貝萊斯芽孢桿菌BR-01菌株高產(chǎn)抗菌肽培養(yǎng)基的優(yōu)化及其抗菌肽的鑒定*

周健平,謝云巧,廖雨虹,李昕洋,李一鳴,李淑萍,馬修國(guó),雷詩(shī)敏,林 菲,

姜 偉2**,何勇強(qiáng)1,2**

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院,廣西南寧 530004;2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西大學(xué)),廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530004;3.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)),華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,廣東廣州 510642)

水稻(OryzasativaL.)是三大主要糧食作物之一,是全世界接近一半人口的主食,也是重要的工業(yè)原料之一[1]。水稻細(xì)菌性條斑病(Rice bacterial leaf streak)簡(jiǎn)稱條斑病,俗稱紅葉病,是由稻黃單胞菌稻生致病變種[水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xoc)]侵染引起的一種細(xì)菌性病害。水稻發(fā)病后,造成條形葉斑、葉尖枯,光合作用下降,影響谷粒灌漿,一般減產(chǎn)15%-25%,嚴(yán)重時(shí)可達(dá)40%-60%[2]。該病已經(jīng)成為我國(guó)黃河以南多個(gè)稻區(qū)的主要水稻病害之一,嚴(yán)重影響水稻的安全生產(chǎn)。Xoc屬于外來(lái)入侵物種,是我國(guó)重要的檢疫對(duì)象之一[3]。鑒于目前尚缺少高抗細(xì)菌性條斑病的水稻品種[3],該病的防控主要依靠農(nóng)業(yè)措施和化學(xué)防治。盡管化學(xué)防治以其方便、快速、效果顯著等特點(diǎn)在水稻病害防治中發(fā)揮著重要作用,然而許多化學(xué)制劑有不可忽視的副作用,如化學(xué)殘留物、環(huán)境污染和害蟲抗性,顯然不符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。而生物防治是一種可持續(xù)的、實(shí)用的植物病害管理方法,是水稻病害防治的一種很有前途的替代策略[4]。

芽孢桿菌是一種厭氧或兼性厭氧、桿狀、內(nèi)生孢子的細(xì)菌,廣泛分布于整個(gè)環(huán)境中,是水稻生產(chǎn)中常用的生物防治劑,一般通過產(chǎn)生抑菌蛋白或抗菌肽等發(fā)揮其生防作用[5,6]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Lx-11能夠產(chǎn)生表面活性素(Surfactin)、桿菌霉素(Bacillomycin)和豐原素(Fengycin) 3類脂肽類抑菌物質(zhì),盆栽實(shí)驗(yàn)證明Surfactin在控制Xoc侵染的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[7]。黃夢(mèng)桑等[8]從辣椒根際土壤中分離篩選到對(duì)Xoc和水稻白葉枯病菌(X.oryzaepv.oryzae,Xoo)具有拮抗活性的高地芽孢桿菌(B.altitudinis) 181-7。AntiSMASH軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,181-7菌株中含有多個(gè)抑菌活性代謝產(chǎn)物基因簇,包括地衣桿菌素(Lichenysin)、溶桿菌素(Bacilysin)、Fengycin、細(xì)菌素(Bacteriocin)等。貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis) 504對(duì)黃單胞菌屬的細(xì)菌具有較好的抑菌活性,基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,B.velezensis504含有fenA、dhbA、sfrAA、bmyA、beaS、dfnA及bacA等編碼脂肽類和聚酮糖類抑菌化合物的基因簇[5]。B.velezensis是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種[9]。研究表明,B.velezensis的許多菌株具有抑制水稻病原菌生長(zhǎng)和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的能力。這些能力在很大程度上依賴于其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,如環(huán)脂肽(Surfactin、Bacillomycin D、Fengycin等)和聚酮類化合物[大環(huán)內(nèi)酰亞胺(Macrolactin)、桿菌烯(Bacillaene)和地非西丁(Difficidin)等][10-12]。

生防菌從研究成果轉(zhuǎn)化為應(yīng)用產(chǎn)品需要階梯式的試驗(yàn)與開發(fā)。發(fā)酵是影響生防菌研究與應(yīng)用的重要因素,在微生物發(fā)酵過程中,不同的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件對(duì)其生長(zhǎng)速度、菌體量及抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)出等具有顯著影響。石慧敏等[13]通過優(yōu)化發(fā)酵工藝,使B.velezensisYH-18的芽孢產(chǎn)量較LB (Luria-Bertani)初始培養(yǎng)基提高9.48倍。張曉云等[14]使用熊果苷作為菌株B.subtilisBAB-1產(chǎn)Surfactin的碳源,其Surfactin產(chǎn)量達(dá)到以葡萄糖為碳源時(shí)的3倍。喬俊卿等[15]利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化菌株B.subtilist-500的產(chǎn)抗菌肽培養(yǎng)基后,成功檢測(cè)到菌株在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中不能生產(chǎn)的Fengycin。此外,即使是同一個(gè)種、屬的不同菌株,其最適發(fā)酵條件也往往因?yàn)榫瓴煌倪z傳背景、生理生化特性及環(huán)境適應(yīng)性而存在差異[16,17]。以近年來(lái)報(bào)道的B.velezensis菌株最適發(fā)酵條件為例,楊可[18]優(yōu)化B.velezensisTCS001菌株的最佳發(fā)酵條件為溫度25 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間36 h;黎燕珊等[16]報(bào)道B.velezensisHC-8菌株的最佳發(fā)酵條件為溫度37 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間48 h;郭艷霞等[19]研究發(fā)現(xiàn)B.velezensisYB19菌株的最適培養(yǎng)溫度和時(shí)間分別為32 ℃和28 h。目前,國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有許多關(guān)于生物防治水稻細(xì)菌性條斑病的研究,但是詳細(xì)的發(fā)酵條件研究還比較缺乏。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),從中藥材土貝母塊莖內(nèi)分離獲得的B.velezensisBR-01菌株對(duì)Xoc具有良好的拮抗效果,但還需要發(fā)酵數(shù)據(jù)支持下一步的研究與開發(fā)。本研究以B.velezensisBR-01菌株無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)Xoc的抑菌圈直徑為因變量,通過提高發(fā)酵濾液的抑菌活性來(lái)間接提高抗菌肽的濃度,并使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometer,LC-MS)技術(shù)鑒定抗菌肽,為該菌株進(jìn)一步的理論研究及后續(xù)的大田生防實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

水稻細(xì)菌性條斑病菌(X.oryzaepv.oryzicola)GX01,由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)BR-01菌株分離自中藥土貝母的塊莖組織,在前期的實(shí)驗(yàn)中已證明其對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病菌具有較好的拮抗效果,菌株由本實(shí)驗(yàn)室篩選、保存及鑒定。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:酵母提取物5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L;NB (Nutrient Broth)培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g/L、酵母提取物 1.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L;PDB (Potato Dextrose Broth)培養(yǎng)基:馬鈴薯浸粉3.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L;Landy培養(yǎng)基:L-谷氨酸5.0 g/L、酵母提取物1.0 g/L、L-苯丙氨酸2 mg/L、葡萄糖20.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.15 g/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L、MnSO45 mg/L;YSP (Yeast Sucrose Peptone)培養(yǎng)基:蛋白胨2.0 g/L、酵母提取物1.0 g/L、蔗糖4.0 g/L;CM (Complete Medium)培養(yǎng)基:葡萄糖5.0 g/L、(NH4)2SO42.0 g/L、檸檬酸鈉1.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、K2HPO44.0 g/L、KH2PO46.0 g/L;NYBD (Nutrient Yeast Beef Dextrose)培養(yǎng)基:牛肉膏8.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L。以上培養(yǎng)基的pH值控制在7.0-7.2,固體培養(yǎng)基額外添加1.5%瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液離體抑菌活性測(cè)定

以Xoc為指示菌,采用牛津杯法和十字交叉法測(cè)定B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液離體抑菌活性[20]。取4 ℃低溫離心后獲得的B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵上清液,通過孔徑0.22 μm的細(xì)菌過濾器得到無(wú)菌發(fā)酵濾液。為保證培養(yǎng)皿底部平整,首先在培養(yǎng)皿底部鋪一層1 mm厚度的水瓊脂,再放置牛津杯。將加熱融化的NB固體培養(yǎng)基冷卻至45 ℃,以0.5%的體積分?jǐn)?shù)加入108CFU/mL的指示菌液,搖晃均勻后倒入平皿中。冷卻后取出牛津杯,每孔加入0.1 mL無(wú)菌發(fā)酵濾液,以加入等量發(fā)酵培養(yǎng)基上清液為對(duì)照,重復(fù)3次處理。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d,觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.2B.velezensisBR-01菌株初始發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

從-80 ℃冰箱中取出B.velezensisBR-01甘油保藏菌液,分別接種到1.1.2節(jié)各初始固體培養(yǎng)基平板上。28 ℃培養(yǎng)48 h后,挑取單菌落接種至對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h。參照1.2.1節(jié)制備各初始培養(yǎng)基發(fā)酵濾液并測(cè)定其離體抑菌活性,各試驗(yàn)重復(fù)3次處理。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以1.2.2節(jié)最優(yōu)培養(yǎng)基為初始發(fā)酵培養(yǎng)基,通過改變各組分種類及濃度或設(shè)置不同的培養(yǎng)條件,試驗(yàn)各因素對(duì)B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液抑菌活性的影響,每次優(yōu)化后的結(jié)果進(jìn)入隨后的條件優(yōu)化試驗(yàn)。(1)碳源:將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源(酵母提取物)分別等質(zhì)量替換為玉米粉、淀粉、蔗糖、麥芽糖、糊精和葡萄糖,并調(diào)整最適碳源濃度。(2)氮源:將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源(蛋白胨)分別等質(zhì)量替換為花生餅粉、牛肉膏、酵母提取物、豆粕粉、胰蛋白胨、尿素,并調(diào)整最適氮源濃度。(3)無(wú)機(jī)鹽:在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加CaCl2、MgCl2、CaCO3、MnSO4、K2HPO4,添加量為0.1%(W/V),以不添加無(wú)機(jī)鹽為對(duì)照。(4)pH值:設(shè)置初始發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為4-9,設(shè)置6個(gè)梯度。(5)發(fā)酵時(shí)間:設(shè)置發(fā)酵時(shí)間為12-72 h,設(shè)置6個(gè)梯度。(6)溫度:設(shè)置搖床培養(yǎng)溫度為26-36 ℃,設(shè)置6個(gè)梯度。上述培養(yǎng)基配制后按每瓶100 mL分裝到250 mL三角瓶中,初始發(fā)酵條件為28 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h。參照1.2.1節(jié)制備各處理組發(fā)酵濾液并測(cè)定其離體抑菌活性,各試驗(yàn)重復(fù)3次處理。

1.2.4 Plackett-Burman (PB)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用Design-Expert 12軟件PB設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),以B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液抑菌圈直徑為響應(yīng)值,設(shè)置培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件中各個(gè)單因素的高(+1)、低(-1)兩個(gè)水平,每組處理重復(fù)3次。參照1.2.1節(jié)制備各處理組發(fā)酵濾液并測(cè)定其離體抑菌活性,使用Design-Expert 12軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),通過方差分析判斷各因素對(duì)發(fā)酵結(jié)果的重要程度,試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 PB試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.5 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)得到影響發(fā)酵結(jié)果的顯著因素,根據(jù)前期單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)步長(zhǎng)。顯著因素步長(zhǎng)方向應(yīng)與其效應(yīng)方向一致,非顯著因素取單因素最優(yōu)水平,通過最陡爬坡試驗(yàn)逼近發(fā)酵結(jié)果最優(yōu)值。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

通過最陡爬坡試驗(yàn)確定主要影響因子的最優(yōu)組合,以B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液對(duì)Xoc的抑菌圈直徑為響應(yīng)值,通過Design-Expert 12軟件設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)(表2),建立最優(yōu)發(fā)酵條件并驗(yàn)證。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.7 抗菌肽合成相關(guān)基因的檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[21-24]的方法,利用特異性引物檢測(cè)Iturin、Bacillomycin D、Surfactin、Fengycin、和Bacilysin 5種抗菌肽的合成相關(guān)基因。PCR反應(yīng)體系:1 μL模板DNA,10 μL 5×PCR buffer,5 μL dNTPs (2 mmol/L),1.5 μL上下游引物(10 μmol/L),0.6 μL DNA polymerase,ddH2O補(bǔ)足最終體積為50 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢查大小。

1.2.8 液相色譜質(zhì)譜法分析抑菌肽

參照Xu等[25]的方法從B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵上清液中純化獲得抗菌肽粗提物。采用LC-MS檢測(cè)和分析技術(shù),利用Thermo Xcalibur 4.0軟件根據(jù)樣品的質(zhì)量-電荷比(m/z)測(cè)定目標(biāo)物質(zhì)的相對(duì)分子量,并通過比較初步確定菌株產(chǎn)生的脂肽類型[26]。

色譜條件:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱溫30 ℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為10 ℃;正離子(ESI+)模式下流動(dòng)相A為0.1%甲酸水,B為甲醇。樣品梯度洗脫程序:0.0-2.0 min,95% A-95% A;2.0-13.0 min,95% A-5% A;13.0-16.0 min,5% A-5% A;16.0-16.1 min,5% A-95% A;16.1-18.0 min,95% A-95% A,流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣體積為2 μL。質(zhì)譜條件:離子源為加熱型電噴霧(HESI),溫度為300 ℃;正離子模式下噴霧電壓為3.0 kV;傳輸毛細(xì)管溫度320 ℃,鞘氣壓力30 psi,輔助氣壓力10 psi;掃描模式為Full MS/dd-MS2,質(zhì)量為200-2 000 m/z,一級(jí)掃描和二級(jí)掃描分辨率分別為70 000 (FWHM)和17 500 (FWHM)。碰撞氣:高純氮?dú)狻?/p>

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用Design-Expert 12軟件進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,得到擬合回歸方程,進(jìn)行試驗(yàn)方差分析。使用SPSS 20.0軟件對(duì)最佳初始培養(yǎng)基和單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并使用Duncan法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 適用于B.velezensis BR-01菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

B.velezensisBR-01菌株由不同的初始培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng),所獲得的發(fā)酵濾液的抑菌活性會(huì)有明顯的變化(圖1)。B.velezensisBR-01菌株以LB培養(yǎng)基和Landy培養(yǎng)基作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí),其發(fā)酵濾液的抑菌活性顯著優(yōu)于其他培養(yǎng)基,抑菌圈直徑分別為(27.9±0.7) mm和(28.0±0.9) mm,兩者無(wú)顯著差異。綜合考慮成本因素,LB培養(yǎng)基為B.velezensisBR-01菌株最適初始發(fā)酵培養(yǎng)基。

Different letters show significant difference at 0.05 level.

2.2 培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)中,以麥芽糖為碳源、以酵母提取物為氮源時(shí),B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液對(duì)Xoc的抑菌圈直徑分別取得最大值[圖2:(a)、(b)],且隨著麥芽糖濃度和酵母提取物濃度的提高,抑菌圈直徑呈先增加后減小的趨勢(shì)[圖2:(c)、(d)]。與空白對(duì)照組(CK)相比,添加MgCl2對(duì)發(fā)酵濾液抑菌活性影響不顯著,添加CaCl2、MnSO4和CaCO3反而會(huì)不同程度地降低發(fā)酵濾液抑菌活性,只有添加KH2PO4可以略微提高發(fā)酵濾液抑菌活性[圖2(e)]。B.velezensisBR-01菌株在初始pH值為7、32 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h得到的發(fā)酵濾液對(duì)Xoc的抑菌圈直徑取得最大值[圖2:(f)、(g)、(h)]。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明,B.velezensisBR-01菌株的最適碳源為麥芽糖,最適碳源濃度為11 g/L,最適氮源為酵母提取物,最適氮源濃度為14 g/L,最適無(wú)機(jī)鹽為KH2PO4,最適pH值為7,最適發(fā)酵時(shí)間48 h,最適發(fā)酵溫度32 ℃。

2.3 培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 PB試驗(yàn)結(jié)果

PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。由方差分析可知,不同的因素對(duì)發(fā)酵結(jié)果的作用大小不同。其中麥芽糖(A)、酵母提取物(B)、溫度(F)影響作用顯著(P<0.05)且都為正效應(yīng),3因素按影響作用大小排序?yàn)闇囟?F)>酵母提取物(B)>麥芽糖(A)(表4),選取這3個(gè)因素進(jìn)入下一步試驗(yàn)。

表3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果見表5,最優(yōu)發(fā)酵條件組合為麥芽糖12 g/L、酵母提取物14 g/L、培養(yǎng)溫度32 ℃。在此發(fā)酵條件下,B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液對(duì)Xoc的抑菌圈直徑最大,為42.1 mm,取該組合為響應(yīng)中心點(diǎn),進(jìn)入下一步試驗(yàn)。

表5 最陡爬坡路徑試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6。使用Design-Expert 12軟件對(duì)Box-Behnken 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液抑菌圈直徑(Y)對(duì)麥芽糖(X1)、酵母提取物(X2)、溫度(X3)的回歸方程:Y=42.07-0.58X1-0.26X2+0.71X3+0.43X1X2+0.13X1X3-0.50X2X3-2.23X12-0.41X22-1.76X32。方差分析結(jié)果顯示,該模型回歸擬合度P值<0.000 1,回歸顯著;模型失擬值P=0.240 0>0.05,失擬項(xiàng)不顯著,模型穩(wěn)定誤差小。該模型的決定系數(shù)R2=0.992 5,校正決定系數(shù)R2=0.979 0,模型擬合度較好,預(yù)測(cè)可信度較高(表7)。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表7 Box-Behnken 試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析

采用Design-Expert 12軟件,根據(jù)上述擬合方程繪制顯著因子間相互作用的響應(yīng)面曲線圖(圖3)。由結(jié)果可知,響應(yīng)面曲線圖均為凸面圖,存在抑菌率獲得最大值的發(fā)酵條件組合。通過軟件求解回歸方程得到以下最優(yōu)解決方案:麥芽糖(X1)11.82 g/L、酵母提取物(X2)13.42 g/L、溫度(X3)32.3 ℃,最大抑菌圈直徑預(yù)測(cè)為42.3 mm。

圖3 各培養(yǎng)因素對(duì)抑菌圈直徑交互影響的響應(yīng)面

2.4 響應(yīng)面最優(yōu)條件驗(yàn)證

按照Box-Behnken試驗(yàn)預(yù)測(cè)值優(yōu)化發(fā)酵條件顯著因素,按照單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件非顯著因素,得到全部發(fā)酵條件如下:麥芽糖11.89 g/L、酵母提取物13.54 g/L、NaCl 5 g/L、KH2PO41 g/L、初始pH值為7、發(fā)酵時(shí)間48 h、培養(yǎng)溫度32.3 ℃。為驗(yàn)證響應(yīng)面最優(yōu)條件的可行性,在該優(yōu)化方案下制備B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液并測(cè)定其對(duì)Xoc的離體抑菌活性,試驗(yàn)重復(fù)3次處理。結(jié)果顯示,B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液對(duì)Xoc的抑菌圈直徑為(42.5±0.2) mm(圖4),與回歸模型預(yù)測(cè)的最大抑菌圈直徑42.3 mm相近,表明回歸模型合理、可信。

Values given are the means±standard deviations of triplicate measurements.

優(yōu)化前使用LB培養(yǎng)基制備的B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液對(duì)Xoc的抑菌圈直徑為(28.0±0.9) mm,優(yōu)化后制備的B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液對(duì)Xoc的抑菌圈直徑相比優(yōu)化前增加了51.79%,表明采用優(yōu)化發(fā)酵方案可以有效提高B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性物質(zhì)濃度。

2.5 抗菌肽合成相關(guān)基因的檢測(cè)

本研究從B.velezensisBR-01菌株中成功擴(kuò)增到與Iturin合成相關(guān)的基因ituA和ituD,與Bacillomycin D合成相關(guān)的基因bmyB和bmyC,與Surfactin合成相關(guān)的基因srfAA,與Fengycin合成相關(guān)的基因fenB和fenD,與Bacillysin合成相關(guān)的基因bacA和bacD(圖5)。結(jié)果表明,B.velezensisBR-01菌株具有產(chǎn)生多種抗菌肽的潛力。

Hole M represents Maker,hole 1-10 represent ituA,ituD,bmyC,bmyB,srfAA,fenB,fenD,bacD,bacA and non-template control in sequence.

2.6 LC-MS技術(shù)分析抑菌肽

芽孢桿菌可以代謝多種類型的抗菌肽,相當(dāng)數(shù)量的抗菌肽具體組成和相對(duì)分子質(zhì)量已經(jīng)確定[26-28]。本研究采用LC-MS檢測(cè)技術(shù)分析B.velezensisBR-01菌株抗菌肽粗提取物的成分,結(jié)合對(duì)應(yīng)于質(zhì)譜的色譜圖中每個(gè)時(shí)間段出現(xiàn)的峰,根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量和“-CH2-”脂肪鏈的結(jié)構(gòu)特征分析質(zhì)譜中的一系列單峰,結(jié)合2.5節(jié)抗菌肽合成相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果作出以下推測(cè):(1)推測(cè)m/z271.15為抗菌二肽Bacilysin [圖6(a)];(2)推測(cè)m/z1 008.66、m/z1 022.67和m/z1 036.69為Surfactin同系物[圖6(b)];(3)推測(cè)m/z1 044.66、m/z1 058.67、m/z1 072.69和m/z1 086.70為Iturin同系物[圖6(c)];(4)推測(cè)m/z1 463.80、m/z1 477.82和m/z1 491.83為Fengycin同源物[圖6(d)]?；谏鲜鼋Y(jié)果,推測(cè)該菌株可能產(chǎn)生4種抗菌肽:Bacilysin、Surfactin、Iturin和Fengycin (表8)。

(a) Bacilysin,MS spectra of m/z 271.15; (b) Surfactin,MS spectra of m/z 1 008.66,m/z 1 022.67 and m/z 1 036.69;(c) Iturin,MS spectra of m/z 1 044.66,m/z 1 058.67,m/z 1 072.69 and m/z 1 086.70;(d) Fengycin,MS spectra of m/z 1 463.80,m/z 1 477.82 and m/z 1 491.83.

表8 抗菌肽脂粗提物的LC-MS分析

3 討論

貝萊斯芽孢桿菌因其豐富的抗菌肽產(chǎn)物被廣泛應(yīng)用于多種植物病害的生物防治。Cao等[29]分析了對(duì)尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和青枯菌(Ralstoniasolanacearum)有拮抗作用的兩株B.velezensis的抗菌代謝產(chǎn)物,共鑒定到3種脂肽化合物(Surfactin、Iturin和Fengycin),其中Iturin在防御病原真菌方面起主要作用。B.velezensisIP22菌株能夠顯著減輕野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)病致病變種(X.campstrispv.vesicatoria)侵染造成的辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病,利用高效液相色譜質(zhì)譜技術(shù)可檢測(cè)到該菌株抗菌代謝產(chǎn)物中的Fengycin和Locillomycin家族[30]。Wu等[31]報(bào)道B.velezensisFZB42中的Difficidin和Bacilysin對(duì)水稻黃單胞菌具有拮抗活性。本研究利用特異性引物PCR擴(kuò)增B.velezensisBR-01菌株的基因組DNA,并使用LC-MS技術(shù)初步將B.velezensisBR-01菌株抗菌肽成分鑒定為Bacilysin、Surfactin、Iturin和Fengycin。其中Surfactin和Bacilysin被認(rèn)為具有抗細(xì)菌的功能[32,33],可能對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病菌具有拮抗活性。

抗菌肽在農(nóng)業(yè)病蟲害防控領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景,利用微生物生產(chǎn)抗菌肽是一個(gè)現(xiàn)實(shí)可行的選擇。但是微生物生產(chǎn)抗菌肽是一個(gè)復(fù)雜的發(fā)酵過程,只有合適的發(fā)酵環(huán)境,才能讓目標(biāo)菌株的生產(chǎn)性能得到充分的釋放[34]。本研究以B.velezensisBR-01菌株無(wú)菌濾液對(duì)Xoc的抑菌圈直徑為因變量,通過提高發(fā)酵濾液的抑菌活性來(lái)間接提高抗菌肽的濃度。在碳源篩選試驗(yàn)中B.velezensisBR-01菌株對(duì)麥芽糖、葡萄糖等速效碳源利用率較高,而對(duì)淀粉、玉米粉等遲效碳源利用率較低,這與黎燕珊等[16]研究結(jié)果相近,但與趙曉燕等[35]研究發(fā)現(xiàn)菌株B.amyloliquefaciensXLA03的最佳碳源為玉米淀粉不同。在氮源篩選試驗(yàn)中B.velezensisBR-01菌株幾乎不能利用無(wú)機(jī)氮源尿素,在有機(jī)氮源范圍內(nèi)更偏好酵母提取物、蛋白胨等速效氮源,對(duì)遲效氮源花生餅粉利用效率較差,這與張曉勇等[36]的研究結(jié)果相近。肖靚等[37]研究報(bào)道菌株B.subtilisP5添加CaCl2時(shí)對(duì)辣椒炭疽病抑菌活性最強(qiáng);張冬冬等[38]研究表明MnSO4、CaCl2對(duì)菌株B.malacitensisZ-5的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用;侯美如等[39]發(fā)現(xiàn)菌株B.amyloliquefaciensSSYB以CaCO3為無(wú)機(jī)鹽時(shí)產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵中藥材黃芪的能力最強(qiáng);張志焱等[40]報(bào)道添加KH2PO4后菌株B.subtilisBL0006的抗菌肽殺菌價(jià)效最高。本研究中只有KH2PO4對(duì)B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性有一定的促進(jìn)作用,但效果不顯著,可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的酵母提取物和NaCl已經(jīng)滿足B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽對(duì)無(wú)機(jī)鹽的營(yíng)養(yǎng)代謝需求。在發(fā)酵條件優(yōu)化方面,發(fā)現(xiàn)B.velezensisBR-01菌株最適pH值為7,其在中性偏弱堿性環(huán)境下抑菌活性較高,與張曉勇等[36]的研究結(jié)果相近,但與Ye等[41]研究發(fā)現(xiàn)菌株B.amyloliquefaciensS1適合在偏弱酸性或中性環(huán)境下生長(zhǎng)不同。B.velezensisBR-01菌株在32.3 ℃條件下培養(yǎng)48 h后其抑菌活性最強(qiáng),其中發(fā)酵時(shí)間與郭艷霞等[19]的研究結(jié)果相近,發(fā)酵溫度與黎燕珊等[16]的研究結(jié)果相近。

為提高B.velezensisBR-01菌株產(chǎn)抗菌肽的能力,增加其對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病的生防價(jià)值,本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件設(shè)計(jì)了多因素的組合試驗(yàn)。微生物發(fā)酵因素優(yōu)化的常規(guī)方法是正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)能夠同時(shí)兼顧多因素對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響,尋求各因素最佳水平的組合。但正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)無(wú)法構(gòu)建微生物發(fā)酵響應(yīng)值的回歸方程,從而無(wú)法通過數(shù)學(xué)模型獲得最優(yōu)解[42,43]。本研究利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化B.velezensisBR-01菌株產(chǎn)抗菌肽培養(yǎng)基和發(fā)酵條件,與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相比,響應(yīng)面分析法試驗(yàn)次數(shù)少,試驗(yàn)精度高,能夠綜合考慮多因素間的交互作用并構(gòu)建回歸方程,是近年來(lái)微生物發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化和工藝考察的首選[44-46]。

結(jié)合文獻(xiàn)分析和本研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的貝萊斯芽孢桿菌菌株在不同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的抗菌肽的成分與含量存在一定差異,這種差異是貝萊斯芽孢桿菌菌株間拮抗能力、拮抗譜多樣性的基礎(chǔ)。B.velezensisBR-01菌株的分離與研究為水稻細(xì)菌性條斑病的生物防治提供了新的微生物資源與理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

B.velezensisBR-01菌株高產(chǎn)抗菌肽培養(yǎng)基配方為麥芽糖11.89 g/L、酵母提取物13.54 g/L、NaCl 5 g/L、KH2PO41 g/L。最適發(fā)酵條件為初始pH值7、發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度32.3 ℃?？咕闹饕煞殖醪借b定為Bacilysin、Surfactin、Iturin和Fengycin。該方案可用于快速、批量發(fā)酵制備B.velezensisBR-01菌株生防菌液。本研究結(jié)果為該菌株抗菌肽的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及田間生防利用等后續(xù)研究提供了理論基礎(chǔ)。