張玉, 陳祥坤, 王君虹, 李雪, 孫素玲, 王偉,4*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所, 浙江 杭州 310021; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點實驗室,浙江 杭州 310021; 3.浙江省食品安全重點實驗室, 浙江 杭州 310021; 4.浙江科技學院, 浙江 杭州 310023)

中國是食用菌生產(chǎn)大國, 中國食用菌協(xié)會發(fā)布《2018 年度全國食用菌統(tǒng)計調(diào)查結(jié)果分析》 表明,2018 年全國食用菌總產(chǎn)量達3 842.04 萬t, 其中香菇是食用菌中的第一大品種, 產(chǎn)量達1 043.12 萬t。香菇中富含多糖、蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)及維生素等多種人體所需的營養(yǎng)素[1-3], 具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、降血壓等多種生理活性[4-8]。香菇中多糖含量最高, 其次是蛋白質(zhì), 不同香菇蛋白質(zhì)含量以干物質(zhì)計為18.0%～30.8%[9], 香菇蛋白富含有18 種氨基酸, 包括8 種人體必需氨基酸[10-11]。如何進一步高值化利用香菇蛋白質(zhì)對于促進香菇產(chǎn)業(yè)鏈進一步延伸具有重要意義。

生物活性肽是對生命機體具有一定生理功能的肽類化合物, 相比蛋白具有易吸收、安全性好等優(yōu)點, 因此, 深受研究者關注, 目前已從多種動植物蛋白中制備出具有抗氧化、降血糖、降血壓等活性的多肽[12-17], 有研究利用不同蛋白酶對香菇蛋白進行酶解產(chǎn)生了多種具有不同活性的多肽, 如抗氧化肽、醒酒肽等[18-19]。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn), 香菇蛋白經(jīng)中性蛋白酶酶解后, 具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。但香菇酶解肽的制備過程中, 酶解液中的色素不斷增加, 最終酶解液呈棕色, 這對其進一步在食品工業(yè)中的應用造成了不利影響。目前常用的食品脫色純化方法有活性炭吸附法、樹脂層析法、超臨界萃取法等[20-22], 其中活性炭吸附法相比其他方法簡單易行, 且成本低, 適合工業(yè)化生產(chǎn)。本文采用活性炭吸附法對香菇酶解液進行脫色, 對脫色過程中的活性炭用量、脫色溫度和脫色時間進行了優(yōu)化, 建立了香菇酶解肽的最佳活性炭脫色工藝, 可為香菇酶解肽的進一步純化及應用提供一定的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干香菇, 農(nóng)貿(mào)市場; 中性蛋白酶, 齊一生物科技 (上海) 有限公司; α-葡萄糖苷酶, 美國sigma公司。

1.2 儀器與設備

分析天平, 北京賽多利斯儀器有限公司;AMR-100 型全自動酶標分析儀, 杭州奧盛儀器有限公司; HZQ-B 恒溫培養(yǎng)搖床, 蘇州威爾實驗用品有限公司; H-1650 型高速離心機, 長沙湘儀離心機有限公司; 冷凍干燥儀, FD-A10N-50 上海皓莊儀器有限公司; 超聲波清洗機, 杭州寶珀超聲波科技有限公司。

1.3 香菇肽的制備

香菇蛋白提取: 采用堿溶酸沉法提取香菇蛋白, 稱取一定量香菇干粉, 按質(zhì)量比1 ∶20 加蒸餾水溶解, 50 ℃超聲提取60 min, 4 000 r·min-1離心15 min, 棄去沉淀, 上清液以1 mol·L-1HCl 溶液調(diào)pH 值至3.5, 離心, 去除上清液, 沉淀真空冷凍干燥, 得香菇蛋白。

香菇酶解肽制備: 稱取5.0 g 的香菇蛋白于150 mL 錐形瓶中, 加入100 mL 蒸餾水攪拌混勻,調(diào)pH 值至7, 按酶底比3 000 U·g-1加入中性蛋白酶混合均勻, 放入搖床中以150 r·min-1的轉(zhuǎn)速酶解4 h, 酶解結(jié)束后, 沸水浴5 min 使酶失活,冷卻至室溫, 4 000 r·min-1離心20 min, 取上清液進一步實驗。

1.4 活性炭脫色的單因素實驗

取50 mL 香菇酶解肽, 加入一定量的活性炭,調(diào)節(jié)溫度, 振蕩脫色一定時間后, 過濾, 取上清液測定脫色率及α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率。

以活性炭用量10 g·L-1, 脫色溫度40 ℃, 脫色時間30 min 作為基本固定因素, 改變其中1 個因素, 進行單因素實驗, 比較不同脫色條件對香菇酶解肽脫色率和α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率的影響。各因素梯度設計為: 活性炭用量2.5、5、10、15、20 g·L-1, 脫 色 時 間10、20、30、40、50 min, 脫色溫度30、40、50、60、70 ℃。

1.5 活性炭脫色的正交實驗

基于單因素實驗結(jié)果選取3 個適宜水平進行正交實驗, 以香菇酶解肽溶液的脫色率及α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率的綜合評分為指標, 確定香菇酶解肽活性炭脫色的最佳條件。實驗因子水平如表1。

表1 正交實驗因素與水平

1.6 脫色率的測定

采用分光光度法檢測香菇酶解肽的脫色率。以水為參比溶液, 測定香菇酶解肽在420 nm 波長處的吸光值, 脫色率計算公式如下。

式中:Y表示脫色率,%;a表示脫色前的吸光度;b表示脫色后的吸光度。

1.7 α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率的測定

參照張玉等[23]的方法進行。將100 μL 5 mg·mL-1α-葡萄糖苷酶溶液與50 μL 樣品溶液加入酶標板中, 混合均勻, 在25 ℃下孵育10 min 后, 加入50 μL PNPG (5 mmol·L-1) 溶 液, 混 合 物 在-37 ℃下反應30 min, 加入50 μL 碳酸鈉 (0.67 mol·L-1) 溶液終止反應。采用AMR-100 自動酶標記分析儀在405 nm 波長下測定吸光度值。計算α-葡萄糖苷酶抑制活性, α-葡萄糖苷酶抑制活性為對照組吸光值與樣品組吸光值之差除以對照組吸光值再乘以100。α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率為脫色后α-葡萄糖苷酶抑制活性占脫色前α-葡萄糖苷酶抑制活性的百分比。

1.8 綜合評價

綜合考慮脫色率和α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率兩項指標, 采用加權(quán)評分法, 脫色率和α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率分別除以同列最大值再乘以100, 所得數(shù)值進一步進行加權(quán)求和, 得到綜合評分, 綜合評分為0.5 乘以脫色率加上0.5 乘以α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率。

1.9 揮發(fā)性成分分析

取酶解液5 mL 于頂空瓶中, 加1.5 g 氯化鈉后密封。用固相微萃取 (SPME) 萃取頭50 ℃萃取30 min, 氣相色譜250 ℃解吸5 min, 不分流進樣。色譜 柱: HP-5 MS Ultra (0.25 mm×60 mm,0.25 μm); 程序升溫條件: 初始溫度為50 ℃, 保持5 min, 以5 ℃·min-1的速率升至150 ℃, 保持5 min, 然 后 以6 ℃·min-1升 至250 ℃, 保 持6 min。載氣為氦氣, 流速為1 mL·min-1, EI 源,溫度為250 ℃, 掃描范圍為35～650 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同活性炭用量對香菇酶解肽脫色效果的影響

如圖1 所示, 當活性炭用量在2.5～10 g·L-1,隨著活性炭用量的增加, 脫色率呈快速上升趨勢,10 g·L-1的脫色率顯著高于2.5 和5 g·L-1(P<0.05)。當活性炭用量高于10 g·L-1之后, 脫色率隨著活性炭用量的增加, 變化較緩, 可能是由于活性炭含量達10 g·L-1時, 其對色素的吸附量已趨于平衡。α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率則隨著活性炭用量的增加不斷降低。由于脫色率和活性保持率成反比關系, 綜合考慮脫色率和活性保持率的影響, 進一步進行綜合評分, 結(jié)果如圖2 所示, 隨著活性炭的增加, 綜合評分呈先上升后保持的趨勢,在活性炭用量為10 g·L-1之后, 綜合評分變化平緩, 因此, 選擇10 g·L-1作為最佳活性炭用量。

圖1 活性炭用量對香菇酶解肽脫色率與α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率的影響

圖2 活性炭用量對香菇酶解肽脫色效果綜合評分的影響

2.2 不同脫色時間對香菇酶解肽脫色效果的影響

如圖3 所示, 隨著脫色時間的增加, 脫色率總體呈先上升后下降趨勢, 脫色時間40 min 時脫色率達最大, 而后下降, 可能是隨著時間延長, 部分吸附的色素又重新溶解, 導致脫色率降低。α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率在30 min 內(nèi)呈下降趨勢,而后略有上升, 差異不顯著 (P<0.05)。進一步對脫色率和活α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率進行綜合評分, 結(jié)果顯示, 隨著脫色時間的增加, 綜合評分呈先上升后下降的趨勢, 當脫色時間為40 min時, 樣品綜合評分最高 (圖4)。因此, 選擇40 min 作為最佳的脫色時間。

圖3 脫色時間對香菇酶解肽脫色率與α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率的影響

圖4 脫色時間對香菇酶解肽脫色效果綜合評分的影響

2.3 不同脫色溫度對香菇酶解肽脫色效果的影響

如圖5 所示, 隨著脫色溫度的增加, 脫色率呈先上升后下降的趨勢, 于50 ℃時脫色率達最大,而后隨著脫色溫度增加呈下降趨勢, 這可能是隨著溫度升高, 分子運動加快, 增加了色素與活性炭的接觸, 因此, 脫色率上升, 當溫度過高后, 色素分子結(jié)構(gòu)被破壞, 色素的解吸速度加快, 導致脫色率有所下降。α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率在50 ℃內(nèi)隨著溫度升高呈下降趨勢, 而后略有上升, 差異不顯著 (P<0.05)。進一步對脫色率和α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率進行綜合評分, 結(jié)果顯示, 隨著脫色溫度的增加, 綜合評分呈先上升后下降的趨勢, 當脫色溫度為50 ℃時, 樣品綜合評分最高(圖6)。因此, 選擇50 ℃作為最佳的脫色溫度。

圖5 脫色溫度對香菇酶解肽脫色率與α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率的影響

圖6 脫色溫度對香菇酶解肽脫色效果綜合評分的影響

2.4 正交實驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實驗, 采用L9(3)4正交實驗設計, 對香菇酶解肽活性炭脫色條件進行優(yōu)化, 具體實驗設計及實驗結(jié)果見表2, 進一步對正交實驗進行了極差分析, 相關結(jié)果見表3。脫色率的極差R結(jié)果顯示A>C>B, 即影響香菇酶解肽脫色率的因素依次是活性炭用量 (A)、溫度 (C) 和時間(B), 最優(yōu)組合為A3B2C2, 即活性炭用量15 g·L-1、吸附時間40 min、吸附溫度50 ℃。α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率的極差R結(jié)果顯示A>C>B,即影響香菇酶解肽α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率的因素依次是活性炭用量 (A)、溫度 (C) 和時間 (B), 最優(yōu)組合為A1B2C1, 即活性炭用量5 g·L-1、吸附時間40 min、吸附溫度40 ℃。綜合評分極差R結(jié)果顯示A>B>C, 即影響香菇酶解肽脫色綜合評分的因素依次是活性炭用量 (A)、時間(B) 和溫度 (C), 最優(yōu)組合為A3B2C2, 即活性炭用量15 g·L-1、吸附時間40 min、吸附溫度50 ℃。綜合評分與脫色率最優(yōu)條件相一致, 因此, 選擇綜合評分最佳條件作為優(yōu)化后的脫色條件。

表2 正交實驗結(jié)果

表3 正交實驗結(jié)果統(tǒng)計分析

2.5 最優(yōu)工藝驗證

使用優(yōu)化后的條件即活性炭用量15 g·L-1、吸附時間 40 min、吸附溫度 50 ℃, 進行脫色處理, 并測定脫色率和α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率, 結(jié)果顯示, 香菇酶解肽脫色率和α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率分別為 (80.5±1.9)%和 (74.1±2.3)%。

由于活性炭同時具有清除氣味的作用, 因此,進一步對脫色后酶解肽的揮發(fā)性成分進行分析, 香菇酶解肽的主要揮發(fā)成分可分為醇類化合物、酯類化合物、酮類化合物、含硫化合物、烷類化合物、酸類化合物、吡嗪類化合物, 其中含硫化合物含量最高, 占揮發(fā)成分總量的55.0%, 其次為醇類化合物占揮發(fā)成分總量的28.1%。脫色后香菇酶解液中揮發(fā)成分總含量顯著降低, 總清除率為90.8%, 其中含硫化合物的清除率為87.1%, 醇類化合物的清除率為94.7%, 酮類化合物的清除率為88.7%, 烷類化合物的清除率為97.6%, 吡嗪類化合物的清除率為99.2% (圖7)。

圖7 脫色后香菇酶解肽的揮發(fā)性成分清除率

3 討論與結(jié)論

活性肽具有價格低廉, 操作工藝簡單, 安全無毒, 且易于去除的特點, 廣泛地用于食品工業(yè)的色素去除工藝, 尤其是蛋白、多糖、皂苷等成分的提取純化過程[21-22,24], 但對于不同產(chǎn)品的色素, 活性炭吸附的最佳條件不同, 本實驗研究了活性炭對香菇酶解肽脫色效果的影響, 通過單因素實驗結(jié)合正交實驗對活性炭用量、脫色時間和脫色溫度進行了優(yōu)化, 得到了香菇酶解肽的活性炭脫色最佳條件,即活性炭用量15 g·L-1、脫色時間40 min、脫色溫度50 ℃。在該條件下獲得的酶解肽脫色率為80.5%, α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率為74.1%。

活性炭不僅對色素具有良好的吸附效果, 對揮發(fā)成分也具有優(yōu)良的吸附效果[25-26], 香菇酶解肽含有大量含硫化合物等揮發(fā)成分, 影響了香菇酶解肽的風味, 通過此條件脫色所得的酶解肽的揮發(fā)成分總清除率可達90.8%。所得的香菇酶解肽產(chǎn)品呈淡黃色, 無刺激性氣味, 可用于食品或保健食品的生產(chǎn), 該研究可為香菇蛋白的進一步開發(fā)利用提供技術支撐。