王中月,王 健,張阿玲,劉艷飛,劉占德

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院,陜西楊凌 712100)

中國作為獼猴桃的原產(chǎn)地,栽培面積和產(chǎn)量均位于世界第一[1]。獼猴桃因其營養(yǎng)價值高,風(fēng)味佳深受消費者喜愛,市場對獼猴桃的需求量也日益增加,因此擴大獼猴桃優(yōu)質(zhì)苗木生產(chǎn)迫在眉睫[2-3]。近些年,組織培養(yǎng)快繁技術(shù)成為獼猴桃良種繁育的重要途徑[4],然而組織培養(yǎng)中蔗糖的使用會大幅增加組培苗的污染率[5],且密閉的培養(yǎng)環(huán)境也不利組培苗生根[2]。因此,生產(chǎn)中急需一種技術(shù)解決上述難題。

無糖組培快繁技術(shù)是日本千葉大學(xué)古在豐樹教授在20世紀(jì)80年代末發(fā)明的一種全新植物組織培養(yǎng)技術(shù)[6-10],是環(huán)境調(diào)控技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)合[11-14],其原理是以CO2代替糖類作為植物的碳源,通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器內(nèi)的微環(huán)境使植物進(jìn)行光合作用,進(jìn)而促進(jìn)植物快速生根和生長[15-21]。中國自1994年引進(jìn)無糖組培快繁技術(shù)以來,相繼應(yīng)用在非洲菊[12]、滿天星[15]、薄葉金花茶[18]、歐李[19]、半夏[20]、金線蓮和鐵皮石斛[21]等植物上。而關(guān)于無糖組培快繁技術(shù)在獼猴桃種苗繁育方面的應(yīng)用尚未見報道。

因此,本研究通過比較分析無糖組培和傳統(tǒng)有糖組培方式對獼猴桃莖尖生根效率的影響,并初步探究了不同條件下根系相關(guān)酶活、內(nèi)源激素的變化,以期為構(gòu)建獼猴桃無糖組培快繁技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以苗齡為6周,生長健壯、長勢相近的中華獼猴桃‘臍紅’和美味獼猴桃‘郁香’組培苗為試材。

1.2 試驗處理

1.2.1 最佳基質(zhì)含水量篩選 將試材分別接種至含水量為50%、60%、70%、80%、90%的蛭石基質(zhì)(450 g蛭石+1/2 MS+1.0 mg/L IBA)中培養(yǎng)。每個處理設(shè)置3個重復(fù),每個重復(fù)30株苗。培養(yǎng)28 d后統(tǒng)計并記錄幼苗的株高、莖粗、葉綠素含量、根數(shù)、平均根長、根表面積、根體積等生長指標(biāo)。

1.2.2 最佳CO2濃度和換氣方式篩選 將試材置于光自養(yǎng)快繁裝置中進(jìn)行CO2富集培養(yǎng),通過控制器將CO2濃度設(shè)置為800和1 200 μmol/mol,換氣方式設(shè)置為自然換氣、間隔15 min強制換氣和間隔30 min強制換氣。每個處理設(shè)置3個重復(fù),每個重復(fù)30株苗。培養(yǎng)28 d后統(tǒng)計相關(guān)生長指標(biāo),同“1.2.1”。

1.2.3 無糖組培和有糖組培對比試驗 將試材分別接種在傳統(tǒng)有糖培養(yǎng)基(1/2 MS+25 g/L蔗糖+6.8 g/L瓊脂+0.5 mg/L IBA+0.3 mg/L IAA,pH=5.8)和無糖培養(yǎng)基(450 g蛭石+1/2 MS+1.0 mg/L IBA,pH = 5.8)中培養(yǎng)。每個處理設(shè)置3個重復(fù),每個重復(fù)30株苗。

光自養(yǎng)無糖組培快繁裝置購于上海離草科技有限公司,培養(yǎng)前期通氣流量為1.0 ± 0.2 L/min,生根培養(yǎng)后期,通氣流量為2.0 ± 0.2 L/min。其他培養(yǎng)條件均相同:光周期為14 h/10 h(光/暗),光照度為2 500～3 000 lx;培養(yǎng)溫度為(24±2) ℃。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 獼猴桃根系指標(biāo)的測定 生根培養(yǎng)28 d后隨機選取30株幼苗進(jìn)行根系構(gòu)型相關(guān)參數(shù)的測定。取幼苗根部,清洗干凈后于水中展開,用ScanMakeri 800 plus掃描儀獲取根系掃描圖像,利用Win RHIZO軟件對幼苗根系長度、表面積、體積、根尖數(shù)、直徑等參數(shù)進(jìn)行分析[5]。

1.3.2 獼猴桃生根過程中相關(guān)酶活性及內(nèi)源激素的測定 分別于生根培養(yǎng)的第1、4、7、14、21、28天進(jìn)行隨機取樣,用純水清洗干凈擦干后分別將葉片、莖基部擦干后放入液氮速凍,于-80 ℃超低溫冰箱保存,用于相關(guān)酶活性及內(nèi)源激素的測定。

POD、PPO和IAAO活性參照文獻(xiàn)[22-23]的方法進(jìn)行測定。相關(guān)內(nèi)源激素參照文獻(xiàn) [24-25]的方法提取,采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS)測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2019對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖,用SPSS 21.0軟件,采用獨立樣本T檢驗方法、one-way ANOVA方法和LSD多重比較(P<0.05)對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)含水量對無糖組培獼猴桃幼苗生長的影響

基質(zhì)作為植物生長的支撐材料,不僅起固定作用,而且與植物吸收水分和養(yǎng)分、根系呼吸等生理反應(yīng)密切相關(guān)。只有基質(zhì)滿足根系對水分的需求,才能讓幼苗根系發(fā)達(dá)。由表1可知,‘郁香’和‘臍紅’在含水量為70%、80%和90%的基質(zhì)中生根率、存活率等生長指標(biāo)顯著優(yōu)于含水量為50%和60%的基質(zhì),說明基質(zhì)含水量對無糖組培苗不定根的形成至關(guān)重要。當(dāng)基質(zhì)含水量為80%時‘郁香’和‘臍紅’的生根率最高,分別為81.48%和81.67 %;當(dāng)基質(zhì)含水量為70%時‘郁香’和‘臍紅’的成活率最高,分別為96.30%和 92.59%。而‘郁香’和‘臍紅’的株高、莖粗及葉綠素含量在基質(zhì)含水量為70%、80%和90%的處理間沒有顯著性差異(表1)。

表1 不同基質(zhì)含水量處理下獼猴桃幼苗生長情況Table 1 Effects of different substrate water content on growth of kiwifruit seedlings

2.2 CO2濃度及換氣方式對無糖組培獼猴桃幼苗生長的影響

由表2可知,在800和1 200 μmol/mol 的處理條件下,2個品種生根率并無明顯差異,因此從節(jié)約成本的角度考慮,選擇800 μmol/mol較為合理。在相同CO2濃度中,隨著換氣間隔時間的增加,無糖組培苗生根率呈下降趨勢,說明在保證幼苗正常生長的前提下,縮短強制換氣的時間間隔有助于提高2個品種的生根率。2個品種在強制換氣處理下的生根率都極顯著高于自然換氣處理,且間隔15 min強制換氣的生根率最高(‘臍紅’為86.11%,‘郁香’為77.78%)。說明強制換氣能夠增加無糖組培苗的生根率。存活率、株高、莖粗、葉綠素含量在不同 CO2濃度及換氣方式處理間差異不明顯。

表2 不同CO2濃度和換氣方式下獼猴桃幼苗生長Table 2 Effects of CO2 concentration and ventilation mode on growth of kiwifruit seedlings

2.3 無糖組培方式對獼猴桃莖尖生根的影響

由表3可知,2種生根培養(yǎng)方式對獼猴桃組培苗根系的各指標(biāo)有不同影響。整體來看,‘郁香’和‘臍紅’通過無糖組培的生根效果明顯好于作為對照的傳統(tǒng)有糖組培。無糖組培條件下,‘臍紅’和‘郁香’在培養(yǎng)第7天已形成少量根系,而此時在對照有糖組培中只在莖尖基部形成少量愈傷組織(圖1-A,1-B)。在培養(yǎng)第14天,無糖組培條件下的‘臍紅’和‘郁香’根系快速增長,形成大量次級根,而對照僅形成極少量根系且?guī)缀鯚o側(cè)根。培養(yǎng)第28天,無糖組培條件的2個品種均已形成完整的根系,利于吸收營養(yǎng)對移栽馴化有積極作用,而對照僅有少量根系和極少量側(cè)根;且無糖組培條件下‘郁香’和‘臍紅’的總根長、總根表面積、根尖數(shù)、分支數(shù)均極顯著高于對照,總根體積顯著高于對照(表3);但平均根系直徑極顯著低于對照有糖組培。

圖1 2種組培生根方式下‘郁香’和‘臍紅’根系發(fā)育情況Fig.1 Rooting development of ‘Yuxiang’ and ‘Qihong’ under two rooting methods of tissue culture

2.4 無糖組培生根過程中3種抗氧化酶活性的動態(tài)變化

由圖2-A可知,無糖組培‘郁香’的POD活性呈先升高再下降的趨勢;而在常規(guī)有糖組培的POD活性變化相反。‘郁香’在無糖培養(yǎng)生根的第4天和第7 天,POD活性分別為30.71和 23.48 U/(g· min),極顯著高于對照13.31和3.90 U/(g· min)。由圖2-B可知,‘臍紅’組培苗在生根過程中,無糖組培和傳統(tǒng)有糖組培的POD活性變化趨勢相似,呈現(xiàn)“上升-下降”的單峰趨勢?！毤t’在生根培養(yǎng)的第7天,POD活性達(dá)104.55 U/(g· min),極顯著高于對照85.56 U/(g· min)。說明生根過程中,較高POD活性有利不定根形成。

* 表示差異顯著(P<0.05),** 表示差異極顯著(P<0.01)。下同

‘郁香’在無糖組培生根的第1天和第4天,PPO活性顯著高于對照,分別是對照的2.64和3.23倍。表明在生根初期,PPO活性高利于產(chǎn)生不定根。在2種生根條件下,‘臍紅’PPO活性在第4天時均達(dá)到最高,但二者無顯著性差異(圖 2-C,2-D)。

無糖組培生根第7天時(圖2-E,2-F),‘郁香’和‘臍紅’的IAAO活性均為最高,分別為 15.27和31.63 U/(g·min),分別顯著高于對照的6.33和8.87 U/(g· min)。說明IAAO活性的增加利于不定根的伸長。

2.5 無糖組培生根過程中相關(guān)內(nèi)源激素的動態(tài)變化

‘郁香’和‘臍紅’在2種生根方式培養(yǎng)的過程中IAA含量總體呈先降低后升高的“V”形變化趨勢(圖3-A,3-B)。無糖組培的第1天,‘郁香’和‘臍紅’的IAA含量最高,分別為6.84和7.45 ng/g,均顯著高于對照;隨后逐漸下降直到第14天時,達(dá)到最低值1.29和1.01 ng/g,且顯著低于對照;之后逐漸升高,到第28天時顯著高于對照。結(jié)果說明生根前期,IAA含量高利于不定根 形成。

圖3 無糖組培生根過程中幼苗IAA、ABA和GA3含量變化Fig.3 Changes of IAA,ABA and GA3 contents in seedlings during rooting in sugar-free tissue culture

‘郁香’和‘臍紅’在2種生根方式培養(yǎng)的過程中ABA含量總體上呈先升高后降低的趨勢(圖3-C,3-D)。二者均在無糖組培的第7天ABA含量最高且極顯著高于對照;且‘郁香’在第14天和第21天時,ABA含量仍極顯著高于對照;而‘臍紅’在第14天和第28天時,ABA含量也極顯著高于對照。說明生根中期,高濃度ABA有利于不定根的伸長。

由圖3-E、3-F可知,無糖組培條件下,‘郁香’在第4天時GA3顯著高于對照,第7天時含量達(dá)到最高,但與對照相比無顯著性差異。而‘臍紅’除了第4天,無糖組培條件下的GA3含量始終顯著高于對照,且在第14天時含量最高,達(dá)到 100.46 ng/g。表明生根后期,高濃度GA3促進(jìn)不定根伸長和側(cè)根形成。

3 討論與結(jié)論

植物生根率與基質(zhì)含水量密切相關(guān),不定根形成時期的基質(zhì)含水量應(yīng)維持在70%～80%,這樣既能滿足根系對水分的需求又不易導(dǎo)致其腐爛[23]。本試驗無糖組培條件下基質(zhì)含水量為80%,獼猴桃組培苗的根系生長良好(表1)。有糖組培生根采用瓊脂作為支撐材料,其凝固后結(jié)構(gòu)致密,通透性差,故根系形態(tài)發(fā)育受阻;而無糖組培使用疏松多孔的蛭石,有助于幼苗根系的伸展,同時搭配強制換氣利于根系的呼吸作用,這與蘋果[5]和茶[8]的無糖組培生根研究結(jié)果相一致。

研究表明,提高培養(yǎng)容器內(nèi)氣體交換頻率,可以改善馬鈴薯[26]和桉樹[27]的氣孔功能,提高其存活率與生根率,有利于不定根的形成和發(fā)育[11]。在本試驗中,獼猴桃無糖組培生根過程中,CO2富集和強制換氣組合的生根效果顯著好于自然換氣?？赡苡捎趶娭茡Q氣改善了內(nèi)部氣體環(huán)境,影響了組培苗生理代謝從而誘導(dǎo)不定根快速表達(dá)。因品種基因型不同,‘郁香’和‘臍紅’組培苗對于CO2濃度和強制換氣時間的適應(yīng)存在一定差異。

POD被認(rèn)為與不定根的形成發(fā)育密切相關(guān)[28]。本研究中,無糖組培條件下‘郁香’和‘臍紅’分別在根系快速產(chǎn)生的第7天和第14天時,POD活性達(dá)到高峰且顯著高于對照(圖1-A、圖1-B,圖2),說明無糖組培誘導(dǎo)獼猴桃莖尖快速生根可能與此時POD活性較高有關(guān)[29],而POD活性峰值出現(xiàn)時間有所差異可能與品種有關(guān)。PPO能催化酚類物質(zhì)且與IAA形成一種生根輔助因子“IAA-酚酸復(fù)合物”[30]。無糖組培條件下,‘郁香’和‘臍紅’的PPO活性分別在第1天和第4天時最高[7.33和10.09 U/(g·min)],因而PPO可能參與誘導(dǎo)培養(yǎng)初期獼猴桃莖尖不定根的形成[31]。在本試驗生根培養(yǎng)第7天,無糖組培條件下的‘臍紅’和‘郁香’IAAO活性均達(dá)到最高峰且顯著高于對照(圖2),說明IAAO活性的增強利于不定根形成。此后IAAO活性一直保持較低水平,這與前人研究的生根后期IAAO活性降低促進(jìn)不定根快速伸長的結(jié)果相一致[30,32]。

研究表明,相比傳統(tǒng)有糖組培,植物在無糖組培條件下會產(chǎn)生更多的內(nèi)源激素[7]。研究發(fā)現(xiàn),千年桐、月季、納塔櫟進(jìn)行嫩枝扦插時,生根中期IAA含量快速下降,待不定根伸長時其含量緩慢增加,并逐步接近扦插初期水平,這與本試驗的IAA變化規(guī)律高度一致,說明生根前期較高濃度的IAA能夠促進(jìn)根原基形成,后期高濃度IAA促進(jìn)不定根的伸長。ABA可促進(jìn)細(xì)胞分裂或與其他激素相互作用,從而刺激某些植物插穗生根[33-35]。周幼成[36]研究發(fā)現(xiàn),ABA能夠誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉,降低蒸騰作用從而減少水分流失。在無糖組培第7天增加了強制換氣的流量,‘臍紅’和‘郁香’為更好保護自身,利用ABA調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉,這解釋了ABA含量激增的緣故。同時內(nèi)源ABA含量的增加,可以提高根系的吸水性和溢泌速率,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成,增加根冠比[37]。研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源GA3對無性繁育中不定根的形成因物種而異[38]。在本試驗中,培養(yǎng)至第7天后GA3含量逐步上升,且無糖組培的GA3含量顯著高于有糖組培,推測高濃度的GA3可能有利于不定根的快速伸長以及次級根的形成。

綜上所述,無糖組培能顯著改善獼猴桃無性繁殖的生根效率,提高生根質(zhì)量。在無糖組培生根過程中內(nèi)源激素和相關(guān)酶活性變化復(fù)雜,且共同參與生根機制。本研究建立的新型無糖組培誘導(dǎo)莖尖快速生根技術(shù),為獼猴桃種苗工廠化快速繁育奠定了理論基礎(chǔ)。