青島膠州大白菜根腐病病原菌鑒定及其生物防治

宋雨萌，劉文杰，宗茂，羅蘭

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院/山東省植物病蟲害綠色防控工程研究中心，山東青島 266109)

大白菜起源于中國(guó)，是我國(guó)第二大蔬菜，在均衡市場(chǎng)供應(yīng)、穩(wěn)定蔬菜價(jià)格等方面具有重要作用[1]。 大白菜因其含有多種維生素、礦物質(zhì)及纖維素而具有保健作用[2]。 膠州大白菜為我國(guó)地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品，青島常年種植面積約為全市蔬菜總面積的16%，因其具有獨(dú)特品質(zhì)而深受人們喜愛[3-4]。 但隨著大白菜種植面積增大和復(fù)種指數(shù)提高，生產(chǎn)中常常受到多種有害生物的危害，如霜霉病[5]、黑斑病[6-7]及根腫病[8-9]等，對(duì)大白菜生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

大白菜根腐病是由多種病原菌侵染引起的土傳真菌病害，對(duì)白菜產(chǎn)量造成很大影響。 常見的病原菌有瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)[10]、蕓薹腐霉(Pythium brassicum)[11]和多種鐮刀菌(Fusariumspp.)[12]。 明確病原菌種類對(duì)其防治具有十分重要的意義。 本試驗(yàn)對(duì)山東青島膠州大白菜主要產(chǎn)區(qū)的根腐病病原菌進(jìn)行分離、鑒定，研究生物藥劑對(duì)其防治效果，為其綠色防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病樣:大白菜根腐病病樣于2019 年10月在青島膠州西安家溝村大白菜研究所基地采集，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離。

供試培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 ～20 g，蒸餾水1 000 mL)。

供試試劑:DNA 提取試劑盒、DNA Marker(100～2 000 bp)、引物ITS1 和ITS4、引物TEF1 和TEF2、TaqDNA 聚合酶、dNTP 等均為上海生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

供試大白菜品種為“膠白一號(hào)”，種子由青島膠州大白菜研究所提供。

供試藥劑:3 億CFU/g 哈茨木霉菌可濕性粉劑、100 億CFU/g 枯草芽孢桿菌可濕性粉劑均為美國(guó)拜沃股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大白菜根腐病病原菌的分離與純化 采用組織分離法對(duì)大白菜根腐病病菌進(jìn)行分離[13]。取發(fā)病的大白菜根部病塊，用75%乙醇處理30 s、無菌水沖洗3 次后吸干水分置于PDA 平板上，再放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，待出現(xiàn)菌落后進(jìn)行純化，4 ℃保存?zhèn)溆谩?對(duì)大白菜根腐病樣本進(jìn)行多次病原菌分離共獲得兩種分離物，分別編號(hào)為BCGF1 和BCGF2。

1.2.2 大白菜根腐病病原菌的形態(tài)學(xué)觀察 將分離到的菌株接種到PDA 培養(yǎng)基上，置于28 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察菌落特征。 挑取適量病原菌菌絲制片鏡檢，觀察其分生孢子形態(tài)，參照文獻(xiàn)[14-15]中的方法對(duì)分離到的病原菌進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.3 大白菜根腐病病原菌的分子生物學(xué)鑒定

利用上海生工生物工程(上海)股份有限公司DNA 快速抽提試劑盒對(duì)分離的病原菌進(jìn)行基因組DNA 提取，并以此為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4(5′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3′)[16]、TEF1(5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)和TEF2(5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′[17]。PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。 將獲得的序列進(jìn)行BLASTn 比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果選擇同源性較高的序列及標(biāo)準(zhǔn)菌株，采用UPGMA 法運(yùn)用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。

1.2.4 大白菜根腐病病原菌的致病性測(cè)定 采用土壤接種法進(jìn)行致病性測(cè)定[13]。 先將分離到的菌株配成1×107個(gè)/mL 的孢子液，按每株5 mL灌注到健康的大白菜幼苗根部，共接種5 株，以無菌水為對(duì)照，2 周后觀察幼苗發(fā)病情況。 對(duì)發(fā)病幼苗進(jìn)行組織分離，與接種的菌株比對(duì)鑒定。

1.2.5 大白菜根腐病的生物防治 采用盆栽法測(cè)定生防菌劑對(duì)大白菜根腐病的防治效果[18]。用麥粒培養(yǎng)基分別培養(yǎng)BCGF1 和BCGF2 菌株。待其產(chǎn)孢后，用無菌水配成孢子懸浮液。 采用灌根法按每杯接入10 mL 濃度105CFU/g 土孢子液(BCGF1 和BCGF2 各5 mL)培育1 d 后，將培育至2 片真葉的白菜幼苗移栽至接種致病菌的小杯中(1 株/杯)，用微生物殺菌劑哈茨木霉菌WP 200 倍液和枯草芽孢桿菌WP 500 倍液按每杯10 mL 灌根，同時(shí)設(shè)不接枯萎病菌和只接枯萎病菌為陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。 每處理10 株，重復(fù)3 次。正常管理，20 d 后調(diào)查各處理白菜幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重及發(fā)病情況并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[19-20]。

病情指數(shù)(%)＝Σ(各級(jí)病株數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí))×100 。

防治效果(%)＝(空白對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/空白對(duì)照病情指數(shù)×100 。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜根腐病的田間發(fā)病癥狀

大白菜根腐病苗期和成株期均可發(fā)病。 發(fā)病初期，生長(zhǎng)緩慢，葉片褪綠，后期整株萎蔫(圖1A)，似缺水狀。 病株與未發(fā)病株相比，須根少至無(圖1B)。 剖開根部，維管束變褐(圖1C)。

圖1 大白菜根腐病癥狀

2.2 大白菜根腐病病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

菌株BCGF1 和BCGF2 接種到PDA 平板28℃培養(yǎng)7 d 后，菌落直徑均為45 mm。 BCGF1 菌落突起絮狀，菌絲白色質(zhì)密(圖2A)；BCGF2 菌落淺粉略帶紫色，菌絲較稀疏(圖2B)。 鏡檢可觀察到小型、大型分生孢子和厚垣孢子。 其中，大型分生孢子為彎月形或鐮刀形，2 ～9 個(gè)隔膜，多數(shù)為3個(gè)隔膜，大小為(20.6 ～36.5) μm×(2.5 ～5.8)μm(n ＝20)，見圖2C、D；小型分生孢子多為單細(xì)胞，形狀有卵形、橢圓形、腎形等，大小為(4.3 ～10.2)μm×(2.4～4.5) μm(n ＝20)。 分生孢子著生于從菌絲伸出的產(chǎn)孢細(xì)胞上(圖2E、F)。 厚垣孢子為圓形或卵圓形，壁光滑或有突起，絕大多數(shù)無色、少色，直徑為3.5～9.8 μm。 根據(jù)病原菌的形態(tài)特征并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[14-15]，初步鑒定菌株BCGF1和BCGF2 均為鐮刀菌(Fusariumspp.)。

圖2 大白菜根腐病病原菌菌落與分生孢子形態(tài)特征

2.3 大白菜根腐病病原菌分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)測(cè)序，菌株BCGF1 和BCGF2 的ITS 序列分別為547 bp 和548 bp。 根據(jù)NCBI 中BLASTn比對(duì)結(jié)果，菌株BCGF1 和BCGF2 的ITS 序列與尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum，登錄號(hào)為KJ774041.1 和MF460362.1)的序列相似度均為100.00%。 經(jīng)測(cè)序，菌株BCGF1 和BCGF2 的tef序列分別為656 bp 和676 bp。 菌株BCGF1 的tef序列與F. oxysporum(登錄號(hào)為HE801565.1)的序列相似度為99.36%，菌株BCGF2 的tef序列與F.oxysporum(登錄號(hào)為HE801565.1)的序列相似度為99.70%。 根據(jù)比對(duì)結(jié)果，下載與目標(biāo)菌株相關(guān)的同源序列，利用Mega 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，菌株BCGF1 和BCGF2 的ITS 序列與尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)在同一分支上，具有較高同源性，相似度100%(圖3A)。 菌株BCGF1 和BCGF2 的tef序列與尖孢鐮刀菌F. oxysporum在同一分支上，具有較高同源性，相似度99.36%(圖3B)。 結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定菌株BCGF1 和BCGF2 屬于尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)。

圖3 菌株BCGF1 和BCGF2 的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 大白菜根腐病病原菌致病性測(cè)定

采用土壤接種法進(jìn)行致病性測(cè)定。 大白菜栽培方式為草炭蛭石基質(zhì)盆栽。 接種5 mL 濃度1×107個(gè)/mL 的孢子菌懸液，以灌入等量無菌水為對(duì)照。 接種7 d 后開始發(fā)病，BCGF1 和BCGF2 均使大白菜幼苗發(fā)病。 與未接菌植株相比較，初期表現(xiàn)為葉片萎蔫發(fā)黃，生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重的枯萎死亡(圖4A、B)。 拔出還未死亡的病苗發(fā)現(xiàn)根部受害明顯，根部發(fā)黑，須根很少(圖4C)。 未接菌植株根部，須根多且未變色(圖4D)。 發(fā)病癥狀與田間大白菜萎蔫病發(fā)病癥狀一致。 從發(fā)病部位重新分離病原菌，得到的分離物與接種菌株形態(tài)學(xué)和基因序列相同，符合柯赫氏法則，證明所接菌株為大白菜根腐病的致病菌。

圖4 土壤接種法測(cè)定苗期根腐病菌致病性

2.5 大白菜根腐病的生物防治

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，生防菌劑對(duì)大白菜根腐病均有一定的防治效果。 哈茨木霉菌和枯草芽孢桿菌WP 灌根處理20 d 后，病情指數(shù)分別為32.56%和33.82%，均顯著低于病原菌接菌對(duì)照處理的96.67%，清水對(duì)照未發(fā)病。 哈茨木霉菌WP和枯草芽孢桿菌WP 的防治效果分別為66.32%和65.02%(表1)。 由此表明，上述兩種生防菌劑對(duì)大白菜根腐病具有較好的防治效果。 另外，經(jīng)生防菌劑處理的大白菜幼苗鮮重、株高和根長(zhǎng)與接種根腐病菌大白菜的幼苗差異顯著，尤其是枯草芽孢桿菌WP 對(duì)大白菜生長(zhǎng)有一定的促生作用，其鮮重與未接菌幼苗和哈茨木霉菌WP 處理差異顯著。

表1 生防菌劑對(duì)盆栽大白菜根腐病的防治效果

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)分離自大白菜根腐病植株的病原菌進(jìn)行顯微形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定、接種驗(yàn)證和致病性測(cè)定，明確青島膠州大白菜根腐病由尖孢鐮孢菌(F. oxysporum)侵染引起。 這一結(jié)論與閆文雪等報(bào)道的結(jié)果相符，而與山東濟(jì)南及青島白菜萎蔫病和根腐病是由瓜果腐霉菌(P. aphanidermatum)和蕓薹腐霉(P. brassicum)侵染引起的結(jié)論不同[10-11]。 本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于該病害的防控具有十分重要的指導(dǎo)意義。

鐮刀菌是一種能夠危害多種作物的病原真菌。 研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌可侵染多種作物導(dǎo)致其發(fā)生枯萎死亡[21]。 枯萎病是大白菜生產(chǎn)中的一種重大病害，主要危害根部維管束組織，且產(chǎn)生真菌毒素造成整株枯萎死亡，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重制約著大白菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展。 目前生產(chǎn)上對(duì)枯萎病主要還是采用化學(xué)防治，但由于化學(xué)殺菌劑使用所致作物抗藥性及環(huán)境污染等問題，生物菌劑愈來愈受到人們的關(guān)注[22-23]，其以諸多優(yōu)勢(shì)而在病害防治中被廣泛應(yīng)用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，哈茨木霉和枯草芽孢桿菌WP 對(duì)大白菜枯萎病具有較好的防治效果，相對(duì)防效分別為66.32%和65.02%。 哈茨木霉和枯草芽孢桿菌WP 處理的大白菜幼苗鮮重、株高和根長(zhǎng)與接菌對(duì)照相比顯著增加，枯草芽孢桿菌WP對(duì)大白菜鮮重的促生作用更優(yōu)。 該結(jié)論可為大白菜根腐病的綠色防控提供重要參考。