葡萄糖氧化酶在單胃動(dòng)物減抗中的應(yīng)用及制劑工藝改進(jìn)初探

韓永剛，陳建春，徐慶安，李安鵬

(1.漢中市漢臺(tái)區(qū)畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心，陜西 漢中 723000；2.陜西省南鄭區(qū)畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心，陜西 南鄭 723100；3.漢中市漢臺(tái)區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，陜西 漢中 723000；4.漢中市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊(duì)，陜西 漢中 723000）

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，E.C.1.1.3.4，GOD），又稱為β-D- 葡萄糖氧化還原酶，是用金黃色青霉菌進(jìn)行深層通風(fēng)發(fā)酵，精制而得。用點(diǎn)青霉和黑曲霉也可以制得。葡萄糖氧化酶廣泛用于葡萄酒、啤酒、果汁等食品脫氧、面粉改良、防止食品褐變等方面，在食品快速檢測及生物傳感器上也廣泛應(yīng)用。由于微生物生長繁殖快、來源廣，是生產(chǎn)GOD的主要來源，主要生產(chǎn)菌株為黑曲霉和青霉。

1 GOD 的抗氧化作用機(jī)制

GOD 在有氧條件下能專一性地催化β-D- 葡糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，消耗分子氧或原子氧氧化葡萄糖，保護(hù)食品中的易氧化成分。按反應(yīng)條件GOD 催化反應(yīng)有3 種形式；

（1）沒有過氧化氫酶存在時(shí)，每氧化1 mol 葡萄糖消耗1 mol 氧；

（2）有過氧化氫酶存在時(shí)，每氧化1 mol 葡萄糖消耗1/2 mol 氧；

（3）有乙醇及過氧化氫酶存在時(shí)，過氧化氫酶可用于乙醇的氧化，每氧化1 mol 葡萄糖消耗1 mol 氧；

GOD 對(duì)β-D- 葡萄糖表現(xiàn)出強(qiáng)烈的特異性，葡萄糖分子C(1)上的羥基對(duì)酶的催化活性至關(guān)重要，且羥基處于β 位時(shí)的活性要比在α 位時(shí)高約160 倍。葡萄糖氧化酶對(duì)L- 葡萄糖和2-O- 甲基-D- 葡糖則完全沒有活性。

2 GOD 的酶學(xué)性質(zhì)

高純度GOD 為淡黃色晶體，易溶于水，可制成液體制劑。 GOD 完全不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有機(jī)溶劑。 GOD 相對(duì)分子質(zhì)量在1.5×105左右，含2 分子黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。pH 作用范圍3.5～6.5，最適pH 5.0 左右，在沒有保護(hù)劑存在的條件下pH ＞8.0 或pH ＜3.0 時(shí)會(huì)迅速失活。GOD 的作用溫度范圍為30～60 ℃。固體酶制劑在0 ℃下至少可保存2 年，-15℃下可保存8 年。

3 葡萄糖氧化酶（GOD）對(duì)動(dòng)物的有益作用

3.1 清除分子氧應(yīng)用于動(dòng)物時(shí)酶（GOD）的催化作用是使消化道內(nèi)分子氧減少，有利于腸道厭氧環(huán)境的維持，促進(jìn)厭氧有益菌的生長。

3.2 酸化作用胃腸道的pH 會(huì)影響蛋白酶原轉(zhuǎn)化為蛋白酶的過程及消化酶的活性，進(jìn)而影響飼糧的消化率。葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖生成的產(chǎn)物葡萄糖醛酸（GA）是一種有機(jī)弱酸，可作為益生元改變腸道菌群，其經(jīng)微生物繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸（SCFA）可以進(jìn)一步降低腸道pH；葡萄糖醛酸（GA）在體外系統(tǒng)中可調(diào)節(jié)盲腸菌群，增加SCFA 的產(chǎn)生，降低氨的濃度。

3.3 體外試驗(yàn)證明葡萄糖氧化酶（GOD）對(duì)多種致病細(xì)菌、真菌都有抑菌作用。且對(duì)一些植物病原菌引起的植物病害也有預(yù)防和治療效果。該抑菌原理主要是依靠催化反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫完成，通過引起細(xì)胞質(zhì)過氧化、干擾細(xì)胞內(nèi)電子傳遞系統(tǒng)、破壞蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)或損傷遺傳物質(zhì)等方式影響細(xì)菌和真菌的正常生理功能。

3.4 葡萄糖氧化酶（GOD）在動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果

3.4.1 改善生產(chǎn)性能 在斷奶仔豬、哺乳母豬、肉雞、肉鴨日糧中添加60～200 U/kg 的葡萄糖氧化酶（GOD）可以提高動(dòng)物的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）,料重比（F/G）進(jìn)而提高整體的飼料轉(zhuǎn)化率。同時(shí)改善肉禽肉質(zhì)。

3.4.2 改善繁殖性能 李嘉輝等研究表明產(chǎn)蛋后期蛋種雞飼料添加350～500 mg/kg 葡萄糖氧化酶（GOD）后，產(chǎn)蛋率、種蛋蛋殼厚度和哈氏單位顯著增加，料蛋比顯著降低；孫穎雪、Sun 等研究表明葡萄糖氧化酶（GOD）可以提高妊娠母豬后期平均采食量（ADFI）以及斷奶7d 發(fā)情率，降低母豬泌乳期背膘損失，并顯著提高斷奶時(shí)仔豬窩重。

3.4.3 改善機(jī)體免疫水平 飼料中添加適宜劑量的葡萄糖氧化酶（GOD）可以改變動(dòng)物的免疫器官指數(shù)、血或腸道中細(xì)胞因子（IFN-α、γ 干擾素、IL-2 白細(xì)胞介素）和抗體的含量或表達(dá)水平，由此改善機(jī)體的免疫水平。

3.4.4 改善腸道健康 葡萄糖氧化酶（GOD）可以改善腸道屏障功能，促進(jìn)受損的腸絨毛修復(fù)，進(jìn)而改善腸道形態(tài)；通過產(chǎn)生厭氧環(huán)境抑制有害菌繁殖，維持腸道菌群平衡。

添加葡萄糖氧化酶（GOD）還可以改善動(dòng)物抗氧化能力，緩解熱應(yīng)激、緩解動(dòng)物霉菌毒素中毒；陳成等的研究表明斷奶仔豬飼料中添加30 mg/kg 活性為1000 U/g 的葡萄糖氧化酶（GOD）可以替代3000 mg/kg 氧化鋅，經(jīng)濟(jì)效益顯著，且完全避免了鋅對(duì)環(huán)境的污染。

盡管葡萄糖氧化酶（GOD）對(duì)動(dòng)物具有以上諸多的有益效果，但酶活性在沒有保護(hù)劑存在的條件下，pH ＞8.0 或pH ＜3.0 時(shí)會(huì)迅速失活。而單胃動(dòng)物如體重30kg 以上的育肥豬、成年母豬、2 月齡以上的肉雞、肉鴨，產(chǎn)蛋雞等多種畜禽的胃液pH 值均在3 以下。其中成年豬胃液pH 值大多在1～2，2 月齡以上肉禽、蛋雞肌胃胃液pH 值大多在1.5～3，當(dāng)葡萄糖氧化酶（GOD）通過該段消化道時(shí)酶活性會(huì)顯著降低（30%～100%）甚至完全失活，且不可逆。進(jìn)而限制了葡萄糖氧化酶（GOD）上述動(dòng)物養(yǎng)殖中的使用。

4 葡萄糖氧化酶制劑工藝改進(jìn)

鑒于葡萄糖氧化酶酶學(xué)性質(zhì)的限制，在單胃動(dòng)物（特別是成年豬、禽）的日常應(yīng)用受到局限。為了提高葡萄糖氧化酶在上述動(dòng)物養(yǎng)殖中的使用效果，通過對(duì)葡萄糖氧化酶進(jìn)行腸溶包衣，制作出對(duì)動(dòng)物pH ＜3.0 胃液完全穩(wěn)定的腸溶型葡萄糖氧化酶微囊或腸溶固體分散體，以完全保護(hù)葡萄糖氧化酶的酶活性。該制劑工藝中通過在葡萄糖氧化酶中添加pH 5～5.5 的酸堿緩沖體系，為葡萄糖氧化酶在動(dòng)物腸道中發(fā)揮最大效能提供最優(yōu)pH 環(huán)境。制劑工藝主要解決了以下三個(gè)方面的技術(shù)問題：

4.1 通過在葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，E.C.1.1.3.4，GOD）中添加pH 5～5.5 的酸堿緩沖體系，制作出在動(dòng)物不同腸道中出穩(wěn)定酸堿環(huán)境，可以發(fā)揮最大酶催化功效囊芯材料。

4.2 對(duì)葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, E.C.1.1.3.4, GOD）囊芯材料進(jìn)行腸溶包衣，制成腸溶微囊，完全消除動(dòng)物胃液低pH 環(huán)境（pH ＜3.0）對(duì)葡萄糖氧化酶酶催化活性的影響甚至滅活效應(yīng)。

4.3 通過對(duì)包衣材料崩解條件的控制和動(dòng)物不同腸道內(nèi)環(huán)境pH 值相適應(yīng)，制作出在動(dòng)物十二指腸崩解葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, E.C.1.1.3.4,GOD）微囊，將葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, E.C.1.1.3.4, GOD）酶促氧化效能發(fā)揮到最大程度。

5 技術(shù)方案

5.1 腸溶微囊制劑工藝

5.1.1 pH 5～5.5 的酸堿緩沖體系的葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, E.C.1.1.3.4，GOD）囊芯構(gòu)造

5.1.1.1 囊芯材料及配比 材料：葡萄糖氧化酶，食品級(jí)；12 水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O），檸檬酸（C6H8O7）、化學(xué)純；可溶性淀粉，食品級(jí)。 按工藝要求比例進(jìn)行芯材材料配比。因均具有吸濕性，需干燥密封保存。

5.1.1.2 芯材處理工藝 要求生產(chǎn)環(huán)境相對(duì)濕度應(yīng)控制40%以下，保持通用環(huán)境溫度（20～25 ℃）；未包被芯材必須干燥密封保存。（1）緩沖體系預(yù)混合

緩沖體系磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）：檸檬酸（C6H8O7）按6.8:2 的比例在密閉容器內(nèi)進(jìn)行充分預(yù)混合。（2）芯材預(yù)混合 將葡萄糖氧化酶：緩沖體系預(yù)混合物：可溶性淀粉按100:8.8：12 的比例在密閉容器內(nèi)進(jìn)行充分預(yù)混合。（3）使用干法壓片制粒機(jī)，對(duì)上述芯材進(jìn)行反復(fù)壓片篩選制粒，顆粒大小控制在50～2000 μm 以內(nèi)。

5.1.2 芯材顆粒腸溶包衣工藝

5.1.2.1 腸溶包衣材料及配比 腸溶包衣材料包括：蟲膠，鄰苯二甲酸醋酸纖維素，硬脂酸鎂，均為化學(xué)純；聚乙二醇6000；丙酮，無水乙醇，化學(xué)純；按工藝要求，在要求的生產(chǎn)環(huán)境中對(duì)腸溶包衣材料按配比標(biāo)準(zhǔn)分別稱重配比、備用。

5.1.2.2 腸溶包衣材料預(yù)處理 先將丙酮、無水乙醇制成混合溶液，并攪拌均勻；順序加入蟲膠2.3份，鄰苯二甲酸醋酸纖維素6 份，攪拌70-90min，完全溶解后依次加入硬脂酸鎂0.2 份，聚乙二醇6000 1.5 份，攪拌溶解后備用。

5.1.2.3 芯材包衣，包衣工藝 將待包衣的芯材顆粒置入密封流化床中，通入氣流使芯材顆粒流化，將腸溶包衣材料混合溶液輸入流化床并霧化，使芯材顆粒表面粘附一層包衣材料，過濾回收系統(tǒng)持續(xù)抽走氣化的溶液溶劑，并通過冷凝液化系統(tǒng)回收混合溶液以持續(xù)使用。如法包衣若干層，至達(dá)到規(guī)定要求為止。

腸溶微囊成品要求：（1）囊芯材料腸溶包衣后增重控制在3.5%以內(nèi)；（2）腸溶包衣完全，成品腸溶微囊流動(dòng)性好；（3）腸溶微囊在pH ＜2.0 鹽酸溶液檢查2h，不得裂縫崩解或軟化，于pH 為6.8 的磷酸鹽緩沖液中1h 內(nèi)應(yīng)全部崩解；（4）檢查腸溶微囊崩解后酶活性不得低于包衣前的95%。

5.2 葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, E.C.1.1.3.4,GOD）固體分散體構(gòu)造

5.2.1 固體分散體材料及配比：

5.2.1.1 噴涂藥物材料準(zhǔn)備：葡萄糖氧化酶，、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、蟲膠，化學(xué)純；硬脂酸鎂、聚乙二醇6000 丙酮、無水乙醇，化學(xué)純；

5.2.1.2 材料配比：蟲膠2.4 份，鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素6 份，硬脂酸鎂0.1 份，聚乙二醇6000 1.5 份，丙酮50 份，無水乙醇60 份比例進(jìn)行材料配比。因均具有吸濕性，需干燥密封保存。

5.2.2 固體分散體處理工藝

固體分散體芯材載體為麥飯石或玉米芯（粒徑100～1000 um）必須干燥密封保存。

5.2.2.1 在工藝要求生產(chǎn)環(huán)境中將上述材料按配比標(biāo)準(zhǔn)分別稱重備用。

5.2.2.2 固體分散體藥物噴涂體系預(yù)混合 先將丙酮、無水乙醇制成混合溶液，并攪拌均勻；順序加入蟲膠、鄰苯二甲酸醋酸纖維素，攪拌70～90 min，完全溶解后依次加入硬脂酸鎂0.1 份，聚乙二醇6000 1.5 份，攪拌溶解后備用。

5.2.2.3 將葡萄糖氧化酶 （Glucose oxidase, E.C.1.1.3.4,GOD）攪拌均勻分散到腸溶分散體系的有機(jī)溶劑溶液中

5.2.2.4 固體分散體噴涂工藝 將待噴涂的芯材載體麥飯石或玉米芯顆粒置入密封流化床中，通入氣流使載體芯材顆粒流化，將葡萄糖氧化酶（GOD）腸溶有機(jī)溶劑混合溶液輸入流化床并霧化，使固體載體顆粒表面粘附一層腸溶有機(jī)溶劑混合溶液，過濾回收系統(tǒng)持續(xù)抽走氣化的溶液溶劑（丙酮、無水乙醇），而使顆粒表面不斷干燥，并通過冷凝液化系統(tǒng)回收混合溶液以持續(xù)使用。如法噴涂若干層，至達(dá)到規(guī)定要求為止。

5.2.2.5 葡萄糖氧化酶（GOD）腸溶固體分散體成品制劑要求：（1）載體材料腸溶噴涂包衣后增重控制在20～25%；（2）葡萄糖氧化酶（ GOD）腸溶混合溶液噴涂完全，固體分散體成品流動(dòng)性好；（3）腸溶固體分散體在pH ＜2.0 鹽酸溶液檢查2h，不得裂縫崩解或軟化，于pH 為6.8 的磷酸鹽緩沖液中1 h內(nèi)應(yīng)全部崩解溶出。（4）檢查固體分散體崩解后酶活性不得低于加工前的95%。

6 葡萄糖氧化酶腸溶微囊及固體分散體包衣結(jié)構(gòu)示意圖（見圖1 和圖2）

圖1 （1 葡萄糖氧化酶；2pH 緩沖體系；3 可溶性淀粉；4 囊芯顆粒；5 腸溶包衣材料）

圖2 （1 葡萄糖氧化酶；2 固體分散體載體；3 固體分散體腸溶藥物表層噴涂物）

7 葡萄糖氧化酶腸溶制劑工藝達(dá)到的效果

7.1 腸溶微囊和固體分散體借助腸溶包衣的保護(hù)，克服動(dòng)物（豬、禽）胃液（pH≤3）對(duì)葡萄糖氧化酶酶活性的滅活，使作用部位的酶活性保留在正常水平的95%上。拓寬了使用范圍，降低了酶使用量。

7.2 通過在腸溶微囊囊芯中加入pH5～5.5 緩沖體系，使微囊在腸道崩解后釋放出的葡萄糖氧化酶能夠處在發(fā)揮最佳酶活作用的酸堿pH 環(huán)境中，發(fā)揮最佳催化功效。

7.3 硬脂酸鎂增加了腸溶制劑的分散性，流動(dòng)性好，克服了酶添加量少，粉末細(xì)膩，在飼料介質(zhì)中分散攪拌不均勻的缺限。

7.4 酶通過包衣，減少與飼料直接接觸，克服了飼料中不同成分（金屬離子、脂肪酸、其他營養(yǎng)因子）對(duì)酶活性的影響。