李肖沙，劉瑩，申炳俊，金麗虹，夏冰

（1.長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022；2.杭州隆基生物技術(shù)有限公司，杭州 311121）

甲胎蛋白（Alpha-Fetal Protein，AFP）是白蛋白家族中一種糖蛋白，其分子量約為67～70 kDa。1956 年，Bergstrand 等人［1］首先在胎兒的臍帶血清中發(fā)現(xiàn)了AFP，之后Abelev 等人［2］證實(shí)了AFP 主要來(lái)源于胚胎卵黃囊和胎盤(pán)。1968 年，Tatarinov［3］在肝癌患者血清中檢測(cè)到了大量AFP。自此以后，AFP 作為一種重要的血清腫瘤標(biāo)志物，被廣泛應(yīng)用于原發(fā)性肝癌、睪丸、卵巢腫瘤早期診斷以及胎兒先天畸形排查等臨床檢測(cè)領(lǐng)域［4］。由于成人血清AFP 含量極低，如何低檢測(cè)限、寬線(xiàn)性范圍進(jìn)行血清AFP 定量檢測(cè)，具有重要的臨床意義。

AFP 從發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)發(fā)展了多種檢測(cè)方法，如放射免疫分析法［5］、熒光免疫分析法［6］、酶聯(lián)免疫吸附法［7］、化學(xué)發(fā)光免疫分析法［8］、電化學(xué)免疫傳感器［9］和電化學(xué)適配體傳感器等［10］。適配體（Aptamer，Apt）是一種人工篩選出來(lái)的單鏈DNA 或RNA 分子［11-12］，它能夠高特異性和高親和力與靶標(biāo)結(jié)合，過(guò)程類(lèi)似抗原-抗體的結(jié)合反應(yīng)。然而，適配體本身不具有信號(hào)指示作用，以適配體分子為識(shí)別元件的傳感器需要結(jié)合可識(shí)別信息，如電、光、熱、質(zhì)或聲等［13-14］。熒光適配體傳感器兼具熒光檢測(cè)的高靈敏性和適配體傳感器的高選擇性，還具有精度高、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)生物傳感器的重點(diǎn)發(fā)展方向之一［15-16］。

本文以聚乙二醇化石墨烯量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體（GQDs-PEG-Apt）作為信標(biāo)探針，利用載有四氧化三鐵納米顆粒的二硫化鎢納米片（WS2/Fe3O4）對(duì)單鏈適配體的吸附作用、熒光猝滅能力以及磁分離性質(zhì)，構(gòu)建一種GQDs/WS2/Fe3O4磁分離適配體熒光傳感器并用于AFP 定量檢測(cè)，原理如圖1 所示。從聚乙二醇鈍化石墨烯提高其熒光性能、磁分離WS2/Fe3O4納米復(fù)合物吸附GQDs-PEG-Apt 降低熒光背景值兩方面，來(lái)提高傳感器檢測(cè)AFP 線(xiàn)性范圍及檢測(cè)限。根據(jù)AFP 含量對(duì)體系中能量供體與受體間非輻射共振能力轉(zhuǎn)移（Forster Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET）效應(yīng)引起熒光信號(hào)恢復(fù)信息，建立一種寬線(xiàn)性范圍、低檢測(cè)限的AFP 定量檢測(cè)方法。

圖1 GQDs/WS2/Fe3O4 磁分離適配體熒光傳感器檢測(cè)AFP 原理

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

瀝青基碳纖維購(gòu)自日本東麗；二硫化鎢粉末、乙酰丙酮鐵購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；聚乙二醇（NH2-PEG-NH2）購(gòu)自于芃碩生物科技公司；1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；meso-2，3-二巰基琥珀酸（DMSA）購(gòu)自上海阿拉丁；其他試劑均購(gòu)自北京化工；甲胎蛋白（AFP）、糖蛋白19-9（CA19-9）、糖蛋白242（CA242）和人血清白蛋白（HSA）均購(gòu)自于上海領(lǐng)潮生物科技公司；適配體（Apt，5?-COOH-TAG ATATGGCAGGAAGACAAACAAGCTTGGCGGCGGG AAGGTGTTTAAATTCCCGGGTCTGCGTGGTCTGTG GTGCTGT-3?）購(gòu)自上海生工。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GQDs-PEG-Apt 制備及表征

首先，制備羧基化GQDs（GQDs-COOH），采用自上而下法制備GQDs，檸檬酸孵育使GQDs 表面引入羧基，得到GQDs-COOH，調(diào)節(jié)溶液pH 值，透析袋透析，濃縮后冷凍干燥。其次，制備PEG功能化GQDs（GQDs-PEG），EDC/NHS 法進(jìn)行PEG功能化GQDs，微孔膜過(guò)濾大團(tuán)聚體，得到小粒徑GQDs-PEG。最后，制備PEG 功能化GQDs 標(biāo)記的適配體（GQDs-PEG-Apt），EDC/NHS 法使適配體5'端羧基與GQDs-PEG 氨基進(jìn)行偶聯(lián)，產(chǎn)物GQDs-PEG-Apt 溶液采用超濾離心管進(jìn)行純化和濃縮。實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要避免GQDs 發(fā)生光漂白。

1.2.2 WS2/Fe3O4納米復(fù)合物制備及表征

首先，采用水熱合成法制備WS2納米片，得到的固體用超純水充分洗滌，分散在乙醇中固體，超聲、離心，上清液為WS2納米片溶液。然后，溶劑熱合成法制備Fe3O4納米顆粒，與DMSA孵育，獲得DMSA 修飾的Fe3O4納米顆粒。最后，制備WS2/Fe3O4納米復(fù)合物，DMSA 修飾WS2納米片和Fe3O4納米顆粒孵育，獲得WS2/Fe3O4納米復(fù)合物。

1.2.3 GQDs/WS2/Fe3O4磁分離適配體熒光傳感器熒光猝滅條件優(yōu)化

一定量WS2/Fe3O4納米復(fù)合物溶液和200 μL的GQDs-PEG-Apt 溶液孵育，摸索孵育溫度、時(shí)間、pH 值和WS2/Fe3O4納米復(fù)合物投入量對(duì)GQDs/WS2/Fe3O4磁分離適配體熒光傳感器性能影響。熒光測(cè)量條件為：熒光發(fā)射譜波長(zhǎng)（λem）范圍為400～600 nm，激發(fā)波長(zhǎng)（λex）固定為359 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫為10 nm/5 nm。

1.2.4 AFP 檢測(cè)條件優(yōu)化

GQDs-PEG-Apt 與WS2/Fe3O4納米復(fù)合物構(gòu)成的GQDs/WS2/Fe3O4磁分離適配體熒光傳感體系，黑暗條件下分別與0、2、10、50、100、300、500、800、1 000 和1 500 ng/mL 的AFP 抗體靶蛋白進(jìn)行孵育，摸索孵育溫度、時(shí)間、pH 值和靶蛋白投入量對(duì)pH 檢測(cè)影響。熒光測(cè)量條件同1.2.3 節(jié)。

1.2.5 血清AFP 檢測(cè)

腫瘤標(biāo)志物AFP、CA19-9 和CA242 加入到人血清中，利用GQDs/WS2/Fe3O4磁分離適配體熒光傳感體系進(jìn)行血清AFP 檢測(cè)，研究傳感器特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性等性能。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 功能化GQDs 制備及表征

由圖2（a）可見(jiàn)，羧基化GQDs（GQDs-COOH）呈現(xiàn)近圓形，分散性良好，平均粒徑約5 nm，GQDs 的晶格結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，晶格間距0.21 nm，與文獻(xiàn)［17］報(bào)道GQDs 的（002）晶面間距相吻合。PEG 功能化GQDs（GQDs-PEG）在乙醇中呈現(xiàn)類(lèi)方形聚集體，如圖2（b）所示，平均粒徑8 nm，較GQDs-COOH 粒徑有所增加，這應(yīng)與GQDs 表面羧基與PEG 氨基發(fā)生鍵合作用有關(guān)。

圖2 羧基化和聚乙二醇化石墨烯量子點(diǎn)的TEM和HRTEM

GQDs 進(jìn)行PEG 功能化前后最大激發(fā)和最大發(fā)射光譜如圖3 所示。GQDs-COOH 熒光激發(fā)（λex）和發(fā)射波長(zhǎng)（λem）分別為468 nm 和504 nm，斯托克斯位移為36 nm。PEG 功能化后GQDs 熒光強(qiáng)度顯著增高，359 nm 激發(fā)時(shí)，GQDs-PEG 在444 nm 和485 nm 兩波長(zhǎng)處出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰，485 nm 熒光峰強(qiáng)度略高于444 nm，斯托克斯位移為126 nm，λex和λem分別藍(lán)移109 nm 和60 nm。在可見(jiàn)光照射下，GQDs-COOH 呈現(xiàn)棕黃色、GQDs-PEG 則呈現(xiàn)淡黃色。365 nm 紫外光照射下，GQDs-COOH 發(fā)出藍(lán)綠色熒光，GQDs-PEG 則發(fā)出強(qiáng)藍(lán)色熒光。此外，放置時(shí)間對(duì)PEG 功能化前后GQDs 熒光強(qiáng)度影響有所差別，GQDs-COOH 溶液熒光強(qiáng)度隨著放置時(shí)間增加而逐漸降低，放置時(shí)間為20 天時(shí)，熒光強(qiáng)度降低43.2%，表明羧基化GQDs 在溶液中并不穩(wěn)定。而PEG 功能化GQDs，放置時(shí)間對(duì)其溶液熒光強(qiáng)度影響較小，即使放置30 天，GQDs-PEG 熒光強(qiáng)度變化不明顯，說(shuō)明PEG 功能化有利于提高了GQDs 熒光穩(wěn)定性。

圖3 石墨烯量子點(diǎn)PEG 化前后熒光光譜

2.2 WS2/Fe3O4 納米復(fù)合物制備及表征

WS2/Fe3O4納米復(fù)合物透射電鏡（TEM和HRTEM）如圖4 所示，其平均直徑在220±35 nm，WS2納米片則呈現(xiàn)不規(guī)則片狀形態(tài)。HRTEM 清晰地呈現(xiàn)0.62 nm 和0.253 nm 兩種晶格間距，分別對(duì)應(yīng)WS2的（002）和Fe3O4的（311）晶面結(jié)構(gòu)［18］。

圖4 WS2/Fe3O4 納米復(fù)合物TEM（標(biāo)尺20 nm）和HRTEM（標(biāo)尺5 nm）

2.3 GQDs/WS2/Fe3O4 磁分離適配體熒光傳感器可行性分析

WS2/Fe3O4納米復(fù)合物吸收光譜如圖5 藍(lán)色曲線(xiàn)，在370～680 nm 范圍內(nèi)該復(fù)合物存在吸收帶，吸收峰出現(xiàn)在648 nm。GQDs-PEG-Apt 熒光光譜（圖5 紅色曲線(xiàn)）與WS2/Fe3O4納米復(fù)合物吸收光譜有重疊，這是產(chǎn)生FRET 的前提條件。WS2/Fe3O4（100 μL，600 μg/mL）納米復(fù)合物加入到GQDs-PEG-Apt 體系后，其熒光強(qiáng)度被猝滅高達(dá)69.8%，如圖6 所示。因此，以適配體為AFP 分子識(shí)別元件、GQDs-PEG-Apt 為熒光探針構(gòu)建GQDs/WS2/Fe3O4磁分離適配體熒光傳感器是可行的。

圖5 WS2/Fe3O4吸收光譜和GQDs-PEG-Apt熒光光譜重疊

圖6 WS2/Fe3O4 對(duì)GQDs-PEG-Apt 熒光光譜影響

2.4 GQDs/WS2/Fe3O4 磁分離適配體熒光傳感器及AFP 檢測(cè)條件優(yōu)化

建立具有高熒光猝滅效率的FRET 檢測(cè)體系，對(duì)FRET 能量供體GQDs-PEG-Apt 與熒光猝滅劑WS2/Fe3O4納米復(fù)合物能量受體孵育條件進(jìn)行了優(yōu)化。WS2/Fe3O4納米復(fù)合物對(duì)GQDs-PEGApt 在487 nm 處熒光強(qiáng)度（IF）和熒光猝滅效率（QE=（I0-I）/I0，I0和I分別為WS2/Fe3O4加入前、后GQDs-PEG-Apt 熒光強(qiáng)度）影響如圖7 所示?？梢钥闯?，WS2/Fe3O4濃度在0～420 μg/mL 時(shí)，GQDs-PEG-Apt 在487 nm 處熒光強(qiáng)度隨WS2/Fe3O4濃度增加呈現(xiàn)先降低后增加趨勢(shì)，對(duì)熒光猝滅效率影響則相反。WS2/Fe3O4濃度為300 μg/mL 時(shí)，GQDs-PEG-Apt 在487 nm 處熒光強(qiáng)度和熒光猝滅率分別達(dá)到了最小值和最大值。GQDs-PEG-Apt熒光被猝滅原因在于，GQDs-PEG-Apt 與WS2/Fe3O4間π-π 堆積作用和FRET。

圖7 WS2/Fe3O4 對(duì)GQDs-PEG-Apt熒光強(qiáng)度和熒光猝滅率影響

孵育溫度、體系pH 值和孵育時(shí)間對(duì)GQDs/WS2/Fe3O4體系487 nm 處熒光強(qiáng)度和熒光猝滅率影響結(jié)果如圖8 所示?？梢钥闯?，孵育溫度為37 ℃時(shí)，GQDs/WS2/Fe3O4體系487 nm 熒光強(qiáng)度最低，37 ℃是構(gòu)建傳感器GQDs-PEG-Apt 與WS2/Fe3O4最佳孵育溫度。pH 值在6.0～8.6 范圍內(nèi)，各GQDs/WS2/Fe3O4體系間熒光猝滅率間差異不大，但pH值會(huì)改變適配體空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響GQDs-PEG-Apt 與靶受體AFP 間特異性結(jié)合和結(jié)合常數(shù)。此外，AFP 的檢測(cè)樣本為血清，為此采用生理環(huán)境7.4 為傳感器體系構(gòu)建pH 值。孵育時(shí)間在25 min 時(shí)，WS2/Fe3O4對(duì)GQDs-PEG-Apt 在487 nm熒光猝滅程度最大，25 min 為兩者間的最佳孵育時(shí)間。

圖8 孵育溫度、體系pH 值和孵育溫度對(duì)GQDs/WS2/Fe3O4 熒光強(qiáng)度和熒光猝滅率影響

GQDs/WS2/Fe3O4體系構(gòu)建條件為：WS2/Fe3O4投入量300 μg/mL，GQDs-PEG-Apt 與WS2/Fe3O4間孵育溫度、pH 值和孵育時(shí)間分別為37 ℃、7.4 和45 min。

2.5 AFP 檢測(cè)線(xiàn)性范圍、靈敏度及特異性

GQDs/WS2/Fe3O4體系在487 nm 處熒光強(qiáng)度隨AFP 濃度增加而增大，以AFP 濃度（CAFP）為橫坐標(biāo)、熒光相對(duì)恢復(fù)值（ΔIF=I1-I2，I1和I2是加入AFP 前后的熒光強(qiáng)度）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性擬合，其結(jié)果如圖9 所示。可以看出，濃度在5～1 000 ng/mL 范圍內(nèi)，CAFP和ΔIF具有良好的線(xiàn)性相關(guān)性，其線(xiàn)性方程為y= 4.000 036x+363.771 46（R2=0.977 53）。根據(jù)這一結(jié)果，可獲得3 倍SD（3SD）下，GQDs/WS2/Fe3O4熒光適體傳感器檢測(cè)AFP 的最低檢測(cè)限（LOD）為0.5 pg/mL。

圖9 AFP 濃度與體系487 nm 處熒光恢復(fù)值線(xiàn)性關(guān)系

AFP、PSA 和HSA 濃度為1 000 ng/mL、CA19-9和CA242 濃度為1 000 U/mL。分別以AFP、CA242、CA19-9、PSA 和HSA 為靶標(biāo)，考察不同檢測(cè)物對(duì)磁分離適配體熒光傳感體系熒光恢復(fù)率（增強(qiáng)）的影響，結(jié)果如圖10 所示?？梢钥闯?，文中構(gòu)建的傳感體系中加入AFP 后，可顯著提高熒光強(qiáng)度，而CA242、PSA 和HSA 對(duì)體系熒光增強(qiáng)效果不明顯。原因是傳感器中的適配體僅能特異性識(shí)別AFP，并與之結(jié)合。因此，GQDs/WS2/Fe3O4磁分離熒光增強(qiáng)型適配體傳感可用于AFP 的特異性檢測(cè)。

圖10 干擾物對(duì)GQDs/WS2/Fe3O4 磁分離適配體熒光傳感體系熒光恢復(fù)率影響

與現(xiàn)有AFP 檢測(cè)方法相比，文中構(gòu)建的GQDs/WS2/Fe3O4磁分離適配體熒光傳感器對(duì)AFP 檢測(cè)線(xiàn)性范圍更寬，達(dá)到5～1 000 ng/mL；檢測(cè)限（LOD）更低，其值為0.5 pg/mL。文獻(xiàn)所述方法［19-25］與本文方法的性能比較結(jié)果如表1 所示。

表1 用于腫瘤標(biāo)志物AFP 檢測(cè)的不同方法的性能比較

2.6 血清AFP 定量檢測(cè)

磁分離熒光增強(qiáng)型適配體傳感檢測(cè)AFP（10、20 和50 ng/mL）血清樣本結(jié)果（n=3）、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和回收率如表2 所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AFP 的RSD 在3.32%～6.41%，回收率為91.92%～99.28%。因此，傳感器適用于實(shí)際血清樣本AFP 的測(cè)定。

表2 血清腫瘤標(biāo)志物AFP 加標(biāo)真實(shí)樣品的回收率

3 結(jié)論

文中制備了具有藍(lán)色熒光性能GQDs 和磁分離WS2/Fe3O4納米復(fù)合物，基于適配體特異性結(jié)合靶標(biāo)性質(zhì)和FRET 原理，以GQDs-PEG-Apt 作為AFP 特異性識(shí)別分子和能量供體，WS2/Fe3O4納米復(fù)合物為能量受體，構(gòu)建磁分離適配體熒光傳感器并檢測(cè)血清腫瘤標(biāo)志物AFP，明確傳感器構(gòu)建和AFP 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果顯示，GQDs/WS2/Fe3O4磁分離適配體熒光傳感器定量檢測(cè)AFP 線(xiàn)性范圍為5～1 000 ng/mL，檢測(cè)限為0.5 pg/mL。構(gòu)建的傳感器實(shí)現(xiàn)了血清中AFP 定量檢測(cè)，其具有特異性好、靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、低檢測(cè)限和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。更重要的是，文中建立的GQDs/WS2/Fe3O4磁分離適配體熒光傳感體系還為其他糖蛋白生物標(biāo)記物等定量檢測(cè)提供了技術(shù)理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，在臨床血液腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)發(fā)展空間。