稅 鈿 夏澤敏 聶明霞 廖 娜 陳彥君 梁文耀 李鑫宇 譚建華 席紹峰

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院,國家化妝品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(廣州),廣州 511447)

三七為五加科多年生草本植物,是我國傳統(tǒng)名貴中藥材,具有活血化瘀,消腫止痛等功效。三七提取物作為中國特色植物原料,被廣泛用于功效型牙膏,對口腔潰瘍、牙菌斑、牙齦炎和牙齦出血等有顯著的療效[1,2]。但部分產(chǎn)品虛假宣稱,實則不含所標示的三七提取物,也達不到所宣稱的功效,甚至一些不法廠家通過添加違禁藥物來達到所宣稱的消腫、抗炎等功效。這些情況不僅影響行業(yè)秩序,更嚴重損害消費者的權益和健康。三七的有效成分為三七總皂苷,其中三七皂苷R1是三七總皂苷的特征化合物,人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1是總皂苷中含量最多的兩種成分[3～5]。通過檢測三七皂苷幾種特征物質(zhì)的含量可表征是否含有三七提取物,為牙膏功效宣稱提供技術支撐。另外考慮到人參提取物液被應用在功效型牙膏中,其特征組分與三七較為相似,主要為人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re[3]。為提高方法的適用范圍,本方法擬建立三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及人參皂苷Re等四種組分的分析方法。

通過國內(nèi)外相關標準和文獻資料檢索,近年來在三七和人參提取物有效成分的檢測方面,檢測方法主要有薄層掃描法[4,6]、高效液相色譜法[7～12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13～15]等。而針對牙膏產(chǎn)品,主要有薄層色譜法[4]和高效液相色譜法[7～9]?，F(xiàn)有標準中,《功效型牙膏(QB/T 2966-2014)》附錄中規(guī)定了液相色譜紫外檢測法測定牙膏中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1三種組分的檢測方法,但該方法前處理較復雜,耗費時間長;由于幾種皂苷均為四環(huán)三萜類結構,結構相似,方法的色譜分離時間長,嚴重影響檢測效率;人參皂苷類化合物在紫外區(qū)的吸收較弱,容易受到樣品基質(zhì)的干擾。此外,當采用液相色譜法對牙膏中四種皂苷類物質(zhì)進行測定時,三七皂苷Rg1、人參皂苷Re在色譜柱上分離度差,目前有文獻報道使用二維柱切換高效液相色譜法[9]來對四種皂苷進行分析,但三七皂苷Rg1、人參皂苷Re的分離度仍不理想。而且,牙膏中提取物添加量一般比較低,液相色譜法難以滿足檢測要求。鑒于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有很好的分辨率和靈敏度,本方法擬采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牙膏中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及人參皂苷Re,為廣大日化行業(yè)的檢測機構和企業(yè)用戶提供一種快捷簡便、準確高效的測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津超高效液相色譜儀-SCIEX AB 5500+三重四極桿質(zhì)譜儀(美國賽默飛公司);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);IKA MS3 digital渦旋振蕩器(德國IKA公司);SK8200H超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司);BS 224S電子天平(德國賽多利斯公司)。

三七皂苷R1(CAS號80418-24-2)、人參皂苷Rg1(CAS號22427-39-0 )、人參皂苷Rb1(CAS號41753-43-9)及人參皂苷Re(CAS號52286-59-6),純度均大于98%,美國Stanford Chemicals公司;甲醇,色譜純,德國Merck公司;乙腈,色譜純,德國Merck公司;甲酸,分析純,上海安譜科學儀器有限公司;醋酸銨,分析純,廣州化學試劑廠;石英砂,分析純,廣州化學試劑廠,超純水,電阻率為18.2 MΩ·cm。

甲醇水溶液(90%,體積分數(shù)):準確移取900 mL甲醇置于適量水中,再加水稀釋至1000mL,混勻。

醋酸銨水溶液(10mmol/L,含0.1%甲酸):準確稱取0.7708 g醋酸銨,于燒杯中用1L純水溶解,準確量取1mL甲酸至燒杯中,混勻。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及人參皂苷Re的標準品10mg (精確至0.1mg)于10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度約為1000mg/L的標準儲備液。使用時,稀釋至所需要的質(zhì)量濃度的標準工作溶液。

1.3 樣品處理

將牙膏試樣擠出約20mm后,準確稱取試樣0.5g(精確到0.001g)于10mL具塞比色管中,加入約0.5g石英砂,混勻,再準確加入90%甲醇水10mL,渦旋混勻后超聲提取20min,放置冷卻后經(jīng)0.22μm濾膜過濾后待測。

1.4 儀器條件

色譜條件:色譜柱:Phenomenex Kintext C18(3×100mm,2.6μm);流動相:A:10mmol/L醋酸銨水溶液(含0.1%甲酸),B:乙腈;梯度洗脫程序(0～3min,80% A;3～8min,80%～30% A;8～8.1min,30%～10% A;8.1～11min,10% A;11～11.1min,10%～80% A;11.1～14min,80%A);流速:0.3mL/min;柱溫:30℃;進樣體積:5μL。

質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧離子源,負離子模式;噴霧電壓:4500KV;干燥氣壓力:50psi;氣簾氣壓力:20psi;碰撞氣壓力:9psi;離子源溫度:450℃;掃描模式:多反應監(jiān)測(MRM)模式(223.0)。四種皂苷的母離子、子離子、碰撞能量見表1。

表1 四種皂苷的質(zhì)譜參數(shù)

2 結果與討論

2.1 提取方式及溶解的選擇

根據(jù)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re的結構以及理化性質(zhì),對提取溶劑和提取方法進行考察,篩選合理的提取方法。通過查詢資料可知,三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的Log p值在2.5～4之間,具有一定的脂溶性,在有機溶劑中溶解性較好。同時,考慮到牙膏產(chǎn)品在水中分散效果較好,本方法采用有機溶劑-水體系作為提取溶劑?？疾炝瞬煌壤募状妓芤?50%,70%,90%,100%)對牙膏樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re的提取效果。隨著有機相比例增加,樣液變澄清,樣液變得容易經(jīng)濾膜過濾,當有機相比例超過90%,樣品容易成團,不易分散。對實際樣品添加濃度100μg/kg的人參皂苷Re、三七皂苷R1和濃度為200μg/kg的人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1,并對樣液進行測定。結果顯示,在甲醇水溶劑體系中,不同比例有機溶劑對人參皂苷Re、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的提取率相似,但人參皂苷Rb1的提取率隨甲醇比例增加而有所提高。因此選擇90%甲醇水作為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re的提取溶劑。另外,為了提高牙膏在提取溶劑中的分散效果,本方法選擇加入適量石英砂對牙膏試樣進行輔助分散。

2.2 色譜柱的選擇

考察了Waters ACQUITY HSS C18(2.1×100mm,1.8μm)、Waters ACQUITY BEH C18(2.1×100mm,2.7μm)、Agilent Poroshell 120 SB C18(2.1×100mm,2.7μm)、Phenomenex Kintext C18(3×100mm,2.6μm)等不同品牌的C18色譜柱對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re等四種組分和樣品基質(zhì)的分離效果。結果顯示,在優(yōu)化的流動相條件下,各C18色譜柱上四種組分的峰型都尖銳對稱,雖然四種組分保留時間比較接近,但不影響質(zhì)譜分析結果,且C18色譜柱通用性好。綜合考慮,本方法采用C18色譜柱作為分離色譜柱。

2.3 流動相的選擇

比較了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水和乙腈-10mM醋酸銨水溶液(0.1%甲酸)幾種流動相體系對目標物保留時間和峰型的影響。結果表明當乙腈作為有機相時,化合物峰型更對稱,且隨著甲酸濃度增加,化合物響應有所增強,在乙腈-10mM醋酸銨水溶液(0.1%甲酸)作為流動相時,醋酸銨大大提高了化合物離子化效率,四種皂苷的響應最高。比較5、10、15、20mM的添加0.1%甲酸的醋酸銨溶液作為水相的分析結果發(fā)現(xiàn),隨著醋酸銨濃度的增加,四種化合物的響應都增加,增加到10mM后,信號增加不明顯,且鹽濃度過高可能會析出后磨損液相柱塞桿或在質(zhì)譜離子源口結晶。因此,選用乙腈-10mM醋酸銨水溶液(0.1%甲酸)作為流動相。

圖1 四種皂苷混合標準溶液的總離子色譜圖(50ng/mL)

圖2 陽性樣品總離子色譜圖

2.4 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

比較了正負兩種電離模式下四種皂苷的響應強度。在正離子模式下,出現(xiàn)[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+準分子離子峰,負離子模式下有[M-H]-、[M+CH3COO-]-準分子離子峰。當選擇[M+CH3COO-]-峰作為母離子時,化合物信號響應強度最高。

四種皂苷的分子結構都含相同的皂苷苷元和不同的糖基,通過對[M+CH3COO-]-峰產(chǎn)生的離子碎片進行分析發(fā)現(xiàn),在質(zhì)譜裂解過程中有相似的規(guī)律。通過調(diào)節(jié)碰撞能,四種準分子離子首先斷裂失去甲酸根,形成[M-H]-的子離子,人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1再進一步失去1個葡萄糖基,分別形成m/z為945.5和637.5的特征離子;人參皂苷Re失去一個葡萄糖基和鼠李糖基,形成m/z為637.5的特征離子;三七皂苷R1則失去一個葡萄糖基和阿拉伯糖基形成m/z也為637.7的特征離子。從而確定4種皂苷的質(zhì)譜參數(shù)(見表1)。

2.5 離子源溫度的選擇

比較450℃、500℃、550℃、600℃ 4個離子源溫度對皂苷信號響應強度的影響。實驗結果顯示,隨著溫度升高,四種化合物的響應均成下降趨勢,當溫度超過500℃時,響應下降更為明顯。離子源溫度過低,會降低氣化和霧化效率,因此,本方法選擇450℃作為離子源溫度。

2.6 線性方程和檢出限

在1.4儀器條件下對系列標準工作溶液進行測定。以各目標物質(zhì)量濃度(x)為橫坐標,對應峰面積(y)為縱坐標,分別繪制標準工作曲線。對陰性樣品添加適量4種皂苷混合標準溶液,按照試樣前處理方法和儀器條件進行測定,以信噪比S/N≥3確定方法檢出限,以信噪比S/N≥10確定方法定量限。線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限見表2。

表2 四種目標物的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、方法檢出限和定量限

由表2可知,人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和三七皂苷R1的質(zhì)量濃度在各自范圍內(nèi)與相應色譜峰面積呈良好的線性關系,人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1的方法檢出限為0.04μg/g,方法定量限為0.10μg/g;人參皂苷Re和三七皂苷R1的方法檢出限為0.02μg/g,方法定量限為0.05μg/g。

2.7 精密度試驗及加標回收試驗

選用二氧化硅基質(zhì)、碳酸鈣基質(zhì)和磷酸氫鈣基質(zhì)3種空白牙膏樣品為加標基質(zhì),按1.3方法進行處理,分別加入低、中、高3個加標水平的皂苷標準溶液(其中人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1添加0.1μg/g、10μg/g、100μg/g三個濃度水平,人參皂苷Re和三七皂苷R1添加0.05μg/g、10μg/g、100μg/g三個濃度水平),在1.4儀器條件下平行測定6次,測定結果見表3。由表3可知,三七皂苷R1的平均回收率在90.0%～102.1%之間,相對標準偏差(RSD,n=6)在1.42%～5.84%之間;人參皂苷Rg1的平均回收率在92.0%～102.0%,相對標準偏差(RSD,n=6)在1.69%～5.61%之間;人參皂苷Rb1的平均回收率在90.3%～97.7%之間,相對標準偏差(RSD,n=6)在2.26%～5.10%之間;人參皂苷Re的平均回收率在89.0%～101.7%之間,相對標準偏差(RSD,n=6)在1.90%～5.87%之間。結果表明,本方法具有良好的準確度和精密度,滿足分析要求。

表3 精密度試驗和加標回收試驗結果

2.8 實際樣品的分析

采用本方法對市售的40批次牙膏樣品(其中16批次二氧化硅基質(zhì)牙膏,13批次碳酸鈣基質(zhì)牙膏,11批次磷酸氫鈣基質(zhì)牙膏)進行四種皂苷的測定。結果顯示,有4支牙膏4種皂苷均有檢出,另外有1支牙膏檢出人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1。人參皂苷Rb1的檢出量為0.24～318.74μg/g,人參皂苷Rg1添加量為0.18～698.92μg/g,人參皂苷Re添加量為0.71～50.89μg/g,三七皂苷R1添加量為0.05～92.11μg/g。所有陽性樣品在成分表中均標示添加了三七提取物或者粉末,但同時存在有產(chǎn)品標示添加了三七提取物但未檢出相關成分的情況。

3 結論

本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術建立了牙膏中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及人參皂苷Re的檢測方法。對提取條件、色譜條件和質(zhì)譜條件等進行了優(yōu)化,并將該方法應用于不同基質(zhì)牙膏的檢測。結果表明,該方法能對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及人參皂苷Re進行準確測定,且方法精密度好,滿足相關檢測需求,可為牙膏產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控提供有力的技術支撐。