骨髓間充質干細胞衰老與骨質疏松癥的研究進展*

李小云， 林 青， 王昊宇， 歐陽欣辰， 楊 麗， 朱曉峰，3，4， 張榮華△

（1暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632；2暨南大學中醫(yī)學院，廣東 廣州 510632；3暨南大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510630；4廣東省中醫(yī)藥信息化重點實驗室，廣東 廣州 510632）

骨質疏松癥（osteoporosis， OP）是臨床上常見的老年病，以骨量減少、骨微結構退化為特征，導致骨脆性及骨折風險增加。2018年國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的最新流行病學調查報告顯示，我國40~49 歲人群中OP 的患病率為3.2%，50 歲以上人群為19.2%，65歲以上則高達32.0%［1］，隨著年齡的增長OP 患病率逐級遞增，提示衰老與OP的發(fā)生密切相關。

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）是一種具有多向分化潛能的細胞，其成骨分化是關系機體骨形成、維持骨代謝正常的重要環(huán)節(jié)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs 在OP 的防治過程中表現(xiàn)出巨大潛力，在各種骨組織工程或骨修復工程中被廣泛運用，但其面臨由于細胞衰老引發(fā)的活力下降或成骨分化能力不足等問題［2］。因此，深度解析BMSCs的衰老機制，以此探尋OP的防治策略，可能是一個重要的突破口?；诖?，本文重點關注OP 與BMSCs 衰老的關系及BMSCs 衰老的機制，以期為OP的防治研究提供更多的參考依據(jù)。

1 OP與衰老的關系

有研究對比了平均年齡為78 歲的老年健康女性和平均年齡為27 歲的年輕健康女性骨組織中衰老相關指標的表達，發(fā)現(xiàn)老年女性骨組織中不僅衰老相關因子p16 和p21 的表達顯著增加，還伴有12個衰老相關分泌表型相關因子表達的顯著上調。該團隊接著在小鼠研究中也發(fā)現(xiàn)，通過對6 月齡、24 月齡小鼠的骨細胞、成骨細胞、成骨祖細胞及BMSCs中的衰老相關因子含量進行分析，發(fā)現(xiàn)p16 的表達在24 月齡小鼠的上述骨系細胞中均顯著增加［3］。Valdes 等［4］開展了2 150 名18~79 歲的女性流行病學相關研究，發(fā)現(xiàn)擁有更長的端粒長度的女性其臨床患OP 的風險也就越低；患有OP 的女性與正常女性之間的端粒酶長度差異相當于5 年端粒的衰老程度。由上可知，OP的發(fā)生與衰老具有密切關聯(lián)。

2 BMSCs衰老與OP的關系

BMSCs 是維持骨代謝平衡的關鍵干細胞，因其擁有較好的干細胞植入特性及多向分化潛能等特點而備受關注。更為重要的是，BMSCs 的成骨分化是成骨細胞祖細胞的重要來源；成骨細胞則是機體合成骨質、調控礦化、促進骨形成的關鍵功能細胞［5］。因此，足夠來源的成骨細胞是保證機體骨骼重建，維持骨代謝平衡的關鍵。

BMSCs進入衰老狀態(tài)后，其成骨分化能力明顯減弱，既往的研究廣泛報道了BMSCs 衰老影響包括OP在內的骨代謝性疾病的進程［6］。研究顯示，老年大鼠不僅出現(xiàn)骨代謝紊亂，其來源的BMSCs也出現(xiàn)衰老相關基因p16表達增加、線粒體皺縮等明顯衰老特征［7］。同樣，OP 大鼠來源的BMSCs 也表現(xiàn)為成骨分化能力顯著降低，衰老分泌相關表型明顯增加，其線粒體功能也遭到明顯破壞［8］。通過DNA 損傷或端粒侵蝕等方式誘導的BMSCs衰老均可導致骨形成能力降低、破骨細胞骨吸收作用增強及OP 的發(fā)生［9］。由此可見，BMSCs衰老可能是OP骨代謝失衡的重要病理機制。

3 BMSCs衰老誘發(fā)OP骨代謝失衡的相關機制

3.1 自由基學說 生理狀態(tài)下，生物體內抗氧化酶、非酶抗氧化劑與自由基的合成代謝處于動態(tài)平衡；但隨著年齡增長或受到某些衰老信號的刺激，使得機體抗氧化劑合成不足或自由基過量產生，引起多種細胞器遭到破壞，尤其是線粒體功能的損傷，引發(fā)糖、脂質等物質的合成與代謝紊亂，導致機體引發(fā)OP等衰老相關疾病。

BMSCs 的增殖和成骨分化與細胞內的氧化應激水平密切相關。通常，活性氧的增加會抑制BMSCs增殖，使細胞偏向于成脂分化，而成骨分化能力明顯減弱，細胞的免疫調節(jié)功能也會受到抑制，細胞衰老相關的表型更為顯著。有研究對衰老的BMSCs進行細胞周期檢測，發(fā)現(xiàn)快速老化小鼠來源的BMSCs 細胞周期停滯在G0/G1期，細胞內活性氧增加明顯，相關的免疫指標表達也出現(xiàn)紊亂［10］。也有研究顯示，清除BMSCs 中過度的活性氧后，BMSCs 的生長及遷移均有明顯改善。許多具有抗氧化作用的中藥活性成分也被證實通過降低活性氧水平促進BMSCs成骨分化，如白藜蘆醇可以通過激活AMPK 信號通路抑制細胞內活性氧的產生，從而逆轉BMSCs 衰老［11］。NAD+及NAD+/NADH 的比例是調節(jié)自由基氧化重要的介質，在衰老BMSCs 中檢測到其NAD+及NAD+/NADH 比例明顯升高；對衰老的BMSCs 進行外源性NAD+補充后，其成骨分化可以得到明顯改善［12］。

3.2 DNA 損傷應答 DNA 分子損傷的蓄積及修復能力的減退也是影響細胞衰老的重要因素。在細胞受到某些信號刺激后，含有DNA 基因組的DNA 骨架會發(fā)生異常，引起雙鏈或者單鏈DNA 的斷裂，并激活機體啟動相應的修復機制，引起細胞內的系列反應，這些反應也被統(tǒng)稱為DNA 損傷應答。在衰老的細胞中可穩(wěn)定地觀察到DNA 損傷應答病灶中存在斷裂雙鏈DNA。利用輻射引起B(yǎng)MSCs 損傷后，發(fā)現(xiàn)BMSCs 的增殖能力及基因組DNA 損傷明顯，相應的成骨分化能力也受到抑制［13］。組蛋白H2AX 作為DNA 損傷應答的重要組成部分，可以在羧基末端實現(xiàn)快速磷酸化，從而在相應的雙鏈DNA 斷裂位點產生γ-H2AX。H2AX 與許多關鍵的DNA 損傷修復蛋白功能的發(fā)揮密切相關，通常H2AX 作用于DNA 損傷修復的早期階段，在衰老BMSCs中檢測到γ-H2AX表達明顯增高［9］。

BMSCs 通過持續(xù)的DNA 損傷反應激活驅動過早衰老，其特征為DNA 合成抑制，衰老因子p21 和p16蛋白表達及β-半乳糖苷酶活性增加，細胞成骨分化能力降低［14］。傳代次數(shù)少的BMSCs相比傳代次數(shù)多的BMSCs 更能抵抗輻射或基因毒性藥物引起的DNA 損傷，且γ-H2AX 在傳代次數(shù)少的BMSCs 中含量更高，在傳代次數(shù)更多的BMSCs 中含量明顯降低［15］。另有研究顯示，小鼠BMSCs 在長期擴增培養(yǎng)中逐漸喪失識別內源性和輻射誘導的DNA 雙鏈斷裂的能力，這種受損的DNA損傷反應表現(xiàn)為γ-H2AX修復數(shù)量的減少，這與DNA 修復動力學的減慢以及DNA雙鏈斷裂數(shù)量增加有關［16］。

3.3 長壽基因與衰老基因 在細胞衰老過程中，研究者發(fā)現(xiàn)沉默信息調節(jié)因子（silent information regulator， SIRT）及系列衰老基因（如Klotho、p16、p21、p53等）與機體衰老有密切關聯(lián)，在BMSCs的衰老過程中也扮演著重要角色。

3.3.1 SIRT家族 哺乳動物的sirtuins家族共包含7個成員，多位研究者已論證過其中的SIRT1、SIRT3和SIRT6 參與細胞衰老的調控。其中，SIRT1 主要通過調控細胞代謝、抑制炎癥和細胞凋亡來改善衰老進程［17］；SIRT3主要通過調控細胞代謝及氧化平衡發(fā)揮抗衰老作用［18］；SIRT6通常作用于應激脅迫或代謝相關的基因，加速DNA及堿基的損傷修復，以此來增加染色體穩(wěn)定性［19］。也有研究顯示SIRT2 可以通過賴氨酸去乙酰化改變蛋白活性調控衰老，但現(xiàn)有文獻只報道了SIRT2 可能通過抑制破骨細胞活性緩解增齡性OP［20］，其與BMSCs的調控關系暫未見相關報道。

研究發(fā)現(xiàn)，全身性敲除、成骨細胞或破骨細胞特異性敲除SIRT1基因小鼠較野生型小鼠骨量均明顯降低［21］；在骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（bone morphogenetic protein-9， BMP-9）誘導的BMSCs 成骨分化過程中，SIRT1 表達明顯降低；SIRT1 過表達后，BMSCs 的成骨分化能力顯著提高，極大地緩解了25 羥基維生素D-1α 羥化酶敲除小鼠的骨量丟失［22］。SIRT1 還可通過作用于成骨轉錄因子Runx2 及Sp7 上的乙?；M蛋白H3K14ac，使得BMSCs的成骨分化能力增強［23］。

SIRT3 含量與細胞中活性氧減少和DNA 損傷加重有關，與BMSCs 衰老程度呈負相關；對BMSCs 補充外源性SIRT3，可明顯改善自然或過早衰老BMSCs的衰老相關表型［24］。此外，SIRT3的補充還可通過提高超氧化物歧化酶2 表達以降低細胞內活性氧水平，從而維持細胞內氧化和抗氧化平衡，減輕BMSCs的氧化應激損傷［25］。SIRT3 也可通過激活錳超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的產生，促進BMSCs增殖［26］。

隨著年齡的增長，BMSCs 中SIRT6 的含量逐漸降低，細胞的遷移及增殖能力也隨之降低。條件性敲除BMSCs 中SIRT6的小鼠，不僅其原代BMSCs 表現(xiàn)為成骨分化能力明顯降低，還會出現(xiàn)嚴重的OP 樣特征［27］。沉默BMSCs 中的SIRT6后也發(fā)現(xiàn)細胞的增殖、遷移和氧化應激耐受能力均顯著下降，β-半乳糖苷酶活性提高，衰老因子p16等表達顯著增加［28］。

3.3.2 衰老因子 Klotho 是一種與衰老相關的因子，在骨中具有一定的表達豐度，Klotho 能有效抵抗氧化應激等引起的病理狀態(tài)［29］。有研究顯示，加入外源性Klotho 刺激后，BMSCs 的成骨分化及成纖維細胞生長因子受體1/細胞外信號調節(jié)激酶信號通路相關因子均受到明顯抑制；而沉默BMSCs 的Klotho基因后，BMSCs的成骨分化則明顯增強［30］。

在衰老的BMSCs 中，衰老相關因子p16、p21 和p53 的表達也會顯著增加。p16 作為細胞衰老調控的重要成員之一，可與細胞周期蛋白D（cyclin D）協(xié)同調控細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4， CDK4）的表達，對細胞的增殖發(fā)揮調控作用。對全身性敲除p16基因的小鼠進行雙側去卵巢手術后，發(fā)現(xiàn)其超氧化物歧化酶1和2的蛋白表達水平明顯上調，而活性氧水平、p21 含量及骨組織中β-半乳糖苷酶陽性骨細胞占比均明顯降低［31］。p21 則可抑制與細胞周期相關的cyclin-CDK 復合物，OP 患者骨組織p21 表達量較正常志愿者明顯增加［32］；另有研究顯示，通過靶向清除p21 陽性衰老的BMSCs可減緩輻射誘導的OP和骨髓脂肪增加［33］。p53參與細胞分化、凋亡及DNA 修復等過程，其介導的多條信號途徑在細胞衰老過程中發(fā)揮著重要調控作用。在全身性敲除p16基因小鼠中cyclin D、p53 及CDK的表達均明顯增加［34］。

3.4 端粒與端粒酶 端粒是一段DNA-蛋白質復合體，位于真核細胞染色體末端，由重復的六聚體核苷酸序列（TTAGGG）和相關保護蛋白構成。端粒可覆蓋和保護真核生物染色體的末端，主要發(fā)揮防止染色體融合和降解的作用［35］。在細胞在分裂的過程中，端粒的長度受到細胞分裂的影響，隨分裂次數(shù)的增多而變短，并到達某個長度后細胞停止分裂。

端粒酶在細胞中則主要發(fā)揮端粒延長的作用，端粒酶生物學障礙的BMSCs的細胞增殖能力明顯降低，且細胞更傾向于向脂肪細胞和纖維細胞方向分化［36］。這可能與端粒通過促進線粒體損傷引起能量代謝異常，從而加速BMSCs衰老有關［37］。此外，端粒酶復合物的某些基因突變也會引起OP 等骨代謝疾病的發(fā)生［38］。這些研究均表明端粒酶功能紊亂可能是調控衰老BMSCs引起OP的原因。

3.5 表觀遺傳學 表觀遺傳學是指DNA 序列保持不變，但生物體受到某些信號影響導致基因發(fā)生可遺傳改變，該過程在機體發(fā)育、生長、衰老等過程中廣泛存在［39］。目前，DNA 甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA是表觀遺傳學改變的幾種主要形式。

3.5.1 DNA 甲基化 DNA 甲基化是指基因的功能或活性出現(xiàn)可遺傳變化，它不改變生物體本身的DNA序列，但卻可通過不同機制實現(xiàn)對基因的表達調控［40］。有研究發(fā)現(xiàn)，在絕經后OP 婦女的骨組織中存在SOST 基因的表觀遺傳調控機制。通過將36 名健康受試者與27名OP 患者對比，發(fā)現(xiàn)OP 患者的SOST（sclerostin）基因啟動子區(qū)域CpG 甲基化水平增加。此外，研究人員還觀察到，OP 患者SOST甲基化水平的升高與骨和血清中SOST 的降低在功能上密切相關［41］。未經誘導分化的BMSCs 相比，成骨誘導的BMSCs 多出了2 319 個甲基化位點，進一步對這些位點進行KEGG分析后，發(fā)現(xiàn)富集在分子黏附和Wnt/βcatenin經典信號通路等16個信號通路［42］。還有研究發(fā)現(xiàn)DNA m6A 去甲基化酶參與調控BMSCs 的命運和骨脂分化平衡，可能作為OP治療的潛在靶點［43］。

3.5.2 組蛋白修飾 組蛋白修飾是一種重要的調控染色質結構的途徑，對于基因活性的調節(jié)具有重要意義。目前，組蛋白修飾主要包括乙?；腿ヒ阴；瘍煞N形式。在骨重建過程中，組蛋白修飾以不同形式參與其中［44］。

研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基轉移酶Ash1l在骨質疏松小鼠的骨組織中顯著降低，對Ash1l 進行敲除后，發(fā)現(xiàn)可導致小鼠患有關節(jié)炎或遭受嚴重的軟骨和骨骼破壞［45］。表觀遺傳修飾蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶5A［lysine （K） demethylase 5A， KDM5A］的表達在OP 大鼠的骨組織中明顯上調，在BMSCs 中過表達KDM5A 可明顯抑制BMP-2 誘導的成骨分化；特異性敲除KDM5A后，BMSCs 的成骨分化能力則顯著提高；其具體的機制可能是KDM5A 通過降低Runx2啟動子上的H3K4me3 水平，從而實現(xiàn)成骨分化的內源性調節(jié)［46］。有研究者在Runx2啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了高豐度的組蛋白賴氨酸表觀修飾標志分子，進一步研究發(fā)現(xiàn)KDM5B 在骨髓間充質細胞向成骨細胞分化過程中對Runx2基因的表達起著關鍵的開關作用［47］。

3.5.3 miRNA 表達 miRNA 功能的實現(xiàn)通常是通過調控靶基因mRNA 的轉錄或翻譯水平，從而實現(xiàn)調控作用。研究發(fā)現(xiàn)，在衰老過程中，間充質干細胞和其他肌肉骨骼譜系細胞中部分miRNA 的表達發(fā)生顯著變化，并且這些miRNA 還可靶向調節(jié)衰老中固有激活的細胞周期阻滯通路組件［48-49］。研究發(fā)現(xiàn)，來自老年小鼠的BMSCs分泌的外泌體中miR-29b-3p的含量顯著增加，且長壽基因SIRT1是外泌體miR-29b-3p 的下游靶點，miR-29b-3p 可調節(jié)衰老相關因子從而影響B(tài)MSCs 衰老［50］。C57BL/6 小鼠骨骼肌和血清來源外泌體中miR-34a-5p 含量隨年齡的增長顯著增加，這些外泌體通過遞送miR-34a-5p 至BMSCs從而降低其降低活力，加速細胞衰老［51］。也有研究觀察到老年大鼠來源的BMSCs中miR-31a-5p表達水平顯著升高，且BMSCs表現(xiàn)出成脂分化能力增強和衰老指標增加，成骨分化和干細胞特性降低［52］。還有部分miRNA 也可通過直接或間接調節(jié)p53和p21通路，調控BMSCs衰老，進而實現(xiàn)對骨代謝的調控作用［53］。

BMSCs 衰老誘發(fā)OP 骨代謝失衡相關機制的總結見圖1。

Figure 1.The relationship between the senescence of bone marrow mesenchymal stem cells and the bone metabolism imbalance of osteoporosis.圖1 骨髓間充質干細胞衰老與骨質疏松癥骨代謝失衡的關系

4 總結與展望

綜上所述，BMSCs 是介導機體骨形成、參與骨代謝穩(wěn)態(tài)調控的關鍵細胞，BMSCs衰老引發(fā)的細胞活力降低可能是引發(fā)OP骨代謝失衡的重要環(huán)節(jié)。BMSCs相關衰老機制涉及活性氧、端粒酶、長壽基因、衰老因子等多種因素調控，各種機制既可獨立作用，也存在一定關聯(lián)?，F(xiàn)有的研究多是單純探討了各機制如何介導BMSCs 衰老，但何種衰老機制在其中占據(jù)主導作用及各個機制間如何網絡關聯(lián)暫不十分清楚。因此，探尋衰老的主導作用機制或進一步闡釋各衰老機制之間如何相互關聯(lián)是未來需要開展的重點工作。此外，目前多種中藥或中藥活性成分表現(xiàn)出了強大的抗氧化、抗衰老作用，且圍繞BMSCs、中藥活性成分與新型材料已開展了許多研究，并取得了一定的進展。因此，未來的工作也可從該角度深入，開發(fā)新型的抗衰老BMSCs 組合材料，為越來越多的BMSCs防治OP等骨代謝性疾病提供新的思路。