李晨曦，吳慧欣,2，吳玉嬌，陳 潔，孟憲志，潘國慶，龍夢嫻

（1.西南大學資源昆蟲高效養(yǎng)殖與利用全國重點實驗室/微孢子蟲感染與防控重慶市重點實驗室，重慶 400715；2.西南大學蠶桑紡織與生物質科學學院，重慶 400715）

【研究意義】凡納濱對蝦原產于太平洋沿岸，目前是我國主要的對蝦養(yǎng)殖品種之一，年產量可高達百萬噸［1］。但凡納濱對蝦常遭受病毒、細菌和真菌等病原感染，給全球對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失［2］。2004 年泰國新發(fā)現(xiàn)了一種對蝦病原，2009 年鑒定為微孢子蟲，命名為蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）。EHP 主要感染對蝦肝胰腺，通過影響宿主免疫和代謝，抑制對蝦正常生長發(fā)育甚至危及存活率［3-5］。2013年我國首次檢出EHP，至今已傳播至各大養(yǎng)殖區(qū)，極大地威脅國內對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［6-8］。迄今已發(fā)現(xiàn)200 多屬、1 700 多種微孢子蟲［9-11］，它們具有相似且特殊的侵染方式，即適宜環(huán)境條件下，刺激微孢子蟲發(fā)芽，極管迅速彈出，病原性孢原質通過此中空管道運輸至宿主細胞內。研究發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白參與激活微孢子蟲發(fā)芽［12-14］。為有效防控蝦肝腸胞蟲，揭示其侵染機制顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】水通道蛋白作為細胞膜上的跨膜蛋白，參與水和小分子溶質跨膜的雙向運輸，幾乎存在于所有生物中。水通道蛋白以四聚體形式存在，每個單體都會形成具有高度選擇性的中空通道以運輸合適分子。目前，已發(fā)現(xiàn)300 多種不同的水通道蛋白，其中人的水通道蛋白有13 種亞型，分別是AQP0～AQP12［15］。水通道蛋白由6 個α-螺旋跨膜結構域組成，具有2 個保守基序NPA（Asn-Pro-Ala）、5 個環(huán)結構（A～E 環(huán)），汞離子通過作用于E 環(huán)上NPA 基序前的半胱氨酸位點可逆地抑制水通道蛋白功能［16-17］。Frixione 等［14］利用HgCl2處理按蚊微孢子蟲（Nosema algerae），發(fā)現(xiàn)HgCl2可顯著抑制按蚊微孢子蟲發(fā)芽，推測水通道蛋白參與按蚊微孢子蟲的發(fā)芽過程。2006 年Ghosh 等［18］從兔腦炎微孢子蟲（Encephalitozoon cuniculi）中鑒定到首個微孢子蟲水通道蛋白EcAQP，其具有保守的水通道蛋白序列特征，將其編碼基因轉染至非洲爪蟾卵母細胞中異源表達，發(fā)現(xiàn)該卵母細胞的通透性顯著增加，表明EcAQP 具有促進水滲透的功能。Chen 等［19］從家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）基因組中克隆得到NbAQP，發(fā)現(xiàn)NbAQP蛋白定位于成熟孢子的孢壁，并且NbAQP 抗體能有效抑制孢子發(fā)芽率，進一步證實了水通道蛋白在微孢子蟲發(fā)芽中發(fā)揮重要功能。【本研究切入點】目前蝦肝腸胞蟲全基因序列測序分析已經(jīng)完成［20］，但有關EHP 水通道蛋白的研究尚未見報道。鑒于此，本研究以蝦肝腸胞蟲水通道蛋白EHP00_492 為試驗對象，對其編碼基因進行克隆，預測其蛋白質的序列與結構特征，分析該蛋白在EHP 成熟孢子中的表達定位特征。【擬解決的關鍵問題】本研究從蝦肝腸胞蟲EHP 的cDNA 中克隆EHP00_492基因；通過生物信息學方法分析其編碼蛋白的序列特征、三維結構特征及其與同源蛋白間的親緣關系；構建重組表達載體pCold-TF-EHP00_492，轉化大腸桿菌異源表達，純化重組蛋白并制備多克隆抗體；分析EHP00_492在EHP 成熟孢子中的表達及亞細胞定位特征，以期為EHP 水通道蛋白的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021—2022 年在西南大學資源昆蟲高效養(yǎng)殖與利用全國重點實驗室開展。供試的感染EHP 與未感染EHP 的凡納濱對蝦均購自重慶市合川區(qū)和銅梁區(qū)的養(yǎng)殖池塘，新西蘭實驗兔購自重慶恩斯維爾生物科技有限公司；大腸桿菌Escherichia coliDH5α 和Rosetta 感受態(tài)細胞購自重慶靈精生物科技有限公司，pCold-TF 表達質粒由本實驗室保存；PrimeSTAR DNA 聚合酶、XhoI 和PstI 限制性內切酶、IPTG、脫脂奶粉購自Takara Bio 公司，425-600 μm 玻璃珠、弗氏佐劑、DAPI 細胞核染料、HRP 標記山羊抗兔IgG、Triton X-100購自Sigma-Aldrich公司，Alexa Fluor?594 山羊抗兔熒光二抗購自Invitrogen 公司，TF-tag 兔多克隆抗體購自迅檢（重慶）生命科技有限責任公司；DNA 膠回收試劑盒、Total RNA提取試劑盒、質粒抽提試劑盒購自Omega Bio-Tek 公司，一步法快速克隆試劑盒購自上海翊圣生物公司；PMSF、考馬斯亮藍染色液、Wheat Germ Agglutinin（WGA-488）購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)蝦肝腸胞蟲水通道蛋白編碼基因EHP00_492序列（GenBank No.MNPJ01000023.1: 89 904～90 632，729 bp），使用Primer 5.0 軟件設計特異性引物。用于RT-PCR 的引物對，EHP00_492-F1序列：5′-ATGCAAGTCAGTAAAAAATTAATAG-3′，EHP00_492-R1 序列：5′-TTATTTAAACAACAAAA ATACTTG-3′；用于克隆的引物對，EHP00_492-F2 序列：5′-GGCATATGGAGCTCGGTACCCTCGAG ATGCAAGTCAGTAAAAAATTAATAG-3′（下劃線為XhoI 酶切位點），EHP00_492-R2序列：5′-GCAGAGATTACCTATCTAGACTGCAGTTATTT AAACAACAAAAATACTTG-3′（下劃線為PstI 酶切位點）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 RNA 提取和RT-PCR 采用RT-PCR 方法克 隆EHP00_492基因。取 約1×106個EHP 孢子，按照RNA 提取試劑盒說明書提取RNA，并利用逆轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄為cDNA。以cDNA 為模板、EHP00_492-F1/R1 為引物，通過PCR 擴增EHP00_492基因。PCR 反應體系：PrimerSTAR DNA（2×）聚合酶 25 μL，引物 0.2 μmol/L，cDNA 1 μL，ddH2O 補足至50 μL。PCR反應條件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 20 s、50 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 產物，并送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析 通過NCBI（http://ncbi.nlm.nih.gov/）完成序列檢索并利用微孢子蟲數(shù)據(jù)庫（https://microsporidiadb.org/micro/app/）進行基因座位分析；利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）進行分子量、氨基酸數(shù)量和等電點等特征預測；利用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行蛋白信號肽預測；利用NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進行蛋白潛在磷酸化位點預測；利用PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）進行蛋白二級結構預測；利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）進行蛋白質功能域預測；利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進 行跨膜結構域預測；利用MAFFT（https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html）進行微孢子蟲與不同物種之間水通道蛋白的多重序列比對；利用AlphaFold 軟件進行蛋白質三維結構預測與比對；利用MEGA 7.0 軟件基于Neighbor-Joining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4EHP00_492重組質粒構建 將pCold-TF載體質粒進行XhoI 和PstI 雙酶切，酶切反應體系：限制性內切酶各3.5 μL，CutSmart buffer 5 μL，模板1～5 μg，ddH2O 補足至50 μL。酶切反應條件：37 ℃下孵育20 min。將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳并割膠回收。使用EHP00_492-F2/R2 引物擴增EHP00_492片段，反應體系：PrimerSTAR DNA 聚合酶 25 μL，引物 0.2 μmol/L，模板1 μL，ddH2O 補足至50 μL。反應條件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 20 s、50 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳并割膠回收。根據(jù)一步法克隆試劑盒的操作說明將4 μL 載體與6 μL 外源片段進行連接，連接酶10 μL，50 ℃孵育20 min。將連接產物轉化至E.coliDH5α 感受態(tài)細胞中，并涂布于含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。挑取單菌落提取質粒進行PCR 和雙酶切驗證，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.5 EHP00_492 異源蛋白表達、純化及其兔多克隆抗體制備 將測序正確的pCold-TFEHP00_492重組質粒轉化至表達菌株E.coliRosetta 中，添 加0.5 mmol/L IPTG誘導，收 集菌體進行破碎，使用Ni-NTA 親和層析柱純化rEHP00_492 重組蛋白。純化后的rEHP00_492 蛋白與佐劑混合后免疫新西蘭實驗兔，制備兔多克隆抗體。

1.2.6 EHP 孢子總蛋白提取 取約1×106個EHP成熟孢子，加入1×PBS 300 μL、PMSF 20 μL 和425～600 μm玻璃珠0.4 g混合進行破碎，破碎條件：6 m/s，30 s/輪，6 輪/次，每輪間歇10 s，共破碎3 次。離心后的上清即為EHP 孢子總蛋白。

1.2.7 蛋白免疫印記（Western blot）將EHP 孢子總蛋白進行SDS-PAGE 電泳后，電轉至PVDF膜。將PVDF 膜于37 ℃下封閉1～2 h；分別利用EHP00_492 兔多克隆抗體和TF-tag 兔多克隆抗體室溫下孵育PVDF 膜1 h，利用羊抗兔IgG 二抗室溫下孵育PVDF 膜45 min。采用化學發(fā)光成像儀（Azure Biosystems C300）對PVDF膜進行曝光、成像。

1.2.8 間接免疫熒光實驗（Indirect immunofluorescence assay，IFA）將EHP 孢子涂布于包被0.01%（V/V）多聚賴氨酸的載玻片上，滴加4%（V/V）多聚甲醛固定樣品，加入1%（V/V）Triton X-100 處理20 min；加入IFA 封閉液于室溫下孵育1 h，分別加入EHP00_492 兔多克隆抗體和TF-tag 兔多克隆抗體于室溫下孵育1 h，加入Alexa Fluor?594山羊抗兔熒光二抗于室溫下避光孵育1 h；加入DAPI 和Wheat Germ Agglutinin（WGA-488）于室溫下避光染色20 min，使用激光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS FV1000）觀察結果。

2 結果與分析

2.1 EHP00_492 基因座位保守性分析

通過6 種微孢子蟲同源基因座位保守性分析發(fā)現(xiàn)，蝦肝腸胞蟲EHP00_492與畢氏腸胞蟲EBI_27080、黃道蟹微孢子蟲ECANGBI_2177、兔腦炎微孢子蟲ECU07_0740、腸腦炎微孢子蟲Eint_070680和海倫腦炎微孢子蟲EHEL_070710同源基因及其鄰近基因座位相當保守（圖1），推測這些基因行使相似且保守的功能。兔腦炎微孢子蟲ECU07_0740 已被鑒定具有水通道蛋白的功能［18］，推測EHP00_492是蝦肝腸胞蟲水通道蛋白編碼基因。

圖1 EHP00_492 同源基因座位保守性分析Fig. 1 Conservation analysis of EHP00_492 homologous gene locus

2.2 EHP00_492 基因克隆

提取EHP 總RNA，反轉錄cDNA，以cDNA為模板，采用EHP00_492-F1/R1 引物進行RTPCR 擴增。電泳結果（圖2）顯示，約750 bp 處有1 條特異性擴增條帶；經(jīng)測序可知，RT-PCR擴增條帶的序列與EHP00_492全長序列一致，表明該基因無內含子。

2.3 EHP00_492 序列特征

EHP00_492 含有242 個氨基酸，預測分子量為25 kD。經(jīng)預測EHP00_492 無信號肽，但具有多個絲氨酸和蘇氨酸磷酸化修飾位點。利用PSIPRED 對EHP00_492 的二級結構進行分析，結果（圖3）表明該蛋白具有8 個α 螺旋和多個無規(guī)則卷曲。TMHMM 分析發(fā)現(xiàn)，EHP00_492 中12～31 aa、41～60 aa、91～113 aa、133～155 aa、176～198 aa、218～240 aa 的位置存在6 個跨膜結構域（圖4）。SMART 預測結果（圖5）顯示，EHP00_492 含有1 個保守的水通道蛋白家族結構域（2～236 aa）。比較EHP00_492 與不同微孢子蟲同源蛋白發(fā)現(xiàn)，它們都富含亮氨酸，等電點偏酸性，均含有6～8 個跨膜結構域（表1）。

表1 EHP00_492 同源蛋白序列特征比較Table 1 Comparison sequence characteristics of EHP00_492 and homologous proteins

圖3 EHP00_492 二級結構特征分析Fig. 3 Analysis of the secondary structure of EHP00_492

圖4 EHP00_492 跨膜域預測Fig. 4 Prediction for the transmembrane domain of EHP00_492

圖5 EHP00_492 功能結構域分析Fig. 5 Analysis of the function domain of EHP00_492

2.4 EHP00_492 序列保守性與同源蛋白親緣進化關系分析

BlastP 比對結果（圖6）發(fā)現(xiàn)，EHP00_492與畢氏腸胞蟲EBI_27080 序列相似性最高，為74%；與兔腦炎微孢子蟲ECU07_0740、海倫腦炎微孢子蟲EHEL_070710、腸腦炎微孢子蟲Eint_070680 序列相似性介于46%～48%之間；多重序列比對發(fā)現(xiàn)，EHP00_492 與其他同源蛋白均存在2 個水通道蛋白的保守基序NPA/G，分別位于69～71 aa 和201～203 aa 處，且呈對稱分布。系統(tǒng)進化樹分析結果（圖7）發(fā)現(xiàn)，EHP00_492 與畢氏腸胞蟲水通道蛋白EBI_27080 聚為一支；相比于人水通道蛋白NP932766.1 和對蝦水通道蛋白ROT75608.1，微孢子蟲來源的水通道蛋白與酵母水通道蛋白ADC55558.1 的進化關系更近。

圖6 EHP00_492 同源序列比對Fig. 6 Alignment analysis of EHP00_492 and homologous sequences

圖7 EHP00_492 系統(tǒng)進化樹分析Fig. 7 Phylogenetic tree analysis of EHP00_492

2.5 EHP00_492 蛋白三維結構預測

利用AlphaFold 軟件預測EHP00_492 蛋白的三維結構（圖8），并與已完成功能鑒定的

圖8 EHP00_492 與NbAQP 和EcAQP 三維結構比對Fig. 8 Comparison the three-dimensional structure of EHP00_492,NbAQP and EcAQP

家蠶微粒子蟲水通道蛋白NbAQP（GenBank No.NBO_16g0013）和兔腦炎微孢子蟲水通道蛋白EcAQP（GenBank No.ECU07_0740）的三維結構比對，發(fā)現(xiàn)3 個蛋白質在10～32 aa、42～126 aa、129～160 aa、172～242 aa 處存在重疊，暗示其蛋白功能的保守性。

2.6 EHP00_492 蛋白的表達特征

將pCold-TF-EHP00_492重組表達質粒轉化E.coliRosetta 菌株中，IPTG 誘導后獲得大量rEHP00_492 重組蛋白，利用Ni-NTA 親和層析柱純化后，SDS-PAGE 檢測發(fā)現(xiàn)100 mmol/L 咪唑能純化出質量較高的rEHP00_492 重組蛋白，分子量大小約為75 kD，與預測分子量大小一致（圖9 A）。將rEHP00_492 重組蛋白免疫新西蘭實驗兔制備EHP00_492 兔多克隆抗體。通過蛋白免疫印記分析EHP00_492 在EHP 中的表達特征，結果（圖9 B）顯示，與陰性對照pCold-TF 抗體相比，EHP00_492 兔多克隆抗體可在EHP 天然總蛋白中識別1 條大小約21 kD 的條帶，表明EHP00_492在EHP 中能表達，其分子量大小為21 kD。

圖9 EHP00_492 蛋白的純化與表達特征Fig. 9 Purification and expression characteristics of EHP00_492

2.7 EHP00_492 亞細胞定位特征

為進一步分析EHP00_492 的亞細胞定位特征，利用麥胚芽凝集素WGA-488 特異性標記EHP 成熟孢子孢壁上的幾丁質，結果（圖10）發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，紅色熒光標記的EHP00_492兔多克隆抗體能特異性識別EHP 成熟孢子中的EHP00_492 蛋白，并且紅色熒光信號與綠色熒光標記的WGA-488 信號存在共定位現(xiàn)象，表明EHP00_492 蛋白定位于EHP 成熟孢子的孢壁上。

圖10 IFA 分析EHP00_492 在EHP 成熟孢子中的亞細胞定位特征Fig. 10 Subcellular location characteristics of EHP00_492 in EHP mature spores by IFA

3 討論

2004 年以來，EHP 相繼在泰國、中國、印度、印度尼西亞和委內瑞拉等對蝦養(yǎng)殖大國被發(fā)現(xiàn)，由于其具有快速水平傳播和垂直傳播的能力，給全球對蝦養(yǎng)殖生產造成了嚴重經(jīng)濟損失［21］。微孢子蟲具有一個特殊的侵染裝置，由極管、極膜層和后極泡3 部分組成［22-23］。特定環(huán)境刺激孢子發(fā)芽，極管從成熟孢子內部迅速彈出并刺入宿主細胞，將具有病原性的孢原質運送至宿主細胞完成侵染［24-25］。因此，發(fā)芽是微孢子蟲成功感染宿主的關鍵。

研究發(fā)現(xiàn)，微孢子蟲內外滲透壓的瞬間變化激活了孢子發(fā)芽，在此過程中，水通道蛋白發(fā)揮重要作用［26］。水通道蛋白屬于MIP 蛋白超家族，可選擇性地將水、中性小分子和離子進行跨膜運輸。MIP 超家族分為水通道蛋白（AQPs）和甘油攝取促進劑（GlpFs）兩大類，前者存在于所有生命，后者多來源于微生物［27］。作為第一亞家族，AQPs 是水選擇透性的水通道蛋白，包括AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5 和AQP6。第二亞家族GlpFs 既能滲透水，也能運輸其他不帶電的小分子（如氨、尿素和甘油等）。根據(jù)氨基酸序列特征，AQP3、AQP7、AQP9 和AQP10 歸屬于這一家族［28-29］。原核生物的水通道蛋白首次發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌，水通道蛋白AqpZ 介導水的快速流入或流出以應對大腸桿菌細胞外滲透壓變化，此外，AqpZ 還有助于大腸桿菌細胞體積的增長［27］。釀酒酵母含有4 個水通道蛋白基因，分別為AQY1、AQY2、AQY3和Fps1。低溫使釀酒酵母細胞膜的流動性和滲透性降低，但水通道蛋白AQY1 能加速胞內水的流出，避免細胞死亡［30］。水通道蛋白參與了細胞膜的滲透調節(jié)。微孢子蟲也具有水通道蛋白，當其發(fā)芽激活時，水通道蛋白促進水分子迅速流入孢子內部，造成后極泡和極膜層瞬間膨脹，直至孢子前端破裂，極管被膨脹的后極泡推動并外翻彈出。此外，氯化汞能抑制水通道蛋白功能，但無法抑制EcAQP 對水的滲透，推測EcAQP 缺乏位于NPA 保守基序旁對汞敏感的半胱氨酸位點。蝦肝腸胞蟲作為養(yǎng)殖對蝦檢出率最高的病原之一，目前暫無有效防治藥物。因此，后續(xù)研究工作可探索靶向EHP00_492 的抑制劑降低孢子發(fā)芽，以期有效控制EHP 傳播。

4 結論

本研究從蝦肝腸胞蟲基因組中篩選到水通道蛋白編碼基因EHP00_492，序列分析發(fā)現(xiàn)EHP00_492 符合水通道蛋白保守的序列特征。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，EHP00_492 與畢氏腸胞蟲水通道蛋白EBI_27080 親緣關系最近，并且與已鑒定的家蠶微孢子蟲水通道蛋白NbAQP、兔腦炎微孢子蟲水通道蛋白EcAQP 的三維結構高度相似。EHP00_492 能表達定位于蝦肝腸胞蟲成熟孢子的孢壁上，推測其在EHP 發(fā)芽過程中發(fā)揮重要功能。本研究初步明確了EHP00_492 蛋白的序列特征、結構特征和表達定位特征，對進一步探究EHP 水通道蛋白的功能具有重要意義。