNA干擾后白背飛虱的存活曲線

通過注射dsRNA到白背飛虱體內(nèi)敲低CathD基因表達水平,然后飼喂SRBSDV病毒后,觀察到dsCathD組在潛伏期第4天已經(jīng)有部分白背飛虱羽化為成蟲,在潛伏期第8天已經(jīng)全部長成成蟲,與對照組白背飛虱相比無形態(tài)和發(fā)育異常。存活曲線顯示,敲低CathD的白背飛虱在獲毒后的生存率與對照組白背飛虱相比沒有明顯差異(log-rank檢驗),見圖2。結(jié)果表明沉默表達CathD的白背飛虱在飼喂SRBSDV病毒后對白背飛虱的發(fā)育和生存沒有明顯影響。

ns為差異不顯著。

2.2 dsRNA干擾CathD基因后白背飛虱帶毒率降低

注射dsRNA 24 h后提取5只白背飛虱的總RNA并進行qRT-PCR,結(jié)果顯示CathD基因的mRNA表達水平下調(diào)至對照組的13.8%[圖3(a)]。在帶毒水稻苗飼毒2 d后,將實驗組和對照組白背飛虱轉(zhuǎn)移到健康苗培養(yǎng),并在SRBSDV潛伏期第4天、第8天和第12天分別收集20～30只白背飛虱,提取單只試蟲的總RNA。RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射dsGFP的白背飛虱在第4天、第8天和第12天的帶毒比率分別為80.9%、81.7%和79.2%,而注射dsCathD的白背飛虱在SRBSDV潛伏期的第4天、第8天和第12天的帶毒比率分別為64.0%、69.2%和61.7%[圖3(b)]。

(a)白背飛虱顯微注射dsRNA 24 h后CathD基因的干擾效率(以RP-L4為內(nèi)參進行標準化處理);(b)沉默CathD的白背飛虱在飼毒后潛伏期第4天、第8天和第12天的帶毒比率;(c)沉默CathD的白背飛虱在飼毒后潛伏期第4天的平均帶毒量(以RP-L4為內(nèi)參進行標準化處理)。(a)～(c)展示了兩次獨立實驗的平均值和誤差值,顯著性分析結(jié)果由t檢驗獲得(* 為P<0.05,** 為P<0.01,**** 為P<0.000 1,ns為差異不顯著)。

2.3 dsRNA干擾CathD基因后白背飛虱帶毒量降低

沉默表達CathD的白背飛虱在飼喂SRBSDV病毒后,通過qRT-PCR檢測病毒在白背飛虱體內(nèi)的復制水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SRBSDV潛伏期第4天的平均病毒復制量明顯下調(diào),dsCathD組的SRBSDV的RNA相較dsGFP組下調(diào)至32.2%[圖3(c)],進一步證明CathD蛋白具有協(xié)助SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)復制的作用,我們猜測CathD蛋白可能是通過內(nèi)吞作用機制協(xié)助病毒在白背飛虱體內(nèi)的擴散增殖。

2.4 CathD在果蠅細胞中具有協(xié)助DCV病毒復制的作用

為了檢測CathD蛋白幫助病毒復制的機制是否保守,選擇在果蠅S2細胞水平上進行dsRNA敲除實驗。RNAi通路是果蠅主要的抗病毒通路,Argonaute-2(Ago2)蛋白參與RNA誘導沉默復合體(RISC)的形成,RISC可以切割病毒RNA,斷裂的病毒RNA被進一步降解,從而達到抑制病毒的作用。Ago2蛋白是已經(jīng)鑒定的具有抗DCV病毒復制功能的蛋白[20-21],本研究選擇Ago2蛋白作為陽性對照。結(jié)果顯示,相較陰性對照dsβ-gal組,CathD基因和Ago2基因的mRNA表達水平分別下調(diào)至16.7%和31.4%[圖4(a)],敲低果蠅S2細胞CathD基因的表達沒有觀察到對S2細胞形態(tài)和細胞增殖的任何影響。隨后進行DCV的侵染,48 h后收集S2細胞提取總RNA開展qRT-RCR檢測。實驗結(jié)果顯示,與陰性對照組dsβ-gal相比,敲低果蠅S2細胞中陽性對照Ago2基因后,DCV的mRNA水平上調(diào)約2.3倍,而敲低CathD基因后,DCV的mRNA水平下調(diào)至對照組的0.34倍,說明CathD在果蠅細胞中具有幫助DCV復制的作用,這和白背飛虱在成蟲水平的實驗結(jié)果一致[圖4(b)]。

3 討論與結(jié)論

許多病毒依賴內(nèi)吞作用進入宿主細胞,如水皰性口炎病毒 (VSV) 和水稻矮縮病毒(RDV)等[12-14]。RDV病毒粒子的外殼蛋白P2從病毒粒子表面伸出,與昆蟲介體細胞表面受體相接觸,從而通過內(nèi)吞作用進入宿主細胞[14,22]。SRBSDV與RDV都屬于感染水稻的呼腸孤病毒,其病毒粒子也擁有類似突出狀結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)對病毒粒子侵入宿主細胞具有十分重要的作用[23],但目前對SRBSDV通過內(nèi)吞作用進入白背飛虱細胞內(nèi)的釋放機制尚不清楚。

CathD蛋白是溶酶體中的酸性蛋白水解酶。本研究證明敲低白背飛虱細胞內(nèi)CathD基因的表達水平,會降低SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)的帶毒率和帶毒量,表明CathD蛋白有助SRBSDV從細胞內(nèi)體/溶酶體中釋放進入細胞質(zhì)。已知果蠅DCV病毒是通過依賴網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用進入果蠅細胞[24],研究結(jié)果表明敲低果蠅CathD基因的表達也會降低DCV在果蠅細胞的復制水平。這些結(jié)果表明CathD促進病毒從細胞內(nèi)體/溶酶體中釋放進入細胞質(zhì)機制可能是保守的,可以作為防控SRBSDV病害的潛在靶標分子。我們計劃進一步研究CathD蛋白在白背飛虱侵染SRBSDV時發(fā)揮作用的分子機制。