振腹法對多囊卵巢綜合征大鼠血糖、胰島素水平及p38絲裂原活化蛋白激酶蛋白表達的影響

趙思雨 沈潛 付國兵 謝丹丹 李晶磊 李拓 趙峻嘹 齊恒 柏潔 耿楠

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是一種常見的女性生殖代謝內(nèi)分泌紊亂疾病,主要臨床表現(xiàn)為肥胖、月經(jīng)紊亂、高雄激素血癥、稀發(fā)排卵或無排卵、多毛、痤瘡等,多發(fā)于生育期女性,發(fā)病率為6%～10%,是導(dǎo)致女性不孕的主要原因,會增加女性患心腦血管疾病、婦科疾病、2型糖尿病及遠(yuǎn)期并發(fā)癥的風(fēng)險,嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量、生育及遠(yuǎn)期健康。PCOS的發(fā)病機制尚不明確,因其臨床表現(xiàn)及治療療效的高度異質(zhì)性,目前對于該病的診療仍未達成共識,大多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為本病由于下丘腦—垂體—卵巢軸功能出現(xiàn)紊亂導(dǎo)致。多囊卵巢綜合征患者的一大特點是內(nèi)分泌紊亂,有研究表明,PCOS患者有更高的血糖異常率[1],患糖尿病風(fēng)險更高,性激素、胰島素和血糖檢測能夠?qū)Χ嗄衣殉簿C合征的臨床診斷提供非常重要的數(shù)據(jù)支持[2]。p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)主要參與細(xì)胞的分裂與增殖,在磷酸化過程中可促進其他胞質(zhì)蛋白磷酸化,p38 MAPK可能是PCOS卵巢多卵泡發(fā)育的基礎(chǔ),研究表明,PCOS卵巢粒細(xì)胞較于非PCOS卵巢粒細(xì)胞中,磷酸化絲裂原活化蛋白激酶p38(p-p38 mitogen-activated protein kinase,p-p38 MAPK)表達量高[3]。振腹法是作用于腹部神闕穴的一種特色手法,研究表明,振腹法可以改善大鼠卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu),降低性激素、炎癥因子表達水平,對PCOS大鼠有一定治療作用[4]。基于以上前提,本研究應(yīng)用振腹法對PCOS模型大鼠進行干預(yù),探究振腹法治療對PCOS大鼠血糖水平的調(diào)節(jié)作用,及振腹治療對p38 MAPK蛋白表達與卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,為振腹法治療PCOS的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究依據(jù),現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級SD雌性大鼠40只,6周齡,體質(zhì)量(180±20) g,性成熟,未交配,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)許可證編號[SCXK(京)20166-0006]。屏障環(huán)境下室內(nèi)溫度(23±1)℃,濕度(45±5)%,日光燈光照,普通清潔級鼠飼料飼養(yǎng),自由飲用水。

1.2 主要試劑及儀器

實驗試劑:來曲唑:0.25 mg/片×10片/盒(國藥準(zhǔn)字H19991001,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司),二甲雙胍:0.5 g/片×20片/盒(國藥準(zhǔn)字H20023370,中美上海施寶貴制藥有限公司),1%羧甲基纖維素鈉溶液(Coolaber,批號:C9230),堿性美藍染液(泰科美生物科技有限公司),0.01 mol/L磷酸緩沖鹽(phosphate buffered saline, PBS),INS酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(武漢云克隆有限公司,CEA448Ra),蛋白提取液(MDL,MDL91201),蛋白酶抑制劑(MDL,MD912893),BCA蛋白濃度測定kit(MDL,MD913053),SDS-PAGE預(yù)制膠套裝kit(MDL,MD911919),中等蛋白分子量marker(Thermo,26617),p38(Bioss,bs-1640R),p-p38(Bioss,bs-5477R),二抗(MDL,MD932485),75%酒精,2%戊巴比妥鈉。

實驗儀器:電子天平、移液槍、血糖儀(強生穩(wěn)豪)、血糖試紙(強生穩(wěn)豪)離心機(恒諾儀器 AXTGL16M)、微量加樣器(Gilson公司,法國)、電熱恒溫水浴槽(上海一恒恒溫設(shè)備廠,HWS-24)、PVDF膜(0.22 μm)(Millipore,美國,ISEQ00010)、3MM 濾紙(Whatman,英國,3030861)、脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司,TS-100)、電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司,BG-subMIDI)、低溫離心機(Sigma,德國,3-30K)、SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(BIO-Rad,美國)、凝膠成像系統(tǒng)(UVP,美國,GelDoc-It310)、ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-rad,美國,170-8280)、切片機(Leica RM2235)、石蠟包埋機(Leica G1150H)。

1.3 動物分組與造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5天之后采用隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、二甲雙胍組、振腹組,每組10只。建立PCOS大鼠模型:選擇芳香花酶抑制劑造模法[5],來曲唑以0.125 mg/mL的濃度劑量溶于1%羧甲基纖維素鈉中,模型組、二甲雙胍組及振腹組大鼠連續(xù)以8 mL/(kg·d)的劑量灌服21天;空白組等濃度等體積羧甲基纖維素溶液連續(xù)灌胃21天。

模型建立成功的評定標(biāo)準(zhǔn)[6]:(1)陰道涂片:觀察大鼠陰道上皮細(xì)胞形態(tài)改變,監(jiān)測動情周期。從造模第7天起直至造模第21天,每日上午8:00～9:00用生理鹽水浸潤的棉簽在大鼠陰道內(nèi)順時針旋轉(zhuǎn)1圈后抽出,將大鼠陰道分泌物順時針旋轉(zhuǎn)均勻涂抹于載玻片上,95%酒精脫水、固定后,用堿性美藍染液染色5分鐘,顯微鏡下觀察上皮細(xì)胞形態(tài)。造模成功評價:涂片中上皮細(xì)胞持續(xù)1周以上以白細(xì)胞為主,未見陰道角化細(xì)胞,提示大鼠動情周期失常,且處于動情間期、無排卵。(2)血清T檢測,造模第21天晚7點禁食12小時,次日早上每組大鼠各隨機取1只大鼠處死,采腹主動脈動脈血,分離血清用于ELISA法檢測血清T水平,取卵巢組織觀察卵巢組織形態(tài)改變。造模成功評價:模型組、二甲雙胍組、振腹組大鼠血清T較空白組均顯著升高(P<0.05),卵巢組織較空白組出現(xiàn)多囊樣改變。符合以上2項,可確定造模成功,每組保留9只。

1.4 干預(yù)方法

空白組及模型組大鼠自由飲食、飲水。二甲雙胍組,實驗第22天起予二甲雙胍溶于1%羧甲基纖維素鈉溶液,以二甲雙胍43 mg/(kg·d),1%羧甲基纖維素鈉溶液4 mL/(kg·d)的劑量灌服[7-8],連續(xù)給藥15天。振腹組大鼠實驗第22天起,同一操作者振腹手法干預(yù),每只大鼠振腹治療后休息5分鐘后再進行下一只大鼠手法干預(yù)。具體干預(yù)操作如下:操作者左手固定大鼠,使大鼠腹部朝上,參照李忠仁[9]主編的《實驗針灸學(xué)》選取神闕穴。根據(jù)類比法,人手中指指腹面積與大鼠前爪面積近似相等,故選取右手中指置于大鼠神闕穴,進行振腹法操作,每只大鼠每次操作15分鐘,每天干預(yù)1次,連續(xù)干預(yù)15天。

最后1次干預(yù)后大鼠禁食12小時,腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg,大鼠昏迷后,腹主動脈取血4 mL,靜置30分鐘,放入多孔離心機中,3 000 r/min,4℃離心15分鐘,取上清液注入一次性EP管內(nèi)密封,-80℃冰箱保存;取雙側(cè)卵巢,眼科剪去除輸卵管、卵巢表面脂肪組織及包膜,生理鹽水沖洗后紗布吸拭表面水分,分別將雙側(cè)卵巢用4%多聚甲醛固定及-80℃冰箱保存。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 4%多聚甲醛固定的卵巢進行脫水、石蠟包埋、切片,制作HE染色病理切片,光鏡下進行組織形態(tài)學(xué)分析。

1.5.2 空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、血清胰島素(fasting serum lisulin,FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(homeostatic model assessment for insulin resistance,HOMA-IR) 取大鼠尾靜脈血,血糖儀測定FPG,取大鼠血清,采用酶聯(lián)免疫法測定FINS,嚴(yán)格按照試劑盒操作。

HOMA-IR=FPG水平×FINS水平/22.5

1.5.3 p38 MAPK蛋白表達 使用蛋白免疫印跡法對卵巢組織p38 MAPK蛋白表達進行測量。取大鼠卵巢組織,加液氮進行勻漿,加入1 mL PBS離心5分鐘。吸干殘留的PBS,估計樣品體積,加入5倍體積裂解液,混勻,冰浴中以最大功率超聲破碎細(xì)胞(3×10秒),4℃低溫離心機12 000 r/min離心15分鐘,取上清液。利用BCA法檢測蛋白總量。配膠、灌膠、上樣、電泳操作。以甲醇活化的PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜后小心取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中,室溫、搖床上緩慢搖動狀態(tài)下封閉1小時。封閉后,加入一抗于4℃孵育過夜,用1×TBST洗滌PVDF膜3次,(室溫下緩慢搖動洗滌)每次10分鐘。將二抗用1×TBST稀釋300倍;將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中(室溫、避光緩慢搖動)作用60分鐘。用1×TBST洗膜,洗去游離二抗。按1∶1(v/v)混合ECL試劑盒中兩種液體;將上述混合液均勻鋪在PVDF膜表面,室溫作用4分鐘。抖掉膜上液體,將其放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察比較

鏡下觀察各組大鼠卵巢組織切片,空白組可見正常卵母細(xì)胞、黃體,顆粒細(xì)胞層排列豐厚。模型組大鼠卵巢出現(xiàn)囊性卵泡,卵巢皮質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞明顯增生,顆粒細(xì)胞層數(shù)減少。二甲雙胍組及振腹組大鼠卵巢形態(tài)與模型組相比,囊性卵泡減少,顆粒細(xì)胞層增厚,可見卵母細(xì)胞及少量黃體。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察(HE染色,×100)

2.2 各組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR水平比較

與空白組比較,模型組大鼠FPG、FINS及HOMA-IR明顯升高(P<0.05),說明大鼠血糖水平升高,存在胰島素抵抗。與模型組比較,二甲雙胍組和振腹組大鼠的FPG、FINS、HOMA-IR水平顯著降低(P<0.05)。二甲雙胍組與振腹組相比較,FPG水平相近(P>0.05)。由此可見,振腹治療可以改善PCOS模型大鼠FPG、FINS水平,對PCOS伴胰島素抵抗有一定治療作用,且降低FPG水平效果與二甲雙胍相近。見表1。

表1 各組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR比較

2.3 各組大鼠p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達水平比較

與空白組比較,模型組大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平明顯較高(P<0.05)。與模型組比較,二甲雙胍組和振腹組的大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平降低(P<0.05)。二甲雙胍組與振腹組相比較,p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平相近(P>0.05)。由此可見,振腹治療可以降低p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平。見表2,圖2。

表2 各組大鼠p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白相對表達量比較

圖2 各組大鼠p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達量比較

3 討論

根據(jù)PCOS的臨床表現(xiàn)及特點,中醫(yī)醫(yī)家將之歸為“月經(jīng)后期”“月經(jīng)量少”“閉經(jīng)”“癥瘕”“不孕”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為本病的病機主要與腎虛、脾虛、肝郁、沖任損傷、天癸失序、痰瘀胞宮有關(guān),同時認(rèn)為本病病因以腎虛為本。腎虛體現(xiàn)在腎陽虛和腎陰虛兩方面。腎陽虛,腎陽不足,一則導(dǎo)致經(jīng)血化生無力,二則腎的溫煦作用無力,不能推動血脈正常運行,血脈艱澀難行,故可見月經(jīng)后期、月經(jīng)量少、閉經(jīng)等癥狀。腎陰虛,腎精不足,胞宮不得滋養(yǎng),卵子發(fā)育成熟能力減弱,不能按期增殖及發(fā)育成熟,故可見卵巢組織細(xì)胞多空泡而無成熟卵細(xì)胞,致患者無孕。肝郁脾虛,血液滋養(yǎng)不足,致沖任損傷、天癸失序,血海不能充盈,導(dǎo)致患者出現(xiàn)月經(jīng)推遲、閉經(jīng)乃至不孕。脾虛生痰,痰瘀互結(jié)于胞宮,可見卵巢多囊樣改變;痰瘀泛溢四肢肌膚,致形體肥胖、多毛痤瘡等PCOS典型癥狀癥狀。本病中醫(yī)醫(yī)家治療多從腎、脾、肝論治。

振腹法治療PCOS以調(diào)理腎虛為本,兼治脾虛、肝郁,同時調(diào)節(jié)沖任,推行氣血津液,活血化瘀,重視先后天之本的調(diào)養(yǎng)與顧護。振腹療法是臧?？扑鶆?chuàng)立及其弟子三代人發(fā)展而來,主要手法掌振法是以醫(yī)者手掌心勞宮穴正對患者腹部神闕穴,掌跟正對患者關(guān)元穴,中指對應(yīng)患者任脈中脘穴,食指和無名指對應(yīng)患者腎經(jīng),拇指和小指置于胃經(jīng),腕關(guān)節(jié)帶動手掌指間關(guān)節(jié)在腹部進行頻率為300～400次/分鐘的振動;操作幅度小、壓力適中、刺激量小,通過手與局部的共振傳導(dǎo)至深層組織和遠(yuǎn)端,具有益氣健脾、溫陽散寒、和中理氣、調(diào)理沖任、寧心安神、交通心腎等功效,臨床中應(yīng)用于內(nèi)分泌、婦科、兒科、心血管等疾病的治療并取得良好療效[10]。神闕穴是振腹法治療PCOS的重要穴位。神闕穴具有培元固本、溫陽固脫、健脾益胃的功效,是神氣通行之門戶,先后天神氣在此處交匯并藏于此處,并通過沖、任、督、帶脈將全身經(jīng)絡(luò)聯(lián)系在一起,為五臟六腑之本、十二經(jīng)之根。通過振腹法刺激神闕穴,可激發(fā)腎中精氣、調(diào)理脾胃、顧護胃氣、暢通全身經(jīng)絡(luò),達到治療PCOS的作用。近年來,筆者將振腹法治療用于PCOS臨床治療,取得一定療效。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,多囊卵巢綜合征,是一種多病因、多系統(tǒng)的女性生殖代謝內(nèi)分泌紊亂疾病,主要臨床表現(xiàn)為肥胖、月經(jīng)紊亂、高雄激素血癥、稀發(fā)排卵或無排卵、多毛、痤瘡等,多發(fā)于生育期女性,發(fā)病率為6%～10%[11]。PCOS與血糖、胰島素水平有密切關(guān)聯(lián)。PCOS患者有更高的血糖異常率,多數(shù)PCOS患者存在血糖升高的情況[1]。有研究表明,高胰島素血癥和胰島素抵抗對卵泡發(fā)育存在一定影響。PCOS高胰島素血癥使卵泡對卵泡刺激素的敏感性增加,反饋至垂體分泌的卵泡刺激素下降,導(dǎo)致卵泡提前閉鎖,形成無排卵[12]。另有研究表明,胰島素抵抗可以通過抑制肝臟合成胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白,增加卵泡內(nèi)膜細(xì)胞中的黃體生成激素,使非優(yōu)勢卵泡提前閉鎖[13]。胰島素抵抗亦可直接作用于卵泡顆粒細(xì)胞,抑制卵泡的生長發(fā)育,阻礙排卵發(fā)生[14]。p38 MAPK信號通路與PCOS的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián),p38是p38 MAPK信號通路參與細(xì)胞減數(shù)分裂、有絲分裂的重要信號蛋白[15],卵巢組織的p38 MAPK的磷酸化和過度表達會影響卵細(xì)胞的生長發(fā)育[3],促進卵巢的多囊樣變。p38作為MAPK信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,參與胰島素多種靶向器官的能量代謝[16],有研究表明,卵巢p-p38 MAPK蛋白表達增加,導(dǎo)致PCOS胰島素通路信號異常表達[17]。因此,p38 MAPK蛋白的表達與PCOS患者的發(fā)病、卵巢組織形態(tài)改變密切相關(guān),同時影響PCOS患者血糖、胰島素水平。

本研究結(jié)果顯示,相比模型組大鼠,振腹組大鼠卵巢組織形態(tài)改善,FPG、FINS、HOMA-IR水平降低,FPG水平與二級雙胍組相近,表明振腹治療可以改善PCOS卵巢組織形態(tài),調(diào)節(jié)PCOS大鼠血糖、胰島素水平,改善PCOS模型大鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。相比模型組大鼠,振腹組、二甲雙胍組大鼠卵巢p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達量降低,說明振腹法可以改善卵巢p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達水平,進而改善PCOS癥狀;振腹治療可能通過降低p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表達水平,調(diào)節(jié)PCOS血糖、胰島素水平,但其機制還需要進一步證明。

通過本研究,表明振腹治療能夠降低PCOS的FPG、FINS、HOMA-IR、卵巢p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達水平,改善卵巢組織形態(tài),且在降低血糖的作用上與二甲雙胍相近。二甲雙胍是治療PCOS的重要藥物,可通過增加外周組織對葡萄糖的攝取利用,抑制肝糖異生和腸道葡萄糖的吸收,改善胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),增加胰島素敏感性等途徑改善PCOS癥狀,PCOS伴胰島素抵抗的患者推薦使用二甲雙胍[18]。本研究為振腹法治療PCOS提供一定的科學(xué)依據(jù),為進一步探討振腹調(diào)節(jié)p38 MAPK信號通路改善PCOS癥狀及血糖、胰島素水平的機制提供研究基礎(chǔ)。