沖繩海槽南部熱液區(qū)附近柱狀沉積物中微生物的垂直分布多樣性及其對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)

鄧興渝，曹文瑞，姜明玉，曾志剛，常鳳鳴，宋召軍

1. 山東科技大學(xué)地球科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266590

2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋地質(zhì)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266071

深海沉積環(huán)境不僅具有低溫、高壓等特點(diǎn)，而且還含有復(fù)雜和獨(dú)特的化學(xué)成分，不同深海生境（如熱液噴口、冷泉、多金屬結(jié)核區(qū)和海山區(qū)等）的微生物群落存在顯著差異[1]，它們不僅參與元素循環(huán)，同時(shí)其參與的氧化還原過(guò)程也非常復(fù)雜[2]。而深海熱液區(qū)則代表了地球上最具物理和化學(xué)多樣性的生境[3-4]，其化學(xué)梯度和熱梯度為微生物群落提供了廣泛的生態(tài)位[5-6]。

為了研究與深海熱液環(huán)境相關(guān)的微生物多樣性，研究人員利用純培養(yǎng)和免培養(yǎng)的方法，發(fā)現(xiàn)了包括深海熱液噴口在內(nèi)的極端環(huán)境中的微生物群落[7]。盡管純培養(yǎng)的方法對(duì)于利用模式微生物來(lái)解釋驗(yàn)證熱液發(fā)生過(guò)程非常關(guān)鍵，而且對(duì)于發(fā)現(xiàn)新物種、新的天然活性產(chǎn)物等以及其他有工業(yè)應(yīng)用潛力的天然產(chǎn)品也有重要意義[8-9]，但是由于熱液環(huán)境的微生物分離培養(yǎng)較為困難，所以這方面的研究目前還較少。Wang 等[10]從西北印度洋卡爾斯伯格洋中脊熱液區(qū)成功分離與純化到了代表性的菌種，首次證實(shí)了該類(lèi)群微生物具有硫還原功能，并在氫氣的氧化過(guò)程中獲得能量，揭示了其單質(zhì)硫還原的關(guān)鍵基因和代謝途徑。杜瑞等[11]曾對(duì)沖繩海槽熱液區(qū)的硫氧化細(xì)菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)，并對(duì)其代謝類(lèi)型和活性進(jìn)行了初步探究，為深海熱液系統(tǒng)的硫循環(huán)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。與純培養(yǎng)的技術(shù)相比，免培養(yǎng)的方法具有檢測(cè)整個(gè)微生物系統(tǒng)多樣性的優(yōu)勢(shì)，包括尚未培養(yǎng)的微生物的多樣性[12-14]。迄今為止，利用免培養(yǎng)方法對(duì)沖繩海槽熱液區(qū)微生物群落的研究相繼報(bào)道[15-21]，但是這些研究對(duì)象大多是熱液區(qū)的表層沉積物。

沖繩海槽是西北太平洋的新近紀(jì)弧后裂谷盆地，存在著許多活動(dòng)熱液區(qū)，在氣候生態(tài)、海洋礦產(chǎn)資源[22-23]和營(yíng)養(yǎng)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[24]。沖繩海槽南部，平均水深在2 000 m 以上[25-26]，除具有一般深海環(huán)境的高壓、低溫和黑暗等特點(diǎn)外，該區(qū)域還含有豐富的金屬資源，其包含錳、鐵、鎳、鈷和銅等幾十種元素[27]。本研究樣品位于第四與那國(guó)（Yonaguni Knoll Ⅳ）熱液區(qū)以及唐印（Tangyin）熱液區(qū)附近。其中第四與那國(guó)熱液區(qū)位于長(zhǎng)約1 000 m、寬約500 m 的狹長(zhǎng)的深谷區(qū)，活動(dòng)的熱液區(qū)呈南-北向排列[28-29]。唐印熱液區(qū)（25°04′N(xiāo)、122°34′E）則是2014 年HOBAB3 航次利用“科學(xué)號(hào)”科學(xué)考察船新發(fā)現(xiàn)的，它位于雨花山海丘北坡，水深1 206 m，在本區(qū)發(fā)現(xiàn)了旺盛的海底熱液活動(dòng)和密集的化能自養(yǎng)生物群落[28,30]。目前，關(guān)于沖繩海槽南部HOBAB4-S2 沉積物柱狀樣的研究，主要是對(duì)其進(jìn)行了年代學(xué)分析、粒度分析、礦物學(xué)分析（硫化物礦物和黏土礦物）、沉積物地球化學(xué)以及單礦物的元素和硫同位素組成等方面的研究[28]。然而應(yīng)用微生物學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)手段對(duì)該樣品的微生物群落組成進(jìn)行深入調(diào)查，并結(jié)合環(huán)境因子進(jìn)行分析的研究尚未開(kāi)展。

因此，本研究以沖繩海槽南部熱液區(qū)附近HOBAB4-S2 沉積物柱中不同層位的沉積物樣品為研究對(duì)象，基于純培養(yǎng)方法和16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)域Illumina 平臺(tái)的高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)該沉積物柱的微生物垂直分布多樣性開(kāi)展調(diào)查，并結(jié)合樣品的地球化學(xué)特征分析微生物群落組成對(duì)關(guān)鍵環(huán)境因子的響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

本研究樣品是2016 年5 月由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所“科學(xué)”號(hào)考察船在HOBAB4 航次期間通過(guò)重力沉積物柱取樣器從沖繩海槽南部的S2 站采集的，該HOBAB4-S2 沉積物巖芯全長(zhǎng)4.77 m，其位于唐印熱液區(qū)和第四與那國(guó)熱液區(qū)之間的裂谷盆地（24°52'49.91″N、122°37'19.70″E），水深為1 505 m[28]。

1.2 元素地球化學(xué)特征

分層處理后的沉積物樣品被冷凍干燥，選取所需層位的沉積物樣品，每個(gè)層位?。?0.0 g 沉積物樣品于60℃烘箱中烘干，將烘干樣品用瑪瑙研缽研磨并過(guò)篩（100 目）。利用S8 Tiger X 射線熒光光譜儀（X-ray Fluorescence，XRF）（Bruker，德國(guó)）測(cè)定每個(gè)樣品中的主、微量元素組成情況，檢出限為0.8～220 μg/g；利用PE 2400 II CHNS/O 分析儀(Perkin-Elmer，美國(guó)）測(cè)定每個(gè)樣品的總有機(jī)碳（TOC）、總碳（TC）和總氮（TN）含量， TOC、TC 和TN 的檢測(cè)下限分別為0.07%、0.07%和0.02%。上述分析測(cè)試均在中國(guó)科學(xué)院海洋研究所分析測(cè)試中心完成，分析結(jié)果用于了解沉積物樣品的地球化學(xué)特征和初級(jí)生產(chǎn)力。

1.3 主要試劑和培養(yǎng)基

在無(wú)菌條件下，將1 g 沉積物樣品加至9 mL 無(wú)菌海水中，充分震蕩，靜置10 min 后取上清液1 mL繼續(xù)用無(wú)菌海水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)罱K獲得10-1、10-2、10-3、10-4、10-5共計(jì)5 個(gè)濃度梯度的稀釋液。每個(gè)梯度分別取100 μL 涂布在分離培養(yǎng)基平板上，隨后置于25℃培養(yǎng)5—7 天。本研究所用的分離培養(yǎng)基有2216E[31]、SPG 和ASC 培養(yǎng)基[11,32]。

在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，觀察平板中菌落形態(tài)，對(duì)菌落大小、顏色、邊緣、透明度等特征進(jìn)行描述和記錄。根據(jù)形態(tài)特征，挑取平板中不同形態(tài)的單菌落，在對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線純化。將純化后的菌株接種對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心后將菌體細(xì)胞重懸于20%的甘油中，并轉(zhuǎn)入凍存管，放在-80℃下保藏。

1.4 菌株DNA 提取、16S rRNA 基因擴(kuò)增和分類(lèi)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用煮沸法提取菌株的基因組DNA，選擇27F/1492R 通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGAC-3'）對(duì)菌株的16S rRNA 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[33,34]。PCR 擴(kuò)增使用以下程序：在94℃下初始預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，55℃退火60 s，72℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10 min，于4℃保存[35]。PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上通過(guò)電泳進(jìn)行檢測(cè)，將合格的PCR 產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將所得的16S rRNA 基因序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)（ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），同時(shí)在EzTaxon-e 服務(wù)器(http://www.ezbiocloud.net)中計(jì)算所得序列與親緣模式菌株的16S rRNA 基因序列的相似性。使用CLUSTAL X 對(duì)所有獲得的16S rRNA 基因序列和所對(duì)應(yīng)的親緣模式菌株的16S rRNA 基因序列進(jìn)行多重比對(duì)。隨后使用MEGA（version 11）[36]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建基于最大似然法（ Maximum likelihood approach）[37]的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。構(gòu)建過(guò)程使用complete deletion 選項(xiàng)進(jìn)行分析，并根據(jù)雙參數(shù)模型（Kimura's two-parameter model）[38]計(jì)算距離，進(jìn)行1 000 次重復(fù)驗(yàn)證。

1.5 環(huán)境樣品DNA 提取擴(kuò)增、高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析

對(duì)于選取的每個(gè)沉積物樣品，分別采集三份重復(fù)樣，利用試劑盒Fast DNA Soil-Direct Kit（MP BIO，美國(guó)）提取沉積物樣品的總DNA。DNA 濃度和完整性分別通過(guò)NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（Therm，USA）和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行評(píng)估。以提取的樣品DNA 為模板，用引物343F(5'-TACGGRAGGCAGCAG-3')和798R(5'- AGGGTATCTAATCCT-3')，對(duì)16S rRNA基因的V3-V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[39]。PCR 產(chǎn)物使用電泳檢測(cè)，檢測(cè)后使用磁珠純化，純化后作為二輪PCR模板，進(jìn)行二輪PCR 擴(kuò)增，并再次使用電泳檢測(cè)，檢測(cè)后使用磁珠純化，純化后對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行Qubit定量。根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，并上機(jī)測(cè)序。

獲得的高通量原始序列數(shù)據(jù)用cutadapt 軟件剪切掉引物序列，并使用DADA2 將上一步合格的雙端原始數(shù)據(jù)（raw data）使用Qiime2 默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾、降噪、拼接及去嵌合體等質(zhì)控分析之后，對(duì)序列進(jìn)行去重；得到代表序列及ASV（Amplicon Sequence Variant，擴(kuò)增子序列變異）豐度表格。使用QIIME 2 軟件包挑選出各個(gè)ASV 的代表序列后，并將所有代表序列與Silva（version138）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://ftp.arb-silva.de）進(jìn)行比對(duì)注釋。物種比對(duì)注釋使用q2-feature-classifier 軟件默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分析。菌群豐富度指數(shù)（Chao）、多樣性指數(shù)（Shannon和Simpson）以及發(fā)育樹(shù)譜系多樣性指數(shù)（PD whole tree）等α多樣性指數(shù)使用QIME 計(jì)算。由于每個(gè)樣品的3 個(gè)重復(fù)呈現(xiàn)的微生物群落組成是相近的，在進(jìn)一步分析中使用了3 個(gè)重復(fù)的平均值。利用主坐標(biāo)分析（Principal coordinates analysis，PCoA）評(píng)估不同樣品之間的相似性及差異性，同時(shí)利用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）討論環(huán)境因子、樣品、微生物類(lèi)群三者之間的關(guān)系。上述16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序和數(shù)據(jù)分析在青島歐易生物科技有限公司和歐易生物云平臺(tái)（https://cloud.oebiotech.com/）完成。

1.6 登錄序列號(hào)

本研究可培養(yǎng)菌株16S rRNA 基因序列已提交GenBank，登錄號(hào)見(jiàn)表1。本研究16S rRNA V3-V4 區(qū)高通量測(cè)序序列已提交GenBank，登錄號(hào)為：SRR24489263-SRR24489263319。

表1 本研究使用樣品的地球化學(xué)組成Table 1 Geochemical compositions of the samples used in this study

2 結(jié)果

2.1 主量元素和微量元素組成分析

沖繩海槽南部沉積巖芯HOBAB4-S2 的主量元素分析結(jié)果表明，其SiO2的含量較高，其次是Al2O3含量，MgO、Na2O 含量則較低。結(jié)合前人測(cè)得的部分?jǐn)?shù)據(jù)[40]，其中SiO2含量的變化范圍為55.35%～69.31%，平均值59.56%（n=61）；Al2O3含量的變化范圍為10.01%～16.86%，平均值15.54%（n=61）；MgO 含量的變化范圍為1.91%～2.71%，平均值2.42%（n=61）；Na2O 含量的變化范圍為1.78%～2.46%，平均值2.09%（n=61）。Cu 含量為18.9×10-6～65.0×10-6，平均值38.35×10-6（n=61），Zn 和Pb 含量分別為83.4×10-6～356×10-6和27.6×10-6～160×10-6，平均值分別為129.82×10-6（n=61）和64.49×10-6（n=61）。在沉積巖芯HOBAB4-S2 孔中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)富含Cu-Zn-Pb 的層（圖1），分別在166 cmbsf 和444 cmbsf處。我們研究的沖繩海槽南部沉積巖芯HOBAB4-S2 微量元素含量普遍較高，其Ba、Zr、Ti 的含量平均值分別為507.74×10-6、193.32×10-6、4 693.74×10-6（n=19）。此外，該沉積物柱的總碳、總氮和總有機(jī)碳含量測(cè)試結(jié)果表明，其總碳、總氮和總有機(jī)碳平均含量分別為1.42%、0.13%、0.88%，且總碳在30 cmbsf 處的沉積物中含量最低，而總氮在171 cmbsf 處的沉積物中含量則最低，分別為1.10%和0.07%（表1）。

圖1 不同層位沉積物中Cu、Zn、Pb、TC、TN 和TOC 含量變化部分?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)自Yang et al[40]。Fig.1 Variations in Cu, Zn, Pb, TC, TN, and TOC concentrations in different layersParts of data are from Yang et al[40].

2.2 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定及其多樣性

共從沖繩海槽沉積物中分離獲得64 株菌種，隨后通過(guò)近全長(zhǎng)16S rRNA 基因序列分析鑒定。結(jié)果表明，這些菌株屬于4 個(gè)門(mén)、5 個(gè)綱、7 個(gè)目、14 個(gè)科、25 個(gè)屬；有38 株、1 株、21 株、4 株分別屬于Proteobacteria（變形菌門(mén)）、Bacteroidota（擬桿菌門(mén)）、Bacillota（芽孢桿菌門(mén)）、Actinomycetota（放線菌門(mén)）。其中，Proteobacteria 是最大的一個(gè)類(lèi)群，包含兩類(lèi)，即19 株Alphaproteobacteria（α-變形菌綱）和19 株Gammaproteobacteria（γ-變形菌綱）。在目水平上，21 株Bacillales（芽孢桿菌目）是優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，其次是19 株Oceanospirillales（ 海洋螺菌目） 、 12 株Rhizobiales（根瘤菌目）、4 株Sphingomonadales（鞘脂單胞菌目）和4 株P(guān)seudonocardiales（假諾卡式菌目）。對(duì)于其他3 個(gè)目，每個(gè)目的分離菌株都少于4 株。在科水平上，最豐富的科是15 株Alcanivoracaceae（食堿菌科）、13 株Bacillaceae（芽孢桿菌科）和7 株P(guān)hyllobacteriaceae（葉桿菌科）。其他9 個(gè)科中的每科都少于7 株。從屬上看，其中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位的是Alcanivorax的菌株，占比達(dá)到了分離菌株總數(shù)的1/4，其次為Paenisporosarcina，占比約11%。從不同沉積物層位分離得到菌株的詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

將所有菌株及其已知親緣模式菌株一起構(gòu)建基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。結(jié)果表明，作為占據(jù)優(yōu)勢(shì)數(shù)量的Proteobacteria 中的Alcanivorax xenomutans，從表層到深層的沉積物中均有分離出，而其他分離到的屬于Proteobacteria 的物種，如Citromicrobium bathyomarinum，Martelella mediterranea，Nitratireductor aquibiodomus，Pelagerythrobacter marinus，Qipengyuania vulgaris則大多來(lái)自于更深層的環(huán)境中。分離得到隸屬于Bacillota 的菌株則明顯分為兩大類(lèi)群，其中屬于Bacillaceae 的菌株除了181E02、475E01 之外，均來(lái)自于較上層的沉積物（≤110 cmbsf）；而Planococcaceae（葡萄球菌科）的菌株則全部來(lái)自于深層的沉積物（≥248 cmbsf）。此外，我們還在334 cmbsf層位處分離到唯一一株屬于Bacteroidota 的菌株334S03，它與親緣模式菌株Muricauda ruestringensisDSM 13 258T的16S rRNA 基因序列相似性為98.48%，為潛在的新物種。

圖2 基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建的可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分支1 中包含的菌株有18A01、18E05、18S01、81A02、81E07-1、199A01、301A01、334E05、334M01、334S02、334S04、392A01、392E02、475E05 和Alcanivorax xenomutans JC109T (HE601937)。Fig.2 Phylogenetic tree of cultivable bacteria isolated from hydrothermal field sediment core in the southern Okinawa Trough based on the 16S rRNA gene sequences using the maximum-likelihood algorithmGenBank accession numbers are shown in parentheses. Bar, 0.1 substitutions per nucleotide position. Branch 1 represented 18A01, 18E05, 18S01, 81A02,81E07-1, 199A01, 301A01, 334E05, 334M01, 334S02, 334S04, 392A01, 392E02, 475E05, and Alcanivorax xenomutans JC109T (HE601937).

2.3 基于16S rRNA 基因高通量測(cè)序分析的微生物多樣性

所有樣品的測(cè)序深度指數(shù)（Good’s Coverage）覆蓋范圍在0.999 1 至0.999 9 之間，表明測(cè)得的序列代表了研究樣品中的絕大多數(shù)微生物類(lèi)群。所有樣品的菌群豐富度指數(shù)（Chao）、多樣性指數(shù)（Shannon和Simpson）以及發(fā)育樹(shù)譜系多樣性指數(shù)（PD whole tree）見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)，18 cmbsf 的樣品表現(xiàn)出最大Chao值，為461.62，而475 cmbsf 的樣品，其Chao 值在所有樣品中最低，為165.09。樣品的Shannon 和Simpson指數(shù)范圍分別為2.13～5.46 和0.50～0.91，它們的最大值出現(xiàn)在100 cmbsf 的樣品中，最小值出現(xiàn)在380 cmbsf 的樣品中。結(jié)合PD whole tree 指數(shù)分析，不難發(fā)現(xiàn)淺層的樣品體現(xiàn)出更大的微生物多樣性，且隨著樣品深度的增加，沉積物樣品中微生物的多樣性呈現(xiàn)出減少的趨勢(shì)。

物種聚類(lèi)分析結(jié)果顯示（圖4），在門(mén)水平上，所有樣品中Proteobacteria 均占據(jù)了主要的微生物類(lèi)群，其占比69.0%～95.4%。Proteobacteria 的最大豐度出現(xiàn)在380 cmbsf 的層位，而最小豐度出現(xiàn)在100 cmbsf 的層位樣品中。樣品中檢測(cè)到的其他主要門(mén)類(lèi)還有Bacteroidota 和Bacillota，但它們的相對(duì)豐度在所有樣品中均小于12%。Bacteroidota 的相對(duì)豐度呈現(xiàn)出隨著沉積物深度增加而不斷減小的趨勢(shì)，尤其在240～248 cmbsf 的層位處表現(xiàn)為斷崖式的下降，由240 cmbsf 處的7.3%下降到248 cmbsf 處的2.4%。在綱水平上，Proteobacteria 主要分為兩個(gè)主要類(lèi)群，其分別為Alphaproteobacteria 和Gammaproteobacteria，且它們?cè)诓煌瑢游坏臉悠分蟹植疾槐M相同；在淺層次（18～110 cmbsf）的沉積物中Alphaproteobacteria 比Gammaproteobacteria 更多，而隨著沉積物深度的增加，Gammaproteobacteria 相對(duì)豐度有明顯的增加（從18 cmbsf 處的9.0%增加到＞248 cmbsf處的55.7%～73.3%），同時(shí)Alphaproteobacteria 明顯減少（從18 cmbsf 處的63.5%減少到＞248 cmbsf 處的18.3%～32.2%），這個(gè)現(xiàn)象在240～248 cmbsf界面也表現(xiàn)得尤為突出，分析數(shù)值顯示240 cmbsf處Alphaproteobacteria 和Gammaproteobacteria 相對(duì)豐度分別為21.0%和45.9%， 而248 cmbsf 處的Alphaproteobacteria 和Gammaproteobacteria 相對(duì)豐度分別為71.4%和20.3%。在目水平上，屬于Alphaproteobacteria 的未培養(yǎng)類(lèi)群的SAR11 分支和屬于 Gammaproteobacteria 的 Ectothiorhodospirales（外硫紅螺旋菌目）分別占據(jù)了主導(dǎo)地位，在不同層位的沉積物樣品中，它們的豐度變化主導(dǎo)了更高級(jí)分類(lèi)單元上物種相對(duì)豐度的變化。在科水平上，可以看出高豐度水平的 Alphaproteobacteria 和Gammaproteobacteria 實(shí)際上是由高比例的SAR11-Clade I 和Thioalkalispiraceae（硫堿螺旋菌科）引起的。此外，科水平的細(xì)菌組成隨著沉積物深度的不同體現(xiàn)出更高的多樣性，比如屬于Campylobaterota（ 彎曲菌門(mén)） 的Sulfurvaceae 相對(duì)豐度在淺層（18～110 cmbsf）的沉積物中隨著深度而增加，而在248 cmbsf 的層位及更深層處又急劇減少；在100 cmbsf 層位處的樣品中，SAR11-Clade III 占據(jù)了整體群落比例的14.2%，而其他層位中SAR11-Clade III 的比例均小于1%；在475 cmbsf 層位的樣品中，除了Thioalkalispiraceae 以外，Pseudomonadaceae（假單胞菌科） 和Alcanivoracaceae 同樣成為構(gòu)成Gammaproteobacteria 的主要分類(lèi)單元，它們的相對(duì)豐度值分別達(dá)到了16.6%和7.6%，而在其他所有樣品中二者的占比均低于5%。

圖4 基于科水平的物種聚類(lèi)顯示的樣品中不同細(xì)菌所占的比例Fig.4 Relative abundance of bacteria in the samples on family level

為了更好地闡明不同微生物類(lèi)群在不同生境之間的分布規(guī)律及差異性，以16S rRNA 基因序列測(cè)序獲得的相對(duì)豐度值，通過(guò)Bary Curtis 矩陣法得到了PCoA 圖（圖5)；以科水平ANOVA 差異統(tǒng)計(jì)獲得的差異物種的相對(duì)豐度值繪制了聚類(lèi)熱圖（Cluster heatmap）（圖6）。結(jié)果表明，淺層（18～81 cmbsf）沉積物和深層沉積物（380～475 cmbsf）的樣品有著顯著的分布差異，而它們自身的微生物組成則是比較接近的。171～311 cmbsf 層位的樣品和上述兩者都有較明顯的差異，通過(guò)聚類(lèi)分析也能與淺層和深層的樣品區(qū)別開(kāi)來(lái)，自身形成一個(gè)較大的分支。在科水平上，深層沉積物尤其是475 cmbsf層位的樣品與其他樣品相比體現(xiàn)出了巨大的物種差異性。這些都說(shuō)明，盡管來(lái)自于同一個(gè)位點(diǎn)，微生物群落在垂直水平上的分布是有明顯差異的，同時(shí)也反映了沖繩海槽熱液區(qū)中的沉積物是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。

圖6 基于科水平差異物種相對(duì)豐度的樣本聚類(lèi)熱圖Fig.6 Cluster heatmap based on relative abundance of differential species at family level

2.4 微生物群落、環(huán)境因子和樣品間的關(guān)系

選取TC、TN、TOC、Cu、Zn、Pb 這6 個(gè)典型的環(huán)境因子，選取以科水平相對(duì)豐度前10 的微生物，通過(guò)RDA 分析展示了沖繩海槽南部熱液區(qū)附近柱狀沉積物中微生物群落分布、不同層位樣品以及環(huán)境因子三者之間的關(guān)系。根據(jù)圖7 發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境因子之間， 柱狀沉積物中的Cu、 Zn、 Pb、 TN 與TOC 呈現(xiàn)出正相關(guān)。而TOC 對(duì)研究樣品中微生物群落組成的影響最強(qiáng)，同時(shí)其他幾個(gè)環(huán)境因子對(duì)微生物的群落分布也具有顯著影響且影響力相當(dāng)。具體來(lái)說(shuō)，未培養(yǎng)的微生物類(lèi)群SAR11-Clade I 與TOC 含量，Thioalkalispiraceae 與TC 含量之間表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)；Sulfurovaceae 與TOC 等環(huán)境因子之間也表現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系；但是在較淺層樣品中相對(duì)豐度較高的Prevotellaceae（普雷沃氏菌科）、Muribaculaceae、Lachnospiraceae（毛螺旋菌科）等幾個(gè)類(lèi)群的豐富度與參與分析的環(huán)境因子之間表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)。從各層位樣品在圖中的分布還可以看出，淺層沉積物樣品和深層沉積物樣品分別分布在相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域，意味著深度接近的沉積物表征出相似的環(huán)境因子參數(shù)，其對(duì)微生物群落分布的影響程度也比較近似。

圖7 樣品、微生物種群及環(huán)境因子RDA 圖Fig.7 Redundancy analysis on the relationships between environmental factors and relative abundance at family level

3 討論

3.1 沉積物柱的元素地球化學(xué)特征

在本研究中結(jié)合前人的研究數(shù)據(jù)，166 cmbsf 和444 cmbsf 層位的沉積物樣品中Cu、Zn、Pb 元素富集，其含量明顯高于正常沉積物中的含量。具體來(lái)說(shuō)，在沉積物166 cmbsf 處，Cu、Zn 和Pb 的含量分別為73.7×10-6、356.0×10-6、160.0×10-6；在444 cmbsf處含量略有下降，分別為38.8×10-6、321.0×10-6、121.0×10-6，均明顯高于沖繩海槽中部非熱液區(qū)沉積物中的元素值（Cu 為23×10-6，Zn 為91×10-6，Pb 為18×10-6）[41]和沖繩海槽北端沉積物中的元素值[42]，指示其沉積物中除了有海槽正常沉積物之外，可能還有其他來(lái)源含金屬物質(zhì)組分的加入，且楊婭敏等[28]對(duì)該柱狀沉積物樣品的研究也表明，HOBAB4-S2 柱狀沉積物中存在熱液活動(dòng)事件的記錄。

Wang 等[18]研究沖繩海槽北部柱狀沉積物樣品的TC 含量，其均顯著高于南部表層沉積物樣品的TC 含量，而其TN 和TOC 含量則在所有沉積物樣品中無(wú)顯著差異，且與我們測(cè)得的數(shù)據(jù)結(jié)果一致。有研究報(bào)道，在富含有機(jī)質(zhì)的地區(qū)如秘魯海盆和秘魯海溝處，其沉積物的總有機(jī)碳（TOC）含量為2%～8%，而沖繩海槽的沉積物，其總有機(jī)碳的含量為0.66%～1.05%，比富有機(jī)質(zhì)的沉積物中有機(jī)碳的含量低很多[43]，表明研究區(qū)屬于貧有機(jī)質(zhì)的區(qū)域。同時(shí)根據(jù)前人的研究可以發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中細(xì)菌的群落組成結(jié)構(gòu)在不同TOC 含量的環(huán)境中表現(xiàn)出很大差異[18,44]，而本研究中，從圖7 可以看出沖繩海槽南部熱液區(qū)附近柱狀沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的最重要變量是TOC，跟之前的研究結(jié)果表現(xiàn)一致。同時(shí)，本研究的微生物群落結(jié)構(gòu)分析和RDA 分析中可以看出由SAR11-Clade I 主導(dǎo)的Alphaproteobacteria 類(lèi)群和由Thioalkalispiraceae 主導(dǎo)的Gammaproteobacteria整體上來(lái)看與TOC 和TC 含量都有一定的正相關(guān)關(guān)系。但是由于TOC 對(duì)Alphaproteobacteria 的影響程度大于Gammaproteobacteria，而TC 對(duì)Gammaproteobacteria 的影響程度大于Alphaproteobacteria，造成了從淺層到深層 Gammaproteobacteria 增多而Alphaproteobacteria 減少的趨勢(shì)，這與Teske[45]之前對(duì)海洋沉積物中微生物的調(diào)查研究結(jié)果相近。因此，柱狀沉積物中的TOC 和TC 含量會(huì)對(duì)該區(qū)域微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)特征產(chǎn)生重要的影響。盡管其中原因和涉及的微生物代謝機(jī)制可能很復(fù)雜且需要進(jìn)一步的深入研究，但我們很容易得出這樣的推測(cè)：TC 和TOC 作為微生物重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量來(lái)源，微生物的代謝過(guò)程會(huì)因其所處環(huán)境中的含量不同而產(chǎn)生一定的偏好性，從而引起主導(dǎo)微生物類(lèi)群的差異。

3.2 沉積物柱中的微生物多樣性

在我們利用純培養(yǎng)手段分離的64 個(gè)菌株中，Proteobacteria 在門(mén)分類(lèi)水平上最豐富。據(jù)報(bào)道Proteobacteria 通常作為常見(jiàn)的棲息菌群存在于不同的熱液環(huán)境中， 比如 Perez Rodriguez 等和Rajasabapathy 等[46-47]分別在不同熱液區(qū)分離鑒定到了大量的Gammaproteobacteria。同時(shí)，有研究表明一些屬于Proteobacteria 的Alcanivorax、Thalassospira、Halomonas、Paracoccus可能參與到產(chǎn)酸或產(chǎn)堿的硫氧化過(guò)程[11]，本研究分離的菌株中也有相當(dāng)?shù)谋壤龑儆谶@些屬，而這些屬的菌株在其他熱液環(huán)境中也曾分離到[47-48]。另外有研究表明，屬于Gammaproteobacteria 的Marinobacter和Pseudoalteromonas的微生物類(lèi)群在很大程度上參與了金屬氧化[49]，沖繩海槽中部熱液區(qū)的沉積物中也分離到了大量的Marinobacter和Pseudoalteromonas屬的菌株，但是遺憾的是本研究并沒(méi)有分離到這兩個(gè)屬的菌株，盡管高通量測(cè)序數(shù)據(jù)表明它們?cè)跇悠分惺谴嬖诘摹３薖roteobacteria 之外，Bacillota 是分離得到菌株中第二大門(mén)類(lèi)的類(lèi)群，這類(lèi)細(xì)菌由于其獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理抗逆性可以耐受的溫度范圍很廣，以不同的表型存在于不同的熱液環(huán)境中[50]。研究人員曾從卡斯特羅海山熱液區(qū)分離了15 種屬于Bacillus的菌株，而鐵錳等金屬元素對(duì)它們的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用[51]，同時(shí)分離自Guaymas 盆地的一些屬于Bacillus的菌株參與了銅介導(dǎo)的錳氧化過(guò)程[52]。因此，我們推測(cè)本研究樣品分離的屬于Bacillota 的菌株也可能參與了周邊生態(tài)系統(tǒng)中的金屬氧化過(guò)程。

基于16S rDNA 高通量測(cè)序的微生物組成分析顯示，本研究中沉積物樣品中的微生物組成在門(mén)水平上，Proteobacteria 占據(jù)絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)地位。在這個(gè)門(mén)中，Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria 是兩個(gè)主要的類(lèi)群，這一結(jié)果與沖繩海槽中部Iheya North 和Iheya Ridge 熱液區(qū)以及太平洋富含金屬的熱液噴口附近沉積物中微生物組成的報(bào)道類(lèi)似[21,53-55]。先前的研究表明Epsilonproteobacteria（ε-變形菌綱）在與熱液噴口流體和煙囪結(jié)構(gòu)相關(guān)的微生物棲息地中占主導(dǎo)地位，同時(shí)也是從活躍的熱液噴口中鑒定出的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，在碳、硫的循環(huán)中發(fā)揮重要作用[56-57]，而且在沖繩海槽的部分熱液噴口處也發(fā)現(xiàn)Epsilonproteobacteria 占據(jù)了一定豐度比例[16,18-20]。然而，在本研究的樣品中Epsilonproteobacteria 的豐度是極低的。另一方面，關(guān)于沖繩海槽非熱液區(qū)沉積物中微生物的群落研究表明， Deltaproteobacteria（δ-變形菌綱）和Chloroflexi（綠彎菌門(mén)）通常為主要類(lèi)群[18,58]，而Deltaproteobacteria 和Chloroflexi的相對(duì)豐度在本研究的樣品中也是非常低的（＜1%）。通過(guò)綜合比較，我們發(fā)現(xiàn)盡管在海洋熱液區(qū)沉積環(huán)境中，Proteobacteria 通常作為主導(dǎo)的微生物類(lèi)群，但是上述的研究?jī)?nèi)容支持了這樣一種假設(shè)，由于海底熱液的活躍程度不同以及與熱液噴口的距離不同，不同位點(diǎn)的沉積物樣品中微生物組成受熱液活動(dòng)的影響程度不同，從而造成了其微生物主要類(lèi)群的差異。比如Epsilonproteobacteria 看起來(lái)更喜歡活躍的熱液噴口流體和煙囪體周?chē)母邷丨h(huán)境； Alphaproteobacteria 和 Gammaproteobacteria更喜歡不活躍的熱液棲息地。進(jìn)一步推測(cè)可以看出，HOBAB4-S2 柱狀沉積物樣品由于其具有高豐度的Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria 和低豐度的Epsilonproteobacteria，與沖繩海槽活躍的熱液噴口和非熱液區(qū)沉積物中微生物群落均有較大差異，表明盡管該位點(diǎn)附近的熱液噴口可能是不活躍的，但是其沉積物中微生物群落組成還是受周邊熱液活動(dòng)影響的。

3.3 柱狀沉積物中微生物多樣性的影響因素

由于熱帶西太平洋地理位置和水文條件的特殊，細(xì)菌群落的多樣性很容易受到洋流的影響[59]，這是一個(gè)非常復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的過(guò)程，主要涉及到沉積物的來(lái)源、鹽度、有機(jī)質(zhì)的生物利用率、pH 以及其他的地球化學(xué)和物理化學(xué)因素[60]。本研究的區(qū)域位于沖繩海槽南部熱液區(qū)附近，其沉積和物質(zhì)輸運(yùn)除了受熱液活動(dòng)影響，也在一定程度上受洋流[61]因素的影響。冗余分析結(jié)果顯示相比于其他測(cè)定的環(huán)境因子，柱狀沉積物中TOC、Zn 和Pb 的含量與微生物的群落組成有著更為密切的關(guān)系，因此環(huán)境特征對(duì)于特定環(huán)境下微生物的群落結(jié)構(gòu)具有非常重要的影響。從我們研究的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，微生物的群落結(jié)構(gòu)隨沉積物深度的不同而不同，這可能是地球化學(xué)環(huán)境的一個(gè)反映，也可能決定了微生物的種類(lèi)、數(shù)量和多樣性分布。另外，不同的沉積事件、沉積過(guò)程也可能形成不同的微生物群落。因此推測(cè)微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成在一定程度上跟沉積事件的干擾和熱液活動(dòng)事件有關(guān)，而這一點(diǎn)在西菲律賓海盆和西太平洋暖池的研究中已經(jīng)證實(shí)[59,62-63]。

4 結(jié)論

（1）沖繩海槽南部HOBAB4-S2 柱狀沉積物主要由SiO2、Al2O3、Fe2O3等組成，這3 種組分含量為3.8%～69.3%。該位點(diǎn)的沉積物有機(jī)質(zhì)含量較為貧乏，同時(shí)有兩個(gè)富含Cu-Zn-Pb 的層。

（2）利用HOBAB4-S2 柱狀沉積物，通過(guò)分離培養(yǎng)得到純菌株64 株，Proteobacteria 約占總數(shù)的59%?；?6S rRNA 基因高通量測(cè)序的結(jié)果同樣表明，在所有沉積物層位中變形菌門(mén)為占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的類(lèi)群，這種現(xiàn)象在更深層（＞240 cmbsf）的沉積物中表現(xiàn)的更為明顯；相對(duì)于深層的沉積物，表層沉積物表現(xiàn)出更高的微生物多樣性。通過(guò)比較可培養(yǎng)和免培養(yǎng)方法獲得的不同微生物群落多樣性表明，該位點(diǎn)沉積物中存在大量有活力但不可培養(yǎng)的微生物。

（3）相比于其他測(cè)定的環(huán)境因子，柱狀沉積物的TOC 含量與其微生物的群落組成有著更為密切的關(guān)系。

總的來(lái)說(shuō)，本研究揭示了沖繩海槽南部熱液區(qū)附近沉積環(huán)境中細(xì)菌的多樣性和垂直分布特征，為微生物的群落結(jié)構(gòu)及其與地質(zhì)沉積過(guò)程的相關(guān)性提供了證據(jù)。隨著現(xiàn)代分離培養(yǎng)技術(shù)和組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)個(gè)性化分離培養(yǎng)手段培養(yǎng)難培養(yǎng)的微生物并從分子水平上開(kāi)展研究，同時(shí)結(jié)合高通量測(cè)序的組學(xué)分析，將有助于進(jìn)一步地理解海底熱液環(huán)境中微生物的代謝機(jī)制及其與環(huán)境的協(xié)同演化過(guò)程以及它們?cè)谌蛭镔|(zhì)循環(huán)過(guò)程中的作用。