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      芍藥苷抗急性壞死性胰腺炎相關(guān)性腎損傷的作用與機(jī)制研究

      2023-11-02 09:17:48王鵬邵俊偉左騰郭聞一張利龍邱振東王衛(wèi)星
      中國(guó)普通外科雜志 2023年9期
      關(guān)鍵詞:芍藥造模胰腺

      王鵬,邵俊偉,左騰,郭聞一,張利龍,邱振東,王衛(wèi)星

      (武漢大學(xué)人民醫(yī)院 1.普通外科 2.胃腸外Ⅱ科,湖北 武漢 430060)

      急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis,ANP)是一種嚴(yán)重的消化系統(tǒng)疾病,其起病急驟、臨床癥狀嚴(yán)重,且極易導(dǎo)致胰腺外臟器功能損傷,其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,臨床治療也缺乏有效的治療方案[1-3]。腎臟是ANP胰外臟器損傷的常見(jiàn)靶器官,當(dāng)ANP發(fā)生時(shí),腎功能損傷易發(fā)生在ANP的早期,ANP伴有腎功能損傷的患者病死率約為71.2%[4]。因此對(duì)于ANP相關(guān)腎功能損傷的治療十分必要,是目前ANP胰外臟器損傷研究的重點(diǎn)[5-7]。目前中醫(yī)藥聯(lián)合西醫(yī)治療是胰腺炎研究的熱點(diǎn),芍藥苷(paeoniflorin)是傳統(tǒng)中藥材芍藥的有效提取物,具有多種藥理作用,如抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛以及免疫調(diào)節(jié)等多種功能[8-10]。其可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠的全身炎癥反應(yīng)并提高其存活率,但是在ANP相關(guān)腎損傷中芍藥苷是否能夠發(fā)揮其藥理作用,如能發(fā)揮其作用,其具體機(jī)制如何尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究通過(guò)建立ANP相關(guān)腎損傷大鼠模型,應(yīng)用芍藥苷對(duì)其進(jìn)行干預(yù),觀察其干預(yù)效果,然后探討其發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1 主要材料與試劑

      芍藥苷(C23O28H11;分子量:480.45;純度≥95%)購(gòu)于南京建成生物公司,TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA試劑盒購(gòu)于華美生物。兔抗-NF-κBp65(1∶200;ab16502)、內(nèi)參GAPDH(1∶2 500;ab8245)和抗-caspase3(1∶100;ab2302)抗體購(gòu)自Abcam公司。兔抗p38(1∶1 000;8690)和抗磷酸化p38(p-p38)(2∶1 000;4511)抗體購(gòu)自Cell Signaling Technologies.(美國(guó)加利福尼亞州赫拉克勒斯)。TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)于羅氏公司。

      1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

      武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供128只SD大鼠(體質(zhì)量180~200 g)。將大鼠置于特定的無(wú)病原體條件下,進(jìn)行12 h的光暗循環(huán),并自由飲水。大鼠術(shù)前禁食。動(dòng)物福利遵守赫爾辛基宣言。本研究由武漢大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批號(hào):WDRM動(dòng)(福)第20221005B]。

      1.3 動(dòng)物分組與處理

      將40只大鼠隨機(jī)分為5組,每組8只,分別為假手術(shù)組、ANP模型組(ANP組)、ANP模型+芍藥苷處理組(芍藥苷組),后者按芍藥苷劑量(50、100、150 mg/kg)分為3組。實(shí)驗(yàn)前一晚大鼠禁食但可自由飲水。ANP模型采用膽胰管逆行注射5%的?;悄懰徕c(1 mg/kg)建立,假手術(shù)組僅做開(kāi)腹后翻動(dòng)小腸處理。3個(gè)芍藥苷組在ANP模型建立后通過(guò)股靜脈連續(xù)注射2次芍藥苷(中間間隔30 min),假手術(shù)組與ANP組以相同的方式注射生理鹽水。各組大鼠在建模后12 h異氟烷氣體麻醉后處死并取材檢測(cè)相關(guān)指標(biāo),分析安全有效的芍藥苷劑量。隨后將72只SD大鼠隨機(jī)分為3組,每組24只,分別為假手術(shù)組、ANP組、芍藥苷組,處理方法同前,芍藥苷劑量按前一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇。分別在造模后3、6、12 h,每組各取8只大鼠麻醉后處死,下腔靜脈采血,血液標(biāo)本靜止30 min后離心分離血清,取大鼠胰頭組織以及腎組織取材后固定及-80 ℃凍存。

      1.4 指標(biāo)檢測(cè)

      1.4.1 血清指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀(奧林巴斯2700,日本)檢測(cè)血清中淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIPA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平。

      1.4.2 病理學(xué)分析 大鼠胰腺組織及腎組織經(jīng)多聚甲醛固定后,石蠟包埋、切片、HE染色,通過(guò)光鏡觀察。根據(jù)Schimidt等[11]所提出的胰腺損傷病理評(píng)分對(duì)胰腺組織進(jìn)行病理評(píng)分,根據(jù)Paller等[12]所提出的腎臟病理?yè)p傷評(píng)分對(duì)腎組織進(jìn)行病理評(píng)分。

      1.4.3 ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β以及IL-6的表達(dá) 取血清后低溫離心,取上清,按ELISA試劑盒說(shuō)明準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品、洗滌工作液、生物素標(biāo)記抗體工作液的配置、辣過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液,并將上述試劑放置室溫下平衡1 h,加樣,37 ℃恒溫孵育2 h,然后洗板加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液37 ℃恒溫孵育1 h,洗板,加入底物,終止反應(yīng),應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值。

      1.4.4 免疫組化檢測(cè)腎臟組織NF-κB以及caspase-3的表達(dá) 腎臟組織的石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、封閉、一抗4 ℃過(guò)夜、采用免疫組化試劑盒進(jìn)行后續(xù)顯影(DAB顯色)、蘇木精染色,脫水、封片,在光鏡下觀察細(xì)胞核內(nèi)黃染為陽(yáng)性表達(dá),光鏡下拍照,采用Image Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[13]。

      1.4.5 TUNEL細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將腎組織石蠟包埋后切割成3 μm的切片。脫蠟、水化并在室溫下與蛋白酶K(武漢古德生物科技有限公司)孵育15 min。剩余步驟根據(jù)推薦的原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒POD(Roche Diagnostics)提供的方案進(jìn)行。DAB染色后用蘇木精染色細(xì)胞核。TUNEL結(jié)果用Olympus BX53顯微鏡觀察。TUNEL陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞核棕色染色[14]。

      1.4.6 Western blot分析 使用RIPA均漿裂解大鼠腎臟組織并提取總蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白濃度。凝膠電泳分離蛋白質(zhì),并通過(guò)Bio-Rad轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜,封閉2 h后清洗充分后,加入p38(抗體濃度1∶1 000)、p-p38(抗體濃度1∶1 000)以及GAPDH抗體(抗體濃度1∶2 500)4 ℃孵育過(guò)夜。第二天加入熒光二抗,常溫孵育1 h后,充分清洗后,應(yīng)用奧德賽紅外成像系統(tǒng)采集并轉(zhuǎn)化為灰度圖,Quality One 軟件系統(tǒng)分析灰度。

      1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,通過(guò)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,組間比較采用Tukey多重比較,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié) 果

      2.1 不同劑量芍藥苷對(duì)ANP大鼠AMY、LIPA水平及肝功能的影響

      不同劑量的芍藥苷均能明顯降低ANP大鼠血清AMY、LIPA水平(均P<0.05),并呈一定程度的劑量依賴(lài)趨勢(shì),但150 mg/kg芍藥苷組的ALT、AST高于50、100 mg/kg芍藥苷組,且相較100 mg/kg組,未明顯降低AMY及LIPA水平(表1),故選擇100 mg/kg芍藥苷用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

      表1 各組大鼠血清AMY、LIPA、ALT、AST水平(±s)Table 1 Serum levels of AMY,LIPA,ALT,and AST in each group of rats (±s)

      注:1)與假手術(shù)組比較,P<0. 05;2)與ANP組比較,P<0. 05;3)與50 mg/kg芍藥苷組比較,P<0.05Notes:1) P<0.05 vs.sham surgery group; 2) P<0.05 vs.ANP group; 3) P<0.05 vs.50 mg/kg paeoniflorin group

      組別假手術(shù)組ANP組芍藥苷組(mg/kg)50 100 150 AMY(U/L)1 755.7±214.0 8 287.5±1 394.51)LIPA(U/L)4 417.9±553.1 14 599.5±1 741.51)ALT(U/L)40.1±4.8 183.5±54.61)AST(U/L)127.9±37.2 618.8±165.71)480.3±70.41)357.6±51.71),2),3)514.0±65.61)7 244.1±793.21),2)6 333.1±683.91),2),3)5 244.3±445.81),2),3)14 190.3±803.11)12 675.0±735.21),2),3)11 362.8±905.01),2),3)158.6±24.81)114.1±9.41),2),3)275.2±84.51),2),3)

      2.2 芍藥苷對(duì)ANP大鼠胰腺與腎臟病理學(xué)的影響

      與假手術(shù)組比較,ANP組與芍藥苷組胰腺組織均出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變,后者胰腺間質(zhì)水腫較ANP組減輕,出血減少,胰腺病理學(xué)評(píng)分在各個(gè)時(shí)間均低于ANP組(均P<0.05)(圖1)。與假手術(shù)組比較,ANP組與芍藥苷組均觀察到腎臟組織病變,表現(xiàn)為不同程度的腎皮質(zhì)刷狀緣丟失、細(xì)胞壞死、小管上皮細(xì)胞脫落、管型形成和腎小管擴(kuò)張,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)腎臟病理評(píng)分逐步升高,但芍藥苷組腎臟病理學(xué)評(píng)分在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于ANP組(均P<0.05)(圖2)。

      圖1 大鼠胰腺組織病理檢測(cè) A:造模后各時(shí)間點(diǎn)胰腺病理學(xué)評(píng)分;B:造模后12 h各組胰腺組織HE染色(×200)Figure 1 Pathological examination of rat pancreatic tissues A: Pancreatic histopathological scores at various time points after modeling; B: HE Staining of pancreatic tissues in different groups at 12 h post-modeling (×200)

      圖2 大鼠腎臟組織病理檢測(cè) A:造模后各時(shí)間點(diǎn)腎臟病理學(xué)評(píng)分;B:造模后12 h各組腎臟組織HE染色(×200)Figure 2 Pathological examination of rat kidney Tissues A: Renal histopathological scores at various time points after modeling; B: HE staining of renal tissues in different groups at 12 h post-modeling (×200)

      2.3 各組血清AMY、LIPA、BUN及Cr水平

      在造模后各時(shí)間點(diǎn)分析,ANP組與芍藥苷組的AMY均在造模后6 h達(dá)最高值,而兩組的LIPA、BUN以及Cr水平最高值均在造模后12 h出現(xiàn),但芍藥苷組的各項(xiàng)指標(biāo)在各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于ANP組(均P<0.05)(圖3)。

      2.4 各組TNF-α、IL-1β及IL-6水平

      ELISA結(jié)果顯示,ANP組與芍藥苷組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平在造模后均隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高,但芍藥苷組的以上指標(biāo)水平在各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于ANP組(均P<0.05)(圖4)。

      圖4 各組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較Figure 4 Comparison of serum TNF-α,IL-1β,and IL-6 levels among groups

      2.5 各組腎臟組織中NF-κB以及caspase-3的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況

      在各組大鼠造模后12 h的腎臟組織標(biāo)本中,免疫組化結(jié)果顯示,ANP組與芍藥苷組NF-κB與caspase-3的表達(dá)均明顯升高,但芍藥苷組兩者的升高程度均明顯低于ANP組(均P<0.05);TUNEL染色結(jié)果顯示,ANP組與芍藥苷組的細(xì)胞凋亡均明顯增加,但后者的細(xì)胞凋亡明顯少于前者(均P<0.05)(圖5)。

      圖5 腎臟組織中NF-κB與caspase-3表達(dá)情況及細(xì)胞凋亡情況Figure 5 Expression of NF-κB and caspase-3 in renal tissues and assessment of cell apoptosis

      2.6 各組腎臟組織中p-38與p-38的表達(dá)

      通過(guò)Western blot檢測(cè)各組造模后12 h腎臟組織p38與p-p38的表達(dá),結(jié)果顯示,ANP組與芍藥苷組p-p38/p38比例均明顯升高,但后者的升高程度明顯低于前者(均P<0.05),ANP組約為80%,芍藥苷組約為60%(圖6)。

      圖6 各組腎臟組織p38與p-p38檢測(cè)及p-p38/p38比例比較Figure 6 Detection of p38 and p-p38 in renal tissues and comparison of the p-p38/p38 ratio in each group

      3 討 論

      急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是消化系統(tǒng)中常見(jiàn)疾病,屬于自限性疾病的一種,但是當(dāng)治療方法不當(dāng)或其他原因?qū)е轮委熝舆t時(shí)可導(dǎo)致ANP的發(fā)生[15]。ANP的病因主要為炎癥因子所致的級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)、氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡、腸道菌群失調(diào)等多種病理生理機(jī)制[16]。其中炎癥因子所致的級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)可導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征,導(dǎo)致胰腺外臟器的損傷[17],腎臟作為常見(jiàn)的靶器官,極易受到炎癥因子的影響,從而導(dǎo)致腎臟功能障礙,進(jìn)而引發(fā)多器官功能衰竭,導(dǎo)致病情危重加重患者死亡[6,18-20]。目前早期液體復(fù)蘇、鎮(zhèn)痛、營(yíng)養(yǎng)支持以及后期炎癥及感染性并發(fā)癥的控制是治療ANP的重要靶點(diǎn),因此尋求一種新的抗炎藥物對(duì)于ANP及相關(guān)胰腺外并發(fā)癥具有重要的意義[21-24]。

      芍藥苷作為傳統(tǒng)中藥芍藥的有效提取物,其藥理作用廣泛,近年來(lái)其在抗腫瘤以及抗炎等方面的藥理作用不斷被發(fā)掘[25-26]。芍藥苷在肝臟纖維化疾病、結(jié)直腸惡性腫瘤、自身免疫性肝病、潰瘍性結(jié)腸炎以及慢性疼痛中均有一定的功效,而芍藥苷在ANP相關(guān)腎損傷中的作用如何、其具體作用機(jī)制尚無(wú)明確定論,在本研究中通過(guò)構(gòu)建ANP+腎損傷大鼠模型,可以觀察到芍藥苷具有減輕ANP的炎癥反應(yīng),具體表現(xiàn)為降低胰腺病理評(píng)分,且對(duì)肝功影響較小,降低機(jī)體炎癥指標(biāo)如TNF-α、IL-1β以及IL-6水平。胰腺本位器官的功能保護(hù)對(duì)于ANP的治療十分重要,在早期如能及時(shí)保護(hù)胰腺功能,逆轉(zhuǎn)炎性反應(yīng)對(duì)于患者的預(yù)后具有重要意義,但ANP之所以病情危重在于其疾病進(jìn)展速度快且極易引發(fā)胰外臟器損傷,特別是腎功能損傷。本研究結(jié)果顯示,芍藥苷可減輕腎皮質(zhì)水腫,減少腎小管管型,具有保護(hù)腎功能的作用。ANP后腎損傷的一個(gè)重要機(jī)制是腎臟的急性缺血導(dǎo)致的腎皮質(zhì)細(xì)胞的凋亡,通過(guò)TUNEL凋亡實(shí)驗(yàn)觀察到應(yīng)用芍藥苷治療后腎臟皮質(zhì)細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較ANP組明顯降低,而芍藥苷組NF-κB的表達(dá)低于ANP組(此指標(biāo)反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平),因此芍藥苷的保護(hù)機(jī)制可能為通過(guò)抑制氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到保護(hù)腎功能的作用。通過(guò)免疫組化檢測(cè)凋亡指標(biāo)caspase-3的表達(dá)情況觀察到,應(yīng)用芍藥苷治療后,腎臟組織中caspase-3的表達(dá)情況較ANP組明顯降低。因此,結(jié)合caspase-3的表達(dá)以及TUNEL實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,芍藥苷可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡起到保護(hù)腎功能的作用。

      除細(xì)胞凋亡原因外,炎癥所致的應(yīng)激反應(yīng)對(duì)于細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用,炎癥指標(biāo)TNF-α、IL-1β以及IL-6可以通過(guò)激活NF-κB的前體I-κB,使得I-κB磷酸化形成NF-κB-I-κB復(fù)合體,從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生進(jìn)展,而p38信號(hào)通路,當(dāng)被特定的炎性細(xì)胞因子、病原體或細(xì)胞應(yīng)激刺激時(shí),p38被激活磷酸化后并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。p-p38可以激活I(lǐng)-κB并誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[27-28]。本研究表明ANP組中NF-κB的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組,應(yīng)用芍藥苷治療后NF-κB的水平下降,而通過(guò)Western blot 技術(shù)分析p38的磷酸化情況,可以觀察到ANP組磷酸化水平最高,而應(yīng)用芍藥苷干預(yù)后腎臟組織的p38磷酸化水平明顯低于ANP組。

      綜上,芍藥苷能夠改善ANP所致的急性腎損傷,其可能的機(jī)制與通過(guò)抑制P38MAPK信號(hào)通路所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及減輕組織細(xì)胞凋亡相關(guān)。本研究?jī)H在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及組織水平驗(yàn)證了芍藥苷對(duì)于ANP相關(guān)腎損傷的保護(hù)作用,后續(xù)仍需在細(xì)胞水平進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

      利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。

      作者貢獻(xiàn)聲明:王鵬、王衛(wèi)星負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及具體實(shí)驗(yàn)統(tǒng)籌及操作;邵俊偉負(fù)責(zé)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分指導(dǎo);左騰、郭聞一負(fù)責(zé)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分操作;張利龍負(fù)責(zé)生化實(shí)驗(yàn)部分操作及統(tǒng)計(jì)數(shù)值;邱振東負(fù)責(zé)生化實(shí)驗(yàn)部分操作。

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