孫瑞紅，蔣 祝，邵彬彬，譚建新*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系，江蘇 南京 210029；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院（南京市婦幼保健院）遺傳醫(yī)學(xué)中心，江蘇 南京 210004

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是一種常染色體隱性遺傳病，是由于脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性導(dǎo)致的進(jìn)行性近端肌肉萎縮和無力的一組疾?。?］。其發(fā)病率為1/6 000～1/10 000，人群攜帶率為1/40～1/50，在導(dǎo)致兒童死亡的常染色體遺傳病中排名第2［2］。SMA致病基因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（survival motor neuron，SMN1），其純合缺失是引起SMA 的主要原因［3］。SMN2 基因與SMN1 高度同源，作為修飾基因，影響疾病的嚴(yán)重程度［4］。通常情況下，SMA的發(fā)生95%～98%是由SMN1基因第7 號(hào)外顯子的純合缺失導(dǎo)致，2%～5%是由SMN1 基因點(diǎn)突變或部分缺失導(dǎo)致［5-6］。鑒于SMA人群攜帶率高，病情嚴(yán)重和治療費(fèi)用昂貴，美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)建議對(duì)所有育齡夫婦進(jìn)行SMA攜帶者篩查［7］。

目前檢測(cè)SMN基因拷貝數(shù)的方法較多，如多重連接探針依賴擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）［8］、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）［9］、變性高效液相色譜法（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）［10］、基質(zhì)輔助激光解析-電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF）［11］、微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）［12］，以及下一代測(cè)序法（next generation sequencing，NGS）［8］。MLPA是檢測(cè)SMN基因拷貝數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但其耗材貴且檢測(cè)周期長(zhǎng)，導(dǎo)致MLPA不適合大規(guī)模攜帶者篩查［13］。qPCR 操作簡(jiǎn)單，成本較低，是人群SMA 篩查最常使用的方法之一，但由于DNA 片段非特異性擴(kuò)增，可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，臨床開展有一定的局限性［14］。

本研究對(duì)516 例樣本同時(shí)使用MLPA、ddPCR、高分辨率熔解曲線（high-resolution melting，HRM）與多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR 聯(lián)合毛細(xì)管電泳（PCR-based capillary electrophoresis，PCR/CE）技術(shù)對(duì)SMN 拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)這些方法的性能進(jìn)行比較。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

收集2020 年3 月—2021 年10 月在南京市婦幼保健院使用qPCR方法進(jìn)行SMA攜帶者篩查的患者共516 例，其中，男12 例，女504 例，平均年齡為（31.0±4.0）歲。所有受檢者接受遺傳咨詢后自愿選擇SMA篩查，并排除SMA家族史。每名受檢者簽署知情同意書，本研究經(jīng)南京市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2020KY004）。

1.2 方法

抽取每名受檢者外周血2 mL，使用自動(dòng)核酸提取儀（廈門芮寶生醫(yī)股份有限公司）提取基因組DNA，用下列方法對(duì)SMN拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1 MLPA

MLPA 分析使用SALSA MLPA 試劑盒（P060-050R，MRC 公司，荷蘭）按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行檢測(cè)。該試劑盒包含2個(gè)針對(duì)SMN1第7號(hào)和第8號(hào)外顯子的序列特異性探針和1 個(gè)針對(duì)SMN2 第7 號(hào)和第8號(hào)外顯子的探針。DNA變性后與MLPA探針混合物雜交過夜，然后進(jìn)行探針連接和擴(kuò)增。使用ABI 3500分析儀（賽默飛世爾科技公司，美國(guó)）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并使用Coffalyser.Net 軟件（MRC公司，荷蘭）分析數(shù)據(jù)。探針相對(duì)峰面積增加或減少30%分別表示重復(fù)或刪除。

1.2.2 HRM

采用2 次多重探針PCR 反應(yīng)檢測(cè)SMN1 基因拷貝數(shù)。20 μL 反應(yīng)體系包含100～200 ng 基因組DNA、1×PCR 緩沖液、0.5 μmol/L 引物、KlenTaq1 聚合酶和LCGreen 染料。PCR 反應(yīng)在LightCycler 480（羅氏診斷公司，德國(guó)）上擴(kuò)增：95 益5 min，95 益5 s，64 益降溫至60 益30 s，共10 個(gè)循環(huán)，隨后95 益10 s，60 益15 s，共25 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后產(chǎn)物95 益預(yù)熱60 s，40 益孵育60 s收集熔解曲線進(jìn)行分析。

1.2.3 PCR/CE檢測(cè)

使用PCR/CE 試劑盒（廈門百歐迅公司）檢測(cè)SMN1 基因拷貝數(shù)。該試劑盒包含SMN1 和SMN2基因第7 號(hào)和第8 號(hào)外顯子的引物，β-globin 和βactin 作為內(nèi)參。20 μL 反應(yīng)體系包含15 μL PCR 混合物，3 μL 引物，0.16 μL DNA 聚合酶，和2 μL 基因組DNA。使用熱循環(huán)儀，條件如下：95 益初始孵化5 min，然后進(jìn)行25 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95 益30 s，57 益30 s，72 益30 s），最后在72 益下延伸30 min。然后，將PCR 產(chǎn)物與Hi-Di Formamide（賽默飛世爾科技公司，美國(guó)）和GeneScan 500 LIZ Size Standard混合。變性后，混合物在ABI 3500 遺傳分析儀（賽默飛世爾科技公司，美國(guó)）上分離。通常情況下，得到的電泳圖包括6 個(gè)峰（β-globin、SMN1-EX7、SMN2-EX7、SMN1-EX8、SMN2-EX8和β-actin）。

1.2.4 ddPCR

使用ddPCR SMN1 拷貝數(shù)測(cè)定試劑盒（Bio-Rad Laboratories，美國(guó)）按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行操作。18 μL 體系中含有2×ddPCR Supermix for Probes、20×ddPCR SMN1 Assay 和HaeⅢ，并加入4 μL DNA樣品。然后，取20 μL 混合物與70 μL 的Bio-Rad Droplet Generation Oil for Probes 混合，在Bio-Rad QX200TMDroplet Generator 上生成液滴。液滴產(chǎn)生后進(jìn)行終點(diǎn)PCR。PCR 的熱循環(huán)條件如下：95 益下10 min；94 益下30 s，55 益下1 min，35 個(gè)循環(huán)；98 益下10 min。Quanta Soft Analysis Pro軟件以核糖核酸酶P/MRP 亞單位p30（RPP30）為參考基因進(jìn)行SMN1第7號(hào)外顯子的液滴集群分類和拷貝數(shù)計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每種方法檢出的SMN1 和SMN2 拷貝數(shù)錄入Microsoft Office Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。靈敏度=真陽(yáng)性樣本/（真陽(yáng)性樣本+假陰性樣本）×100%。特異度=真陰性樣本/（真陰性樣本+假陽(yáng)性樣本）×100%。本研究中2 分類結(jié)果采用靈敏度和特異度進(jìn)行評(píng)價(jià)。3 分類/4 分類變量采用加權(quán)Kappa 系數(shù)進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，加權(quán)Kappa 一致性檢驗(yàn)分析采用SPSS 26.0 軟件包進(jìn)行。Kappa 值是介于0 到1 之間的一個(gè)比率，其中0表示完全不一致，1表示完全一致。

2 結(jié)果

為了系統(tǒng)地比較目前用于SMA攜帶者篩查的方法，同時(shí)用MLPA、ddPCR、HRM 和PCR/CE 檢測(cè)516 份DNA 樣本。以MLPA 結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算ddPCR、HRM 和PCR/CE 檢測(cè)方法的靈敏度和特異度。

2.1 靈敏度和特異度

針對(duì)SMN1第7號(hào)外顯子，MLPA結(jié)果顯示，107個(gè)樣本為雜合性缺失（SMN1第7號(hào)外顯子單拷貝），409 個(gè)樣本為正常（SMN1 第7 號(hào)外顯子≥2 拷貝）。與MLPA 結(jié)果相比，ddPCR、HRM 分析和PCR/CE 檢測(cè)SMN1 第7 號(hào)外顯子的拷貝數(shù)與MLPA 分析結(jié)果一致，靈敏度和特異度均為100.0%（表1、2）。

表1 HRM分析SMN1第7號(hào)外顯子拷貝數(shù)

表2 ddPCR和PCR/CE分析SMN1第7號(hào)外顯子拷貝數(shù)

在這4種方法中，只有ddPCR不包含針對(duì)SMN1第8 號(hào)外顯子的特定引物。針對(duì)SMN1 第8 號(hào)外顯子，MLPA 結(jié)果顯示，101 個(gè)樣本被歸類為雜合性缺失（SMN1 第8 號(hào)外顯子單拷貝），415 個(gè)為正常（SMN1 第8 號(hào)外顯子≥2 拷貝）。與MLPA 結(jié)果相比，HRM 檢測(cè)單拷貝的SMN1 第8 號(hào)外顯子的靈敏度和特異度分別為100.0%和99.5%。檢測(cè)2拷貝的靈敏度和特異度分別為99.4%和100.0%，檢測(cè)＞2拷貝的靈敏度和特異度分別為100.0%和100.0%（表3）。相比之下，PCR/CE 檢測(cè)SMN1 第8 號(hào)外顯子的結(jié)果與MLPA 的結(jié)果一致，其靈敏度和特異度均為100.0%。

表3 HRM分析SMN1第8號(hào)外顯子拷貝數(shù)

此外，MLPA 和PCR/CE 分析可以同時(shí)檢測(cè)SMN1和SMN2。針對(duì)SMN2第7號(hào)和第8號(hào)外顯子，PCR/CE檢測(cè)的結(jié)果與MLPA一致，靈敏度和特異度均為100.0%（表4、5）。

表4 PCR/CE分析SMN2第7號(hào)外顯子拷貝數(shù)

表5 PCR/CE分析SMN2第8號(hào)外顯子拷貝數(shù)

2.2 4種方法的比較

表6總結(jié)了4種方法的各種特點(diǎn)。其中，ddPCR只能檢測(cè)SMN1第7號(hào)外顯子，HRM含有針對(duì)SMN1第7 號(hào)外顯子和第8 號(hào)外顯子的探針，而MLPA 和PCR/CE 能夠量化SMN1 第7 號(hào)和第8 號(hào)外顯子、SMN2第7號(hào)和第8號(hào)外顯子的拷貝數(shù)。此外，MLPA、ddPCR和PCR/CE可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出多達(dá)4拷貝，而HRM 只能準(zhǔn)確地分析出多達(dá)2 拷貝。每個(gè)樣品的成本根據(jù)我們從國(guó)內(nèi)供應(yīng)商處獲得的價(jià)格計(jì)算（1 美元=6.9人民幣）。

表6 4種SMN1和SMN2基因檢測(cè)方法的特點(diǎn)比較

3 討論

本研究納入了516個(gè)樣本，以MLPA 為金標(biāo)準(zhǔn)，比較ddPCR、HRM 和PCR/CE 檢測(cè)SMN1 第7 號(hào)、第8 號(hào)外顯子拷貝數(shù)的特異度和靈敏度。在這3 種方法中，PCR/CE 似乎是最可靠的方法，它與MLPA 在檢測(cè)SMN1 和SMN2 的拷貝數(shù)方面表現(xiàn)出很好的一致性。

SMN1 第7 號(hào)第8 號(hào)外顯子純合缺失約占SMA患者的95%［15］。然而，也有SMN1第8號(hào)外顯子純合缺失，但第7號(hào)外顯子未見異常的報(bào)道。Gambardella等［16］報(bào)告了2 例無親緣關(guān)系的患者，由于SMN1 第8 號(hào)外顯子純合缺失而具有SMAⅡ型和Ⅲ型的典型表型。此外，1 例10 月齡的SMAⅠ型男嬰表現(xiàn)為雙側(cè)視神經(jīng)萎縮，是由SMN1第8號(hào)外顯子的孤立缺失引起［17］。在以前的研究中，約有5%的中國(guó)孕婦攜帶SMN1第8號(hào)外顯子的雜合性缺失，但有完整的第7 號(hào)外顯子［9］。因此，除了SMN1 第7 號(hào)外顯子，在SMA 攜帶者篩查中包含SMN1第8號(hào)外顯子也很重要。在本研究中，ddPCR不包含針對(duì)SMN1第8號(hào)外顯子的特異性探針，這可能導(dǎo)致SMA攜帶者篩查中出現(xiàn)額外的殘留風(fēng)險(xiǎn)。MLPA、HRM分析和PCR/CE在量化SMN1 第8 號(hào)外顯子方面具有相對(duì)較高的特異度和靈敏度，因此是適合SMA 攜帶者篩查的方法。

SMN2 是SMN1 的同源基因，兩者僅有5 個(gè)堿基不同［18-19］。第7 號(hào)外顯子中的1 個(gè)C-T 核苷酸轉(zhuǎn)換導(dǎo)致大約90%的SMN2 轉(zhuǎn)錄本跳過該外顯子，導(dǎo)致快速降解而不能補(bǔ)償SMN1的功能［20］。剩余10%的SMN2 轉(zhuǎn)錄本不足以彌補(bǔ)SMN1 基因功能缺失。盡管如此，SMN2 拷貝數(shù)的增加一般與較溫和的SMA臨床表現(xiàn)有關(guān)［21-22］。因此，在SMA 攜帶者篩查中分析SMN2 拷貝數(shù)有助于預(yù)測(cè)疾病的演變，并為遺傳咨詢提供依據(jù)。此外，據(jù)報(bào)道，因?yàn)镾MN1 和SMN2的同時(shí)缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡，SMN2 在所有SMA 患者中都被保留［23-24］。因此，SMN2 可以通過與SMN1同時(shí)擴(kuò)增作為參考基因。在本研究中，除了MLPA之外，只有PCR/CE 分析可以同時(shí)測(cè)定SMN1 和SMN2的拷貝數(shù)，并與MLPA的結(jié)果表現(xiàn)出很好的一致性。

本研究存在如下局限性。首先，沒有0 拷貝SMN1 的樣本，無法評(píng)估這些方法在分析0 拷貝SMN1時(shí)的特異度和靈敏度。其次，這4種方法都不能檢測(cè)SMN1 基因的點(diǎn)突變，而這一突變約占SMA病例的5%，導(dǎo)致攜帶者篩查中存在不可避免的殘留風(fēng)險(xiǎn)。最后，這些方法都會(huì)將一小部分?jǐn)y帶者（約4%）錯(cuò)誤地歸類為非攜帶者，這些攜帶者在同一條染色體上有2個(gè)重復(fù)的SMN1拷貝，而在另一染色體上沒有拷貝［2+0］。

綜上所述，本研究通過比較ddPCR、HRM 及PCR/CE 3 種檢測(cè)方法在SMA 攜帶者篩查中的優(yōu)缺點(diǎn)，為臨床開展攜帶者篩查項(xiàng)目的技術(shù)選擇提供參考依據(jù)。