TMEM117調(diào)控TGF-β信號(hào)通路促進(jìn)胃癌的作用及機(jī)制研究

李競(jìng)，趙梓丹，張輝

（中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 肝膽胰外科，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

胃癌（gastric cancer，GC）是世界上第五大常見(jiàn)癌癥，也是因癌癥導(dǎo)致死亡的第三大常見(jiàn)原因[1]。早期GC以內(nèi)鏡治療為主，進(jìn)展期GC治療方法為手術(shù)為主的綜合治療，晚期GC主要采取化療以及靶向治療[2]。然而，GC的總體預(yù)后仍然不理想，因此，尋找GC潛在的治療靶點(diǎn)迫在眉睫。

跨膜蛋白（transmembrane protein，TMEM）是一種跨越整個(gè)脂質(zhì)雙分子層的蛋白質(zhì)，并永久錨定在膜上[3-4]。TMEM家族包含許多蛋白質(zhì)，分布于細(xì)胞膜和各種細(xì)胞器膜[5]，并且履行許多重要的生物學(xué)功能，如促進(jìn)血管生成[6]、調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[7-8]、維持線粒體功能[9-10]、蛋白質(zhì)糖基化[11]、表皮角化[12]以及平滑肌收縮[13]等功能。

TMEM1117是TMEM家族中很重要的一員，在人體生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TMEM117參與低血糖的反應(yīng)調(diào)節(jié)[13]，另外有研究者發(fā)現(xiàn)敲低TMEM117可以預(yù)防血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚[14]，此外TMEM117也參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的部分過(guò)程[15-16]。然而，TMEM117在癌癥特別是GC中的表達(dá)以及作用尚不清楚。因此，本研究詳細(xì)探討了TMEM117在GC細(xì)胞中的功能及其機(jī)制，嘗試為GC治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用胃上皮細(xì)胞GES-1以及4種GC細(xì)胞AGS、SGC7901、MKN45、HGC27均來(lái)自上海細(xì)胞庫(kù)（上海，中國(guó)），細(xì)胞使用培養(yǎng)基RPMI-1640購(gòu)自Corning公司、10%胎牛血清購(gòu)自Clark Bioscience，蛋白提取使用M-per蛋白裂解緩沖液購(gòu)自Thermo Fisher，3個(gè)TMEM117敲低的siRNA以及1個(gè)過(guò)表達(dá)病毒均購(gòu)自吉?jiǎng)P生物公司，CCK-8試劑盒以及EdU試劑盒購(gòu)自碧云天公司，Transwell小室購(gòu)自Corning公司。本實(shí)驗(yàn)所需一抗廠家來(lái)源：GAPDH（cat.#7074T；CST）、TMEM117（cat.#21314-1-AP；proteintech）、TGF-β（cat.#346599；正能）。LY2157299購(gòu)自Proteintech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 從TCGA（The Cancer Genome Atlas）網(wǎng)站（https://portal.gdc.cancer.gov）下載RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集（RNA-seq）。從GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)（https://commonfund.nih.gov/GTEx）下載不同組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并與TCGA數(shù)據(jù)合并，用log2方法進(jìn)行校正，利用Kruskal-Wall計(jì)算不同腫瘤中基因表達(dá)的差異。從GEO（Gene Expression Omnibus）下載的數(shù)據(jù)集（GSE13861、GSE66229、GSE26899、GSE26901、GSE66229）GC的正常和腫瘤組織的臨床樣本。使用R version 4.1.2篩選高TMEM117表達(dá)組與低TMEM117表達(dá)組之間的差異表達(dá)基因。人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas，HPA）（https://www.proteinatlas.org）是一個(gè)整合各種組學(xué)技術(shù)，繪制細(xì)胞、組織和器官中人類蛋白質(zhì)圖譜的程序[17]。使用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)說(shuō)明TMEM117蛋白在正常和癌癥組織中的分布。從Xena數(shù)據(jù)庫(kù)（https://xena.ucsc.edu）下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中惡性腫瘤患者的總生存期（OS）數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探討基因表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系。使用Kaplan-Meier法對(duì)下載的生存數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析，采用“survival”和“survminer”包進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)，同時(shí)向培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清以及1%青霉素和1%鏈霉素，放入含有5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)進(jìn)行傳代。細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測(cè)以檢測(cè)是否被污染。

1.2.3 qRT-PCR 使用TRIzol從GC細(xì)胞和組織中提取總RNA，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。使用SYBR Green（Toyobo）在熱循環(huán)儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)mRNA水平。GAPDH作為內(nèi)源性對(duì)照。GAPDH正向：5'-ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG G-3'，反向：5'-CGT CAA AGG TGG AGG AGT GG-3'；TMEM117正向：5'-CCC TTC TTT GGT TTG CAT CAG G-3'，反向：5'-TCC GAG TCT AGT TCG TAG GTG T-3'。

1.2.4 Western blot 在M-per蛋白裂解緩沖液加入磷酸酶和蛋白酶抑制劑取總蛋白質(zhì)。配置分離膠后將相應(yīng)蛋白加至相應(yīng)小孔，通過(guò)變性SDS-PAGE分離細(xì)胞蛋白，然后把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉膜1 h后孵育一抗，4 ℃冰箱過(guò)夜。第2天用TBST洗滌PVDF膜后室溫孵育二抗1 h，再次TBST洗滌，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）對(duì)膜進(jìn)行可視化，并使用Tanon-5200多平臺(tái)成像，最后使用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值量化。

1.2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染 接種適量需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞于12孔板，待第2天細(xì)胞貼壁后按照說(shuō)明書（MOI=10）將過(guò)表達(dá)或者敲低慢病毒加入12孔板，同時(shí)加入助轉(zhuǎn)劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后更換培養(yǎng)基，48 h后進(jìn)行傳代，待細(xì)胞貼壁后換成含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選感染成功的細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。shRNA序列如下：GAT ATG ATG CTT CAA GACA、GCT ACT GGC CAT TCT CAT A、GGA TCA GCT GGG ACA AACT。

1.2.6 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板（3 000個(gè)/孔），用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，每24 h檢測(cè)1次，連續(xù)5 d，每孔加入100 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.7 EdU實(shí)驗(yàn) 將提前消毒好的爬片放入12孔板，接種適量細(xì)胞過(guò)夜。次日按照說(shuō)明書配置好2X EdU工作液，并與培養(yǎng)基等體積混合后加入12孔板中37 ℃孵育2 h。去除培養(yǎng)基后加入4%多聚甲醛固定15 min，用含3%BSA的PBS洗滌后加入0.3% TritonX-100室溫孵育15 min。洗滌后將提前配置好的Click反應(yīng)液加入12孔板中孵育30 min，洗滌后加入Hoechst33342進(jìn)行細(xì)胞核染色10 min，加入抗猝滅劑后用Leica microscope進(jìn)行觀察、拍照。

1.2.8 Transwell實(shí)驗(yàn) 接種適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，第二天換成無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24 h。將Matrigel膠稀釋至工作濃度小心鋪至Transwell小室上層，放入37 ℃培養(yǎng)箱靜置5 h。計(jì)數(shù)細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)整至8×105個(gè)/mL，上室內(nèi)加入100 mL細(xì)胞懸液，下室內(nèi)加入650 μL高血清培養(yǎng)基后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。特定時(shí)間后取出小室，用4%多聚甲醛固定、0.1%結(jié)晶紫染色后使用徠卡顯微鏡觀察并且拍照。

1.2.9 裸鼠皮下成瘤 SPF級(jí)BALB/C裸鼠，自然生長(zhǎng)至4周齡。將裸鼠分為敲低組與對(duì)照組，每組各6只。將敲低TMEM1117的SGC7901細(xì)胞消化、使用PBS重懸后，左側(cè)腋下注射敲低組裸鼠，每只注射5×106個(gè)細(xì)胞。對(duì)照組裸鼠按同樣方式注射相同數(shù)量感染空白病毒的SGC7901細(xì)胞。裸鼠給予充足的食物和飲水，每隔3 d觀察并且記錄質(zhì)量以及皮下成瘤體積，待質(zhì)量明顯下降或者瘤體直徑超過(guò)1.5 cm處死。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用編程語(yǔ)言R 4.1.2或GraphPad Prism v.8.0進(jìn)行。采用單因素生存分析計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）和95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）。采用Kaplan-Meier法分析患者的生存率。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間差異比較，兩兩之間差異進(jìn)一步比較行SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TMEM117的泛癌表達(dá)分析

通過(guò)HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)在人體正常組織中，TMEM117在十二指腸、結(jié)直腸等消化系統(tǒng)器官中表達(dá)最高，表達(dá)最低的為造血系統(tǒng)（圖1A）。使用TCGA數(shù)據(jù)集分析了TMEM117在多種人類癌癥組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，TMEM117在12個(gè)腫瘤組織中高表達(dá)，其中表達(dá)差異最明顯的腫瘤為結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、膽管癌、GC以及肺癌（圖1B）。TMEM117在不同腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平如圖1C所示，表達(dá)較高的腫瘤細(xì)胞系為皮膚癌、食管癌、結(jié)直腸癌、GC、腦膜瘤等。

圖1 TMEM117在泛癌組織中的差異表達(dá)分析 A：來(lái)自HPA數(shù)據(jù)庫(kù)的人正常組織TMEM117蛋白表達(dá)譜；B：TMEM117在TCGA泛癌組織中的表達(dá)譜（藍(lán)色代表正常組織，紅色代表腫瘤組織）；C：HPA數(shù)據(jù)庫(kù)的泛癌細(xì)胞系TMEM117表達(dá)譜Figure 1 Differential expression analysis of TMEM117 in pan-cancer tissues A: Protein expression profile of TMEM117 in normal human tissues from the HPA database; B: Expression profile of TMEM117 in pan-cancer tissues from TCGA (blue representing normal tissues,red representing tumor tissues); C: Expression profile of TMEM117 in pan-cancer cell lines from the HPA database

2.2 TMEM117在GC細(xì)胞與組織中表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)對(duì)TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TMEM117在GC中的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，GC組織中TMEM117的表達(dá)明顯升高（圖2A）。隨后提取正常胃上皮細(xì)胞（GES1）與4種GC細(xì)胞系（HGC27、SGC7901、AGS、MKN45）RNA進(jìn)行qRTPCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與GES1比較，4種GC細(xì)胞系中TMEM117在RNA水平上表達(dá)均有不同程度的升高，其中HGC27細(xì)胞系中TMEM117升高最為明顯（均P＜0.05）（圖2B）。與癌旁正常組織比較，GC組織中TMEM117在RNA水平表達(dá)呈上升趨勢(shì)（P＜0.05）（圖2C）。Western blot檢測(cè)TMEM117在GC細(xì)胞系中蛋白層面的表達(dá)，也得到了與qRTPCR相同的趨勢(shì)（圖2D）。以上結(jié)果表明TMEM117在GC細(xì)胞以及組織中表達(dá)上調(diào)。通過(guò)在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)以及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行TMEM117的Kaplan-Meier法的生存分析，發(fā)現(xiàn)TMEM117的高表達(dá)與GC患者不良預(yù)后相關(guān)（均P＜0.05）（圖2E）。

圖2 TMEM117在GC中的表達(dá)及其預(yù)后的關(guān)系 A：基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)生物信息學(xué)分析TMEM117在GC中的表達(dá)；B：qRT-PCR檢測(cè)TMEM117在GES-1中與GC細(xì)胞中RNA水平的表達(dá)差異；C：qRT-PCR檢測(cè)TMEM117在GC組織以及癌旁正常組織中在RNA水平的表達(dá)差異；D：Western blot檢測(cè)TMEM117在GES-1中與GC細(xì)胞中蛋白水平的表達(dá)差異；E：基于TCGA與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析TMEM117與GC患者生存的關(guān)系Figure 2 Expression of TMEM117 in GC and its prognostic implications A: Bioinformatics analysis of TMEM117 expression in GC based on the TCGA database; B: qRT-PCR detection of RNA level differences in TMEM117 expression between GES-1 and GC cells; C: qRT-PCR detection of RNA level differences in TMEM117 expression between GC tissue and adjacent normal tissue; D: Western blot detection of protein level differences in TMEM117 expression between GES-1 and GC cells; E: Analysis of the relationship between TMEM117 and the survival of GC patients based on TCGA and GEO databases

2.3 敲低TMEM117對(duì)GC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的影響

分別在HGC27與SGC7901兩個(gè)細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染3個(gè)不同序列siRNA，并通過(guò)Western blot檢測(cè)3個(gè)序列的轉(zhuǎn)染效率，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇敲低效率相對(duì)較好的Sh-2、Sh-3進(jìn)行（圖3A）。首先通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低TMEM117對(duì)HGC27、SGC7901細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果表明，敲低TMEM117后GC細(xì)胞增殖能力降低（均P＜0.05）（圖3B）。后續(xù)EdU實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)敲低TMEM117后兩個(gè)GC細(xì)胞系增殖細(xì)胞的比例明顯減少（均P＜0.05）（圖3C）。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低TMEM117對(duì)GC細(xì)胞侵襲和遷移的影響，發(fā)現(xiàn)在HGC27、SGC7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA敲低TMEM117后，其侵襲和遷移能力均明顯減弱（均P＜0.05）（圖3D）。

2.4 過(guò)表達(dá)TMEM117對(duì)GC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的影響

為了進(jìn)一步研究TMEM117在體外對(duì)GC細(xì)胞的影響，在AGS細(xì)胞中通過(guò)轉(zhuǎn)染慢病毒過(guò)表達(dá)TMEM117，并且通過(guò)Western blot檢測(cè)TMEM117的表達(dá)以確認(rèn)在SGC7901細(xì)胞中成功過(guò)表達(dá)（圖4A）。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMEM117GC細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明與對(duì)照組相比過(guò)表達(dá)TMEM117后AGS細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05）（圖4B）。EdU增殖實(shí)驗(yàn)也表明過(guò)表達(dá)TMEM117后，AGS細(xì)胞增殖細(xì)胞占總細(xì)胞的比例明顯增高（P＜0.05）（圖4C）。然后，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了過(guò)表達(dá)TMEM117后對(duì)GC細(xì)胞侵襲和遷移的影響，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)TMEM117可以明顯提高AGSGC細(xì)胞的侵襲和遷移能力（均P＜0.05）（圖4D）。

圖4 過(guò)表達(dá)TMEM117對(duì)GC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響 A：Western blot檢測(cè)在AGS細(xì)胞中TMEM117過(guò)表達(dá)效率；B：CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)TMEM117后對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響；C：EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)TMEM117后對(duì)AGS細(xì)胞增殖能力的影響；D：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)TMEM117后對(duì)AGS細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響Figure 4 Impact of TMEM117 overexpression on proliferation,invasion,and migration abilities in GC cells A: Western blot to assess the efficiency of TMEM117 overexpression in AGS cells; B: CCK-8 assay to evaluate the effect of TMEM117 overexpression on the proliferation of AGS cells; C: EdU assay to assess the impact of TMEM117 overexpression on the proliferation ability of AGS cells; D: Transwell assay to examine the effect of TMEM117 overexpression on the invasion and migration abilities of AGS cells

2.5 TMEM117與TGF-β信號(hào)通路的關(guān)系

以往研究表明TMEM家族與TGF-β信號(hào)通路聯(lián)系密切，比如TMEM88能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β影響成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)[18]，TMEM63C也與TGF-β密切相關(guān)[19]。在敲低與過(guò)表達(dá)TMEM117的GC細(xì)胞中通過(guò)Western blot檢測(cè)TGF-β的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在敲低TMEM117的HGC27與SGC7901細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)明顯降低，而在過(guò)表達(dá)TMEM117的AGS細(xì)胞中出現(xiàn)了相反的情況（均P＜0.05）（圖5A）。用LY2157299（5 μmol/L）抑制GC細(xì)胞中TGF-β的水平并且檢測(cè)效率（圖5B），發(fā)現(xiàn)當(dāng)在過(guò)表達(dá)TMEM117的AGS細(xì)胞系中加入TGF-β抑制劑LY2157299時(shí)，能部分抵消過(guò)表達(dá)TMEM117對(duì)AGS細(xì)胞系增殖能力的促進(jìn)作用（圖5C）。同樣，LY2157299也能部分抵消過(guò)表達(dá)TMEM117對(duì)AGS細(xì)胞系侵襲和遷移能力的促進(jìn)作用（圖5D）。

圖5 TMEM117與TGF-β信號(hào)通路的關(guān)系分析 A：Western blot檢測(cè)在GC細(xì)胞中敲低或過(guò)表達(dá)TMEM117后TGF-β的表達(dá)水平；B：Western blot檢測(cè)LY2157299抑制TGF-β的效率；C：CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加入LY2157299后對(duì)過(guò)表達(dá)TMEM117的AGS細(xì)胞增殖能力的影響；D：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加入LY2157299后對(duì)過(guò)表達(dá)TMEM117的AGS細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響Figure 5 Analysis of the relationship between TMEM117 and the TGF-β signaling pathway A: Western blot to assess the expression levels of TGF-β in GC cells after TMEM117 knockdown or overexpression; B: Western blot to evaluate the efficiency of LY2157299 in inhibiting TGF-β; C: CCK-8 assay to examine the effect of adding LY2157299 on the proliferation ability of AGS cells overexpressing TMEM117; D: Transwell assay to assess the impact of adding LY2157299 on the invasion and migration abilities of AGS cells overexpressing TMEM117

2.6 TMEM117對(duì)GC細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響

用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，TMEM117敲低組的瘤體大小明顯小于對(duì)照組（圖6A），腫瘤體積與質(zhì)量均明顯低于對(duì)照組（均P＜0.05）（圖6B）。

圖6 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) A：敲低組與對(duì)照組移植瘤大體形態(tài)比較；B：敲低組與對(duì)照組腫瘤體積與質(zhì)量比較Figure 6 Subcutaneous tumor formation experiment in nude mice A: Comparison of the gross morphology of transplanted tumors between the knockdown group and the control group; B: Comparison of tumor volume and mass between the knockdown group and the control group

3 討 論

盡管目前治療GC的方法取得了一定的進(jìn)展，但是進(jìn)展期GC的病死率仍然較高[20-22]，因此急需尋找新的GC治療靶點(diǎn)。以往的研究表明TMEM跨膜蛋白家族在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，如TMEM25、TMEM7等蛋白為腫瘤抑制因子[23-24]，TMEM48、TMEM97為腫瘤促進(jìn)因子[13,25-29]，還有小部分跨膜蛋白如TMEM88參與腫瘤化學(xué)耐藥性[30-33]，而TMEM117在癌癥中尚未見(jiàn)基礎(chǔ)研究。在本研究中，通過(guò)檢測(cè)TMEM117在GC中的表達(dá)、探索對(duì)TMEM117對(duì)GC細(xì)胞功能的影響以及機(jī)制，系統(tǒng)闡述了TMEM117對(duì)調(diào)節(jié)GC進(jìn)展的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)TMEM117在多種癌癥中存在表達(dá)差異，然后將重點(diǎn)放在了TMEM117在GC中的作用研究。首先本研究檢測(cè)了TMEM117在GC細(xì)胞以及組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TMEM117在GC中明顯高表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TMEM117表達(dá)升高與GC患者不良預(yù)后密切相關(guān)，生存分析證明TMEM117在GC中具有較強(qiáng)的研究意義。

緊接著本研究探索TMEM117對(duì)GC細(xì)胞功能的影響。在HGC27和SGC7901細(xì)胞系中敲低TMEM117，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)證明敲低TMEM117可以抑制HGC27和SGC7901細(xì)胞系增殖、侵襲和遷移。同樣地，在AGS細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)TMEM117也發(fā)現(xiàn)了可以促進(jìn)GC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TMEM117對(duì)GC發(fā)展有促進(jìn)作用。

然后，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明發(fā)現(xiàn)TMEM117在GC中的作用機(jī)制與TGF-β相關(guān)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子由TGF-β、激活素、節(jié)點(diǎn)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、生長(zhǎng)和分化因子（GDFs）以及其他因子組成[34-35]，其在人體胚胎發(fā)育以及維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用[36]。近年來(lái)研究者[37]發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致免疫功能障礙、纖維化、癌癥。TGF-β信號(hào)通路在腫瘤中具有雙重作用，在不同的腫瘤微環(huán)境或者腫瘤不同的階段可扮演腫瘤抑制因子或者腫瘤促進(jìn)因子[34,38-39]。在本研究中，通過(guò)Western blot檢測(cè)了過(guò)表達(dá)或者敲低TMEM117時(shí)的TGF-β表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TGF-β與TMEM117呈正相關(guān)變化，表明TMEM117可以通過(guò)上調(diào)TGF-β表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)GC進(jìn)展，隨后本研究通過(guò)使用TGF-β抑制劑LY2157299明確TMEM117通過(guò)TGF-β發(fā)揮作用。最后通過(guò)裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，本研究進(jìn)一步證明TMEM117能夠促進(jìn)GC進(jìn)展。

綜上所述，本研究第一次系統(tǒng)地探討了TMEM117在GC中的表達(dá)以及功能作用。結(jié)果表明，TMEM117在GC中高表達(dá)且預(yù)示著不良預(yù)后，TMEM117能夠顯著促進(jìn)GC的增殖、侵襲和遷移。從機(jī)制上來(lái)講，TMEM117可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β水平來(lái)促進(jìn)GC進(jìn)展。TMEM117有可能成為治療GC的關(guān)鍵靶點(diǎn)，未來(lái)的研究應(yīng)該側(cè)重于靶向TMEM117對(duì)GC的療效。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李競(jìng)負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、數(shù)據(jù)收集以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、論文撰寫，趙梓丹負(fù)責(zé)生物信息學(xué)分析，張輝負(fù)責(zé)技術(shù)和材料支持、指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、修改和審核論文。