不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性綜合評價

張 昭,金琪凡,史彥欣,段曉桐,閆慧芳*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,山東 青島 266109;2.黃河三角洲草地資源與生態(tài)國家林業(yè)和草原局重點實驗室,山東 青島 266109;3.青島市灘涂鹽堿地特色植物種質(zhì)創(chuàng)制與利用重點實驗室,山東 青島 266109)

種子萌發(fā)是植物整個生命周期中最關(guān)鍵的階段,也是對環(huán)境因子響應(yīng)最敏感的時期[1]。作為種子萌發(fā)過程的重要環(huán)境因子,溫度影響了大部分的種子萌發(fā)相關(guān)生理生化反應(yīng)事件[2-3]。低溫冷害是常見于晚秋或早春的主要農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害[4],也是植物生命周期中極易遭受的非生物脅迫因子,嚴(yán)重限制了植物的地理分布、生長發(fā)育和產(chǎn)量[5-6]。當(dāng)溫度低于種子萌發(fā)適宜溫度時,種子萌發(fā)受到抑制,萌發(fā)速率減慢,種子活力和幼苗生長特性均受到一定程度影響[7]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上栽培歷史最悠久、種植面積最大的重要豆科牧草,具有適應(yīng)范圍廣,產(chǎn)草量高,蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)豐富等特性[8]。在我國,紫花苜蓿主要栽培區(qū)域集中在北方地區(qū),且通常于晚秋或早春季節(jié)播種,但由于溫度低及倒春寒現(xiàn)象,致使其因種子萌發(fā)緩慢、出苗率低而制約田間成功建植,進而影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[9]。此外,不同品種紫花苜蓿種子的萌發(fā)特性及萌發(fā)期對低溫的抵抗能力也存在差異[10]。近年來,盡管紫花苜蓿種子的低溫萌發(fā)和幼苗生長特性已被研究報道[7-13],但關(guān)于不同品種種子對低溫脅迫萌發(fā)響應(yīng)的差異比較與綜合評價還較少。因此,深入探究紫花苜蓿種子在低溫條件下的萌發(fā)和幼苗生長特性,據(jù)此綜合比較并評價不同品種種子的耐低溫萌發(fā)能力,對其田間播種、成功建植、栽培生產(chǎn)十分重要,也對其適應(yīng)性品種篩選、推廣及人工草地擴大種植具有重要指導(dǎo)意義。

本研究以22個品種紫花苜蓿種子為試驗材料,通過測定各品種在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽溫度(20℃)和低溫(10℃)下的種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、苗長、根長等9個種子萌發(fā)和幼苗生長特性相關(guān)指標(biāo),分析比較不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長對低溫脅迫的響應(yīng)差異,并對不同品種種子萌發(fā)期的耐低溫性進行綜合評價,以期為紫花苜蓿耐低溫種質(zhì)篩選、低溫響應(yīng)基因挖掘以及耐低溫新品種培育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紫花苜蓿種子材料包括22個品種,于2020年收獲后均保存于—20℃冰箱內(nèi)備用(表1)。本試驗于2022年11月—2023年2月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院實驗室進行。

表1 22個供試紫花苜蓿品種基本信息Table 1 Basic information of the 22 tested alfalfa varieties

1.2 試驗設(shè)計與方法

本試驗設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽溫度(20℃,即對照CK)和低溫脅迫(10℃)兩種處理對上述22個品種的紫花苜蓿種子進行萌發(fā)試驗與幼苗生長特性測定。挑選均勻飽滿、大小一致的紫花苜蓿種子50粒,將其均勻放置于鋪有3層濾紙的11 cm×11 cm有蓋培養(yǎng)皿中,濾紙用10 mL蒸餾水潤濕,每個處理設(shè)3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱(GXZ-380B)中,分別在20℃和10℃、光照8 h/黑暗16 h條件下培養(yǎng)10 d。種子萌發(fā)期間,每天觀察統(tǒng)計種子發(fā)芽和幼苗生長情況,并定時補充蒸發(fā)散失的水分,以維持種子萌發(fā)和幼苗生長所需。

1.3 指標(biāo)測定

以胚根突破種皮至少2 mm作為種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn),以正常種苗形態(tài)建成作為成苗標(biāo)準(zhǔn),每天觀察統(tǒng)計種子萌發(fā)和成苗情況。根據(jù)每天種子萌發(fā)和成苗統(tǒng)計,分別于第4 d計算種子發(fā)芽勢(Germination energy,GE)、第10 d計算種子發(fā)芽率(Germination percentage,GP)和成苗率(Seedling percentage,SP)。待第10 d發(fā)芽結(jié)束后,每個培養(yǎng)皿隨機選取10株正常種苗,用刻度尺測定苗長(Shoot length,SL)和根長(Root length,RL),并用天平稱量幼苗鮮重(Seedling fresh weight,SFW)。此外,計算種子發(fā)芽指數(shù)(Germination index,GI)、種子活力指數(shù)(Vigor index,VI)和幼苗活力指數(shù)(Seedling vigor index,SVI)。

發(fā)芽勢(GE)=(N4/N)×100%

發(fā)芽率(GP)=(N10/N)×100%

成苗率(SP)=(G10/N)×100%

種子發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Nt/Dt)

種子活力指數(shù)(VI)=(∑Nt/Dt)×SFW

幼苗活力指數(shù)(SVI)=(SL+RL)×SP

上述公式中,N4和N10分別為第4 d和第10 d統(tǒng)計時的萌發(fā)種子數(shù),G10為第10 d統(tǒng)計時的正常種苗數(shù),N為供試種子總數(shù),Nt為第td統(tǒng)計時的萌發(fā)種子數(shù),Dt為萌發(fā)天數(shù)。

1.4 耐低溫性綜合評價

采用耐冷系數(shù)(Cold tolerance coefficient,CTC)、綜合耐冷系數(shù)(Comprehensive cold tolerance coefficient,CCTC)、隸屬函數(shù)、系統(tǒng)聚類分析的綜合評價方法[14]對22個供試品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性進行評價。

耐冷系數(shù)(CTC)=低溫脅迫條件的指標(biāo)平均值/常溫條件的指標(biāo)平均值

參考韓瑞宏等[15]的方法,以供試品種各指標(biāo)測定值為依據(jù),采用隸屬函數(shù)法對22個品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性進行綜合評價。同時,基于綜合耐冷系數(shù)和隸屬函數(shù)值,采用歐氏距離中的組間連接法進行系統(tǒng)聚類分析。

μ(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin),i=1,2,3……n

式中,μ(Xi)為某一測定指標(biāo)的模糊隸屬函數(shù)值平均值;當(dāng)指標(biāo)與種子萌發(fā)耐低溫性成負(fù)相關(guān)時用1-μ(Xi)表示;X為某一測定指標(biāo)平均值;Xmax和Xmin分別為某一測定指標(biāo)的最大值和最小值。再將各品種種子的各測定指標(biāo)隸屬函數(shù)值累加,求隸屬函數(shù)平均值,值越大表示紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性越強。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2021軟件進行數(shù)據(jù)整理,SPSS 25.0軟件進行顯著性統(tǒng)計分析與聚類分析。所有數(shù)值均以3個重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(Mean±SE)表示,并用單因素方差分析(ANOVA)檢驗計算相關(guān)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性的差異比較分析

相比于CK,低溫脅迫后各項測定指標(biāo)的平均值均有所下降,且在不同品種間存在明顯差異,達到極顯著水平(P<0.01),說明低溫脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長特性所有測定指標(biāo)影響顯著。

標(biāo)準(zhǔn)萌發(fā)溫度下各測定指標(biāo)的變異系數(shù)范圍為2.16%～19.49%,而低溫脅迫下各測定指標(biāo)的變異系數(shù)范圍為2.38%～20.72%,表明不同測定指標(biāo)所受低溫脅迫的抑制程度存在差異。低溫脅迫下,紫花苜蓿種子活力指數(shù)與幼苗活力指數(shù)所受影響較大,下降幅度分別為69.05%和63.55%,而種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率所受影響較小,下降幅度分別為4.15%和1.08%(表2)?；诖?不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期的耐低溫性存在差異,可進一步利用其他統(tǒng)計分析方法對其進行分析與綜合評價。

表2 不同品種紫花苜蓿種子各測定指標(biāo)相關(guān)統(tǒng)計參數(shù)Table 2 Statistical parameters related to various measured indicators of different varieties of alfalfa seeds

2.2 不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期測定指標(biāo)的耐冷系數(shù)分析

根據(jù)CK和低溫脅迫條件下各測定指標(biāo)值,計算各品種測定指標(biāo)的耐冷系數(shù)和綜合耐冷系數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),各品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期對低溫脅迫的耐受程度不同,其中‘賽迪10號’的綜合耐冷系數(shù)最大,為0.683;而‘英斯特’的綜合耐冷系數(shù)最小,為0.523,且各項測定指標(biāo)的耐冷系數(shù)值也均小于‘賽迪10號’,表明‘賽迪10號’種子萌發(fā)期耐低溫性最強,而‘英斯特’種子萌發(fā)期耐低溫性最弱(表3)。

表3 不同品種紫花苜蓿種子各測定指標(biāo)的耐冷系數(shù)Table 3 Cold tolerance coefficient of various measured indicators of different varieties of alfalfa seeds

2.3 不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期測定指標(biāo)的隸屬函數(shù)分析

以供試品種各指標(biāo)測定值為依據(jù),計算各品種測定指標(biāo)的隸屬函數(shù),以比較22個品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期的耐低溫性差異。其中,隸屬函數(shù)平均值越大,說明種子萌發(fā)期的耐低溫性越強。結(jié)果發(fā)現(xiàn),低溫脅迫后,‘賽迪10號’各測定指標(biāo)的隸屬函數(shù)平均值最大,為0.789,而‘英斯特’‘金皇后’‘巨能401’各測定指標(biāo)的隸屬函數(shù)平均值最小,分別為0.318,0.313,0.313,表明‘賽迪10號’種子萌發(fā)期耐低溫性最強,而‘英斯特’‘金皇后’‘巨能401’種子萌發(fā)期耐低溫性較弱(表4)。

表4 不同品種紫花苜蓿種子各測定指標(biāo)的隸屬函數(shù)Table 4 Membership functions of various measured indicators of different varieties of alfalfa seeds

2.4 紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性綜合評價

根據(jù)綜合耐冷系數(shù),通過系統(tǒng)聚類分析將22個供試品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性劃分為4個類型,其中,強耐低溫性品種1個,占供試品種的4.55%,為‘賽迪10號’;中耐低溫性品種11個,占供試品種的50.00%;弱耐低溫性品種7個,占供試品種的31.82%;低溫敏感性品種3個,占供試品種的13.64%,為‘金皇后’‘巨能995’和‘英斯特’(圖1A)。

根據(jù)隸屬函數(shù),通過系統(tǒng)聚類分析將22個供試品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性劃分為4個類型,其中,強耐低溫性品種1個,占供試品種的4.55%,為‘賽迪10號’;中耐低溫性品種6個,占供試品種的27.27%;弱耐低溫性品種11個,占供試品種的50.00%;低溫敏感性品種4個,占供試品種的18.18%,為‘巨能995’‘金皇后’‘巨能401’和‘英斯特’(圖1B)。

圖1 基于綜合耐冷系數(shù)(A)與隸屬函數(shù)(B)的系統(tǒng)聚類分析Fig.1 Cluster analysis based on comprehensive cold tolerance coefficient (Panel A) and membership function (Panel B)注：類型Ⅰ,強耐低溫性;類型Ⅱ,中耐低溫性;類型Ⅲ,弱耐低溫性;類型Ⅳ,低溫敏感性Note：Type Ⅰ,strong low temperature tolerance;Type Ⅱ,medium low temperature tolerance;Type Ⅲ,weak low temperature tolerance;Type Ⅳ,low temperature sensitivity

因此,根據(jù)各品種測定指標(biāo)的綜合耐冷系數(shù)(表3)和隸屬函數(shù)(表4),結(jié)合聚類分析結(jié)果,將供試紫花苜蓿種子萌發(fā)期相對耐低溫等級劃分為4類,分別為強耐低溫性、中耐低溫性、弱耐低溫性和低溫敏感性(表5)。

表5 供試紫花苜蓿種子萌發(fā)期相對耐低溫等級劃分Table 5 Classification of relative low temperature tolerance of different varieties of tested alfalfa during seed germination

基于綜合耐冷系數(shù)與隸屬函數(shù)兩種評價方法,以結(jié)果中重復(fù)出現(xiàn)(即在兩種評價方法中均被鑒定到)為依據(jù)進行綜合評價,篩選出強耐低溫性品種1個,為‘賽迪10號’;低溫敏感性品種3個,為‘金皇后’‘巨能995’和‘英斯特’。然而,進一步分析發(fā)現(xiàn),低溫敏感性品種中,‘英斯特’的綜合耐冷系數(shù)值最低(為0.523),且其種子萌發(fā)與幼苗生長特性各項指標(biāo)的隸屬函數(shù)平均值與‘巨能995’‘金皇后’相差不大,因此,確定紫花苜蓿種子萌發(fā)期的低溫敏感性品種為‘英斯特’。

3 討論

種子萌發(fā)是植物生長發(fā)育的起始階段,也是整個生命周期中最關(guān)鍵的時期[16]。種子萌發(fā)不僅與種子本身的生物學(xué)特性有關(guān),還與周圍環(huán)境(如水分、氧氣和溫度等)密切相關(guān)。溫度是影響種子萌發(fā)的關(guān)鍵環(huán)境因素,適宜溫度下,種子吸脹速率和萌發(fā)進程較快,而溫度過低則會導(dǎo)致種子吸脹速率減慢,萌發(fā)進程受阻[17]。研究表明,發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、簡化活力指數(shù)、根長、苗長、可溶性糖、淀粉等指標(biāo)可以反映紫花苜蓿種子在低溫脅迫下的種子活力和幼苗生長特性[10-11,18-19]。本研究利用發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子活力指數(shù)、成苗率、苗長、根長、幼苗鮮重和幼苗活力指數(shù)9個指標(biāo)進行紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性綜合評價,結(jié)果發(fā)現(xiàn),各項測定指標(biāo)的平均值在低溫脅迫下均有所下降,且在不同品種間的差異均達到極顯著水平(表2),表明這些指標(biāo)能夠全面地反映不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期對低溫脅迫的耐受性差異,可以提高鑒定結(jié)果的可靠性。

研究表明,低溫脅迫導(dǎo)致紫花苜蓿種子發(fā)芽率顯著降低,發(fā)芽時間延長,幼苗生長緩慢,細(xì)胞生理代謝受阻[20-22]。向上等[23]研究20個品種紫花苜蓿種子在4℃和8℃低溫脅迫下的萌發(fā)特性也發(fā)現(xiàn),各品種種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及苗長均顯著降低,發(fā)芽時間延長。本研究中,低溫脅迫下22個品種紫花苜蓿種子各項萌發(fā)相關(guān)測定指標(biāo)的平均值均低于CK的平均值,且在品種間的下降程度不同,其中種子活力指數(shù)和幼苗活力指數(shù)變化較大,而發(fā)芽勢與發(fā)芽率變化較小,這可能是因為低溫下種子生理代謝活動受到抑制,正常幼苗形態(tài)建成受阻,說明低溫脅迫對不同品種種子的萌發(fā)和幼苗生長相關(guān)指標(biāo)的抑制作用存在差異(表2)。此外,種子發(fā)芽勢的高低表征了種子萌發(fā)過程中發(fā)芽種子數(shù)達到高峰的快慢。本研究中,低溫脅迫導(dǎo)致不同品種紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢明顯降低,表明發(fā)芽高峰期隨溫度降低而延后。王曉龍等[10]研究發(fā)現(xiàn),紫花苜蓿種子萌發(fā)時對低溫脅迫具有一定耐受作用,且6℃為其種子萌發(fā)的轉(zhuǎn)折點,溫度過低可能會因種子呼吸作用、貯藏物質(zhì)分解代謝等生理活動減弱而抑制種子萌發(fā)[12]。盡管前人研究曾采用4℃或10℃作為紫花苜蓿種子萌發(fā)的低溫脅迫處理溫度[11-12,18,20,23-24],但事實上,在4℃溫度條件下種子僅能露白萌發(fā),而不能完成正常幼苗的形態(tài)建成(預(yù)試驗結(jié)果,未發(fā)表)。因此,本研究選用10℃作為紫花苜蓿種子響應(yīng)低溫脅迫的處理溫度,且該溫度對不同品種的成苗率和幼苗活力指數(shù)影響較大,植株生長較弱,這與高茜等[20]研究結(jié)果相一致。

種子萌發(fā)期對低溫脅迫的響應(yīng)受多種因素影響,單一指標(biāo)難以真實地反映出種子的耐低溫萌發(fā)能力,因此,需采用適宜的測定指標(biāo)和多元評價方法進行綜合分析,以提高結(jié)果準(zhǔn)確性[11]。賈祥等[18]利用隸屬函數(shù)法綜合評價了4種豆科牧草種子萌發(fā)期對低溫脅迫的響應(yīng),向上等[23]利用打分法對低溫脅迫下20個品種紫花苜蓿種子的發(fā)芽特征進行綜合評價,而侯龍魚等[12]則采用主成分分析法對6個品種紫花苜蓿種子的耐低溫萌發(fā)能力進行評價與篩選。本研究基于綜合耐冷系數(shù)和隸屬函數(shù)方法對22個品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期的耐低溫性進行了綜合評價,初步確定‘賽迪10號’為強耐低溫性品種、‘英斯特’為低溫敏感性品種。實際生產(chǎn)中,仍需進一步在晚秋或早春季節(jié)對篩選的品種進行田間播種以驗證并加以利用。此外,針對強耐低溫性品種和低溫敏感性品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期的不同階段進行測序分析,挖掘耐低溫關(guān)鍵候選基因,為紫花苜蓿種質(zhì)遺傳改良與耐低溫新品種培育提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

低溫脅迫下,22個供試紫花苜蓿品種的種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子活力指數(shù)、成苗率、苗長、根長、苗鮮重、幼苗活力指數(shù)均呈下降趨勢,其中種子活力指數(shù)和幼苗活力指數(shù)所受影響較大,而發(fā)芽勢和發(fā)芽率所受影響較小?；诰C合耐冷系數(shù)與隸屬函數(shù)進行系統(tǒng)聚類分析,將22個品種紫花苜蓿劃分為4個不同耐低溫類型,并篩選出強耐低溫性品種為‘賽迪10號’、低溫敏感性品種為‘英斯特’。